4.5.1. Chi phớ xột nghiệm cho một mẫu bệnh phầm LMLM bằng phương phỏp ELISA
Kết quả tớnh chi phớ xột nghiệm bệnh phẩm nghi bệnh LMLM bằng phương phỏp ELISA ủược thể hiện ở bảng 4.10. Qua bảng 4.10 chỳng tụi thấy, giỏ xột nghiệm phỏt hiện, ủịnh type virus LMLM bằng phương phỏp ELISA là 399 nghỡn ủồng cho một mẫu bệnh phẩm. Ngoài cỏc thiết bị, dụng cụ, mỏy múc thụng thường trong phũng thớ nghiệm như tủ ấm, mỏy lắc, tủ
lạnh thường, tủ õm 200C, tủ õm 800C, cỏc loại pipette ủơn, ủa kờnh, mỏy ủọc ELISAẦ thỡ kỹ thuật này cần cú cỏc nguyờn liệu tiờu hao, sử dụng 1 lần. Cỏc nguyờn liệu dựng cho phương phỏp này cũng khỏ ủắt, ngoại trừ nước khử ion thỡ phần lớn cỏc nguyờn liệu dựng trong kỹ thuật này ủều phải mua từ nước ngoài, nhập khẩu về Việt Nam qua cỏc Cụng ty phõn phối. Giỏ cho một bộ kit
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ẦẦẦ61
nhập từ phũng thớ nghiệm tham chiếu về LMLM Pirbright, Vương Quốc Anh là 140 triệu ủồng. Mỗi bộ kit này xột nghiệm ủược 360 mẫu bệnh phẩm. Cỏc nguyờn liệu khỏc cũng ủều là dụng cụ sử dụng một lần. đắt nhất trong số cỏc nguyờn liệu ủú là ống falcon loại 15 ml, chi phớ cho nguyờn liệu này cho cả
bộ kit là 2,4 triệu ủồng.
Bảng 4.10: Chi phớ xột nghiệm cho một mẫu bệnh phẩm LMLM bằng phương phỏp ELISA
STT Nguyờn liệu, húa chất lượng Số đơn vị đơn giỏ (ủ) tiền (ủ) Thành
1 Giỏ tiphỏt hiền mện khỏng nguyờn ột bộ kớt ELISA FMD cho 360 mẫu 1 bộ 140.000.000 140.000.000 2 đầu tip vụ trựng 1000 àl 400 cỏi 500 200.000 3 đầu tip vụ trựng 200 àl 2.130 cỏi 300 639.000 4 Ống falcon 15 ml 400 cỏi 6.000 2.400.000 5 Ống eppendorf 1,5 ml 400 cỏi 450 180.000
6 Húa chất pha dung dịch
ủệm 100.000
7 Găng tay 60 ủụi 1.900 114.000
8 Nước khử ion 3.000 ml 3 9.000
Giỏ một mẫu xột nghiệm (ủồng) 399.000
Giỏ 1 mẫu xột nghiệm = chi phớ xột nghiệm cả bộ kit/360 mẫu. (nguồn: phũng tài chớnh kế toỏn, TTCđTYTƯ).
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ẦẦẦ62
4.5.2. Chi phớ xột nghiệm cho một mẫu bệnh phầm LMLM bằng phương phỏp Real-time PCR phỏp Real-time PCR
Bảng 4.11: Chi phớ xột nghiệm cho một mẫu bệnh phẩm LMLM bằng phương phỏp Real-time PCR
STT Nguyờn liệu, húa chất Số
lượng đơn vị đơn giỏ (ủ) Thành tiền (ủ) 1 đầu tip cú lọc 1000 àl 6 Cỏi 2.300 13.800 2 đầu tip cú lọc 200 àl 7 Cỏi 2.000 14.000 3 đầu tip cú lọc 30 àl 6 Cỏi 2.300 13.800
4 Ống eppendorf free RNA 3 Cỏi 800 2.400
5 Lọ lưu mẫu (30 ml) 1 lọ 2.000 2.000 6 PBS 5 ml 200 1.000 7 Kớt chiết tỏch Rneasy (loại 250 mẫu) