BHK21
3.3.2.1. Hồi phục tế bào BHK21 từ nguồn giống bảo quản ở tủ õm sõu
- Giống tế bào BHK21 ủược giữ tại Bộ mụn Virus, Trung tõm Chẩn ủoỏn Thỳ y TƯ.
- Cỏc bước tiến hành hồi phục tế bào BHK21:
+ Bước 1: Giải ủụng: Lấy 1 ống tế bào ra khỏi tủ õm sõu (-800C), cho vào cốc nước sạch và ủểở nhiệt ủộ phũng, quan sỏt ủến khi ống tế bào chuyển màu và tan ủụng.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………32
+ Bước 2: Cõn bằng mụi trường: Thờm 1ml mụi trường ủầy ủủ (10% FCS) (ủó làm ấm ở 37oC trước khi giải ủụng tế bào) vào ống tế bào. Nhẹ nhàng dựng pipette chuyển huyễn dịch tế bào sang ống ly tõm 15ml.
+ Bước 3: Ly tõm loại bỏ dung dịch bảo quản: Ly tõm 700 vũng/phỳt trong 5 phỳt, dựng pipette loại bỏ phần dung dịch ở trờn (giữ lại cặn tế bào màu trắng).
+ Bước 4: Hoà tan trong mụi trường nuụi cấy tế bào: Thờm vào ống 1-2 ml mụi trường ủầy ủủ (10% FCS), sau ủú nhẹ nhàng dựng pipette hoà tan tế bào. + Bước 5: Cấy tế bào vào chai nuụi (T25): Chuyển huyễn dịch trờn sang chai nuụi cấy tế bào T25 ( ủỏy 25 cm2) ủó cú sẵn 4-5 ml mụi trường ủầy ủủ (10% FCS). Ghi tờn tế bào, ngày, giờ nuụi.
+ Bước 6: Theo dừi tế bào phỏt triển: Giữ ở 37oC, 5% CO2. Quan sỏt tế bào phỏt triển trờn kớnh hiển vi ủến khi ủạt mật ủộ cần thiết.
3.3.2.2. Nuụi trờn ủĩa nhựa 6 giếng và 24 giếng
+ Loại bỏ mụi trường cũ. Trỏng chai bằng dung dịch PBS (-) hoặc bằng Trypsin: 0,1- 0,2 ml/cm2.
+ Cho 0,1 ml/cm2 trypsin vào chai, ủể từ 3-5 phỳt hoặc trong tủấm 37oC (nếu nhiệt ủộ thấp).
+ Sau khi tế bào bong ra bổ sung ngay từ 5-7 ml mụi trường cú chứa huyết thanh, vỗ vào thành chai.
+ Dựng pipette làm tan cỏc tế bào, sau ủú hỳt hết tế bào vào ống ly tõm 15ml và ly tõm ở 700 vũng/phỳt trong 5 phỳt.
+ Ly tõm xong, bỏ dịch nổi phớa trờn, lấy cặn tế bào.
+ Hoà tan cặn tế bào trong 2-3 ml mụi trường ủầy ủủ, pipette ủể tỏch rời tế
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………33
+ Bổ sung mụi trường ủầy ủủ tới lượng cần thiết. Dựng pipette 10ml hỳt mụi trường cú chứa tế bào ở trờn và cho vào cỏc giếng của ủĩa nuụi cấy ủược xếp theo bố trớ thớ nghiệm: 3ml/giếng (ủối với ủĩa 6 giếng), 1ml/giếng (ủối với ủĩa 24 giếng).
+ Ghi tờn tế bào nuụi, ngày, giờ, nồng ủộ pha loóng… trờn cỏc ủĩa.
+ Theo dừi tế bào phỏt triển: Giữở 37oC, 5% CO2. Quan sỏt sự phỏt triển của tế bào trờn kớnh hiển vi ủến khi ủạt mật ủộ cần thiết.
3.3.2.3. Phõn lập virus LMLM trờn tế bào BHK21
Xử lý bệnh phẩm
Mẫu bệnh phẩm là biểu mụ của mụn nước ủược nghiền trong cối chày sứ với dung dịch PBS 0,04M tỷ lệ 1:10. Ly tõm huyễn dịch bệnh phẩm 2.000 vũng/10 phỳt. Lấy dịch nước trong ở trờn, xử lý khỏng sinh.
Phõn lập trờn mụi trường tế bào BHK21
Chuyển 1ml huyễn dịch bệnh phẩm ủó ủược xử lý ở trờn vào chai tế
bào (T25) hoặc ủĩa 6 giếng, 0,5ml/ giếng với ủĩa 24 giếng.
- Ủ ở nhiệt ủộ 37oC/60 phỳt, sau cho dung dịch MEM (Eagle’s) khụng cú huyết thanh nuụi tiếp.
- Theo dừi hàng ngày kiểm tra bệnh lý tế bào (CPE: Cytopathic Effect): theo dừi ủến 96 giờ.
Nếu xuất hiện CPE: dương tớnh
Nếu sau 96 giờ khụng cú CPE xuất hiện: õm tớnh (khụng cú virus LMLM). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.3.3. Phương phỏp ELISA xỏc ủịnh type virus LMLM
3.3.3.1. Nguyờn lý
Khỏng nguyờn tương ứng sẽủược gắn với khỏng thểủặc hiệu cho từng type virus ủó ủược hấp phụ lờn bề mặt cỏc giếng của ủĩa phản ứng, khỏng thể
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………34
sẽủược gắn vào cỏc lỗ của ủĩa, mẫu khỏng nguyờn khụng tương ứng sẽ bị rửa trụi. Mẫu dương tớnh sẽ kết hợp với conjugate cú gắn enzyme, phản ứng chuyển màu sẽ xảy ra khi cú sự tham gia của chất xỳc tỏc Substrate/Chromogen.
3.3.3.2. Tiến hành
a. Sơủồủĩa
ðĩa xột nghiệm gồm 96 lỗ, ủược ủỏnh số hàng ngang theo thứ tự từ 1- 12 và theo hàng dọc từ A-H (08 hàng).
+ Theo hàng dọc: ủĩa ủược chia làm 2 phần từ A-D và từ E-H tương
ứng từng hàng với cỏc serotype O, A ,C , Asia 1. + Theo hàng ngang: Từ cột số 1- 4 là cỏc ủối chứng khỏng nguyờn (+) mạnh và cỏc khỏng nguyờn (+) yếu. Sơ ủồủĩa phản ứng ELISA phỏt hiện khỏng nguyờn (+) mạnh (+) yếu Blank Mẫu 1 Mẫu 3 Mẫu 5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 O A C Asia 1 O A C Asia 1 Mẫu 2 Mẫu 4 Mẫu 6
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………35
b. Sơủồ xột nghiệm
Phương phỏp ELISA ủể phỏt hiện khỏng nguyờn virus LMLM ủược tiến hành theo sơủồ sau:
Hấp thụ khỏng thể thỏ khỏng virus LMLM của cỏc serotype O, A, C, Asia1 ủược pha theo tỷ lệ 1:1000 với dung dịch gắn Carbonate/bicacbonate 50 àl/lỗ theo hàng tương ứng.
ủ 40C qua ủờm hoặc lắc 1 giờ ở 370C. Rửa 3 lần (dung dịch PBS 0,002 M) Thấm khụ.
Cho khỏng nguyờn ủối chứng (+) của từng type virus O, A, C, Asia 1 và cỏc huyễn dịch mẫu bệnh phẩm cần kiểm tra vào cỏc hàng tương ứng ủó gắn khỏng thể thỏ.
Lắc, ủở nhiệt ủộ 370C/1 giờ. Rửa 3 lần.
Thấm khụ.
Cho khỏng thể chuột lang khỏng virus LMLM của từng serotype O, A, C, Asia1 vào cỏc hàng tương ứng, 50 àl/ lỗ.
Lắc, ủở nhiệt ủộ 370C/1 giờ. Rửa 3 lần.
Thấm khụ.
Gắn Conjugate bằng dung dịch Buffer 1:200, cho 50 àl/ lỗ. Lắc, ủở nhiệt ủộ 370C/1 giờ. Rửa 3 lần.
Thấm khụ.
Cho Substrate/Chromogen lượng 50 àl/lỗ tham gia phản ứng và cột BLANK.
ðể nhiệt ủộ phũng 15 phỳt trong hộp tối Dừng phản ứng, cho H2SO4 1,25 M 50 àl/lỗ tham gia phản ứng và cột BLANK.
ðọc kết quả trờn mỏy ELISA, kớnh lọc 492 nm. Cỏc mẫu kiểm tra cú OD > 0,1 ủược coi là dương tớnh.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………36
3.3.4. Phương phỏp Real-time PCR phỏt hiện virus LMLM
3.3.4.1. Nguyờn lý của phản ứng Real-time PCR
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) ủược Kary Mullis và cộng sự (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
phỏt minh ra vào năm 1985. Kỹ thuật này tiếp tục ủược hoàn thiện, phỏt triển thụng qua sự phõn lập và sản xuất thành cụng emzyme tổng hợp DNA chịu nhiệt từ vi khuẩn Thermus aquaticus và sự thiết kế thành cụng cỏc mỏy chu kỳ nhiệt cho phộp thay ủổi nhanh chúng và chớnh xỏc nhiệt ủộ cho từng giai
ủoạn phản ứng. Kỹ thuật PCR cho phộp khuếch ủại một ủoạn gene ủặc hiệu. Trong PCR thụng thường, sau 20 – 30 vũng cú tới hàng triệu phõn tử ủược copy từ một phõn tử DNA (1 ủoạn gene), cú thể quan sỏt ủược trờn màn hỡnh mỏy tớnh sau từng chu kỳ.
RT-PCR: ðối với virus LMLM, trước khi tiến hành PCR thụng thường RNA của virus LMLM cần ủược chuyển thành cDNA nhờ enzyme Reverse Transcriptase. Phương phỏp PCR như vậy ủược gọi là RT-PCR. RT-PCR
ủược ỏp dụng rộng rói trong chẩn ủoỏn nhanh và ủịnh type virus LMLM. Phương phỏp PCR ủặc biệt cú ý nghĩa trong chẩn ủoỏn phõn biệt bệnh LMLM và bệnh mụn nước do virus LMLM ở lợn.
Nguyờn lý của phản ứng PCR: Dựa vào ủặc ủiểm sao chộp DNA; DNA Polymease sử dụng cỏc ủoạn DNA mạch ủơn làm khuụn mẫu ủể tổng hợp nờn sợi DNA bổ sung, bắt ủầu từ ủầu 3’OH của chuỗi oligo nucleotide (mồi hay primer)
Mồi là những ủoạn DNA ngắn (thường cú ủộ dài từ 6-30 nucleotide), cú khả năng bắt cặp bổ sung với một ủầu của DNA sợi khuụn. Sau ủú enzyme DNA-Polymerase sẽ cú chức năng kộo dài mồi ủể tạo thành sợi DNA mới. Tuy nhiờn, ủể khuếch ủại một trỡnh tự DNA xỏc ủịnh thỡ ta phải cú ủược thụng tin về trỡnh tự gene của nú ủủủể tạo mồi chuyờn biệt. Mỗi cặp mồi gồm cú một mồi xuụi (forward primer) và một mồi ngược (reverse primer). Mồi càng dài khả năng tổng hợp mạch càng chớnh xỏc, mồi ngắn bắt cặp dễ nhưng kết quả kộm chớnh xỏc. Phải trỏnh cú sự bổ sung giữa hai mồi xuụi, ngược.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………37
Trong phản ứng PCR thỡ cả hai sợi DNA ủều ủược làm khuụn cho quỏ trỡnh tổng hợp nếu như mồi ủược cung cấp cho cả hai sợi. Cỏc ủoạn mồi sẽ
bắt cặp với hai ủầu của ủoạn DNA cần nhõn lờn sao cho sự tổng hợp DNA mới ủược bắt ủầu tại mỗi ủoạn mồi và kộo dài về phớa ủoạn mồi nằm trờn sợi bổ sung với nú. Như vậy sau mỗi một chu kỳ của phản ứng thỡ số bản sao DNA cần nhõn lờn tăng gấp ủụi và ủiểm khởi ủầu cho mồi bắt cặp lại xuất hiện trờn mỗi sợi DNA mới ủược tổng hợp. Kết quả cuối cựng của phản ứng PCR sau n chu kỳ ủược tớnh theo lý thuyết là 2n bản sao của phõn tử DNA mạch kộp.
3.3.4.2. Tiến hành
Giai ủoạn tỏch chiết RNA bằng Kit Qiagen RNeasy.
- Lắc mẫu bằng mỏy Vortex trong 5 giõy, ly tõm nhanh xuống bằng mỏy Spindown.
- Cho 600 àl dung dịch RLT ủó cú B-ME vào ống eppendorf 1,5 ml mới. Chuyển 200 àl mẫu vào trong ống này, lắc ủều trờn mỏy Vortex trong 15 giõy, ly tõm nhanh bằng mỏy Spindown ủể trỏnh dịch mẫu ủọng ở nắp ống.
- Cho 400 àl cồn ETOH 100% (ethanol), lắc mạnh bằng Vortex trong 15 giõy. Ly tõm mẫu ủó bị dung giải trong 1 phỳt ở tốc ủộ≥ 10.000 vũng/phỳt
ở nhiệt ủộ phũng.
- Chuyển tất cả dịch nổi chứa mẫu bị dung giải sang cột RNeasy Qiagen ủó ghi sẵn ký hiệu mẫu. Ly tõm 15 giõy ở tốc ủộ 10.000 vũng/phỳt ở
nhiệt ủộ phũng. Kiểm tra dịch mẫu ủó thấm qua cột lọc chưa. Lặp lại bước này cho ủến khi toàn bộ mẫu ủó qua cột lọc.
- Bổ sung 700 àl dung dịch rửa 1 (RW1 buffer) vào cột RNeasy Qiagen, ly tõm trong 15 giõy ở tốc ủộ ≥ 10.000 vũng/phỳt, thay ống thu mẫu mới (collection tube) vào cột lọc.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………38
- Cho 500 àl dung dịch RPE vào cột RNeasy và ly tõm trong 15 giõy ở
tốc ủộ≥ 10.000 vũng/phỳt, thay ống thu mẫu mới vào cột lọc.
- Lặp lại bước trờn một lần nữa với dung dịch rửa RPE buffer. Sau lần rửa cuối cựng thay ống thu mẫu mới loại 2 ml vào cột lọc.
- Ly tõm cột lọc trống khụng trong 2 phỳt ở tốc ủộ tối ủa (12.000 vũng/phỳt), bỏống thu mẫu.
- ðặt cột lọc vào ống eppendorf 1,5 ml mới ủó ủược ghi sẵn ký hiệu mẫu. Cho 50 àl Rnase free H2O vào cột lọc. Chỳ ý khụng ủược chạm ủầu pipette vào mặt thạch Silica trong cột lọc. Ủ ở nhiệt ủộ phũng trong ớt nhất 1 phỳt. Tỏch RNA bằng cỏch ly tõm cột trong 1 phỳt ở 10.000 vũng/phỳt. Bỏ
cột lọc RNeasy. Chuyển toàn bộ dung dịch RNA này sang một ống eppendorf 1,5 ml mới.
- Bảo quản mẫu RNA thu ủược ở -200C ủến khi sử dụng.
Phương phỏp real-time PCR: sử dụng primer của hóng Qiagen, Hàn Quốc chạy trờn mỏy real-time PCR Smart Cycler.
- Pha mẫu theo cụng thức pha ỏp dụng cho kit RT-PCR 1 bước của hóng Qiagen Nguyờn liệu Thể tớch (àl) H2O 10,5 5X Buffer 5,0 MgCl2 (25 mM) 1,2 dNTP 0,8 Enzyme mix 1,0 Primer forward (20 àM) 0,5 Primer reverse (20 àM) 0,5 Probe (6 àM) 0,5 Mẫu RNA 5,0 Tổng cộng 25,0
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………39
- ðưa hỗn dịch mẫu ủó pha vào trong mỏy chạy Real- time PCR Smart Cycler ủó ủược cài ủặt cỏc thụng số của chu trỡnh nhõn gene: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chu trỡnh nhõn gene:
Bước Chu kỳ Thời gian Nhiệt ủộ
15 phỳt 500C
Bước phiờn mó ngược 1 chu kỳ
2 phỳt 950C
Bước biến tớnh 10 giõy 950C
Bỏm của cặp mồi
40 chu kỳ
50 giõy 600C Cặp mồi của kit là:
Cặp mồi Chuỗi (5 – 3)- FAM
Prime forward AGATGCAGGARGACATGTCAA
Prime reverse TTGTACCAGGGYTTGGCYT
Probe AAACACGGACCCGACTTTAACCG
- ðọc kết quả:
+ Mẫu dương tớnh: Khi 35 ≥ Ct ≥ 20.
+ Mẫu õm tớnh: Khi khụng cú ủường cong ủồ thịủi lờn. + Mẫu nghi ngờ: Khi 40 ≥ Ct > 35.
3.3.5. Xử lý số liệu
Xử lý số liệu theo phương phỏp thống kờ sinh học, so sỏnh kết quả theo chương trỡnh excel 2007 trờn mỏy vi tớnh.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………40
PHẦN IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. CHẤT LƯỢNG MẪU BỆNH PHẨM NHẬN VÀ MẪU BỆNH PHẨM ðI LẤY TẠI TRUNG TÂM CHẨN ðOÁN THÚ Y TƯ PHẨM ðI LẤY TẠI TRUNG TÂM CHẨN ðOÁN THÚ Y TƯ
Trong xột nghiệm và chẩn ủoỏn, mẫu và mẫu bệnh phẩm là yếu tố ủầu tiờn quyết ủịnh ủến tớnh chớnh xỏc của kết quả. Nếu mẫu bệnh phẩm khụng
ủạt yờu cầu xột nghiệm thỡ sẽ khụng thực hiện ủược xột nghiệm ủú. Mẫu bệnh phẩm khi ủến ủược phũng xột nghiệm thỡ phải qua ba cụng ủoạn: Lấy mẫu, bảo quản mẫu và vận chuyển mẫu. Thực chất của quỏ trỡnh này là lấy mẫu, bảo quản tạm thời, vận chuyển ủến phũng xột nghiệm và bảo quản. Bảo quản cuối cựng là bảo quản ủể lưu mẫu. Ta cú thể bảo quản ở tủ lạnh õm -200C hoặc -800C. Mẫu bảo quản này cú thể dựng vào nhiều mục ủớch khỏc nhau.
Lấy mẫu bệnh phẩm: mẫu bệnh phẩm nờn ủược lấy từ những con vật
ủang trong giai ủoạn nung bệnh hoặc ủang phỏt bệnh, biểu hiện cỏc triệu chứng lõm sàng rừ ràng như sốt cao, hỡnh thành mụn loột ở miệng, lợi, nhai nhúp nhộp, chảy nước dói, sưng cỏc kẽ múng chõn, ăn uống, ủi ủứng khú khăn. Khi cỏc mụn nước vỡ ra cú dịch màu vàng nhạt, mụn nước vỡ ủú tạo thành cỏc vết loột. Cỏc loại mẫu bệnh phẩm thường ủược lấy là biểu mụ từ
mụn nước chưa vỡ hoặc mới vỡ, dịch từ mụn nước chưa vỡ, mỏu, huyết thanh, sữa, dịch hầu họng. Khi lấy mẫu bệnh phẩm dựng trong chẩn ủoỏn núi chung và chẩn ủoỏn virus LMLM núi riờng, người lấy mẫu cần lưu ý tuyệt ủối khụng dựng cỏc loại dung dịch sỏt trựng vị trớ lấy mẫu hoặc mẫu bệnh phẩm, nếu cần thiết chỉ nờn dựng nước sinh lý ủể rửa. Sau khi lấy mẫu bệnh phẩm, cần phải bảo quản mẫu ủỳng phương phỏp. Tựy từng loại bệnh phẩm mà cần hay khụng cần dung dịch bảo quản, khối lượng, thể tớch mẫu bệnh phẩm là bao nhiờu. ðối với bệnh phẩm là dịch từ cỏc mụn nước, mỏu, sữa thỡ khụng
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………41
cần dung dịch bảo quản, dựng bơm tiờm vụ trựng hỳt ớt nhất 2 ml dịch mụn nước, sữa rồi cho vào lọ ủựng mẫu vụ trựng. ðối với bệnh phẩm là biểu mụ,
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});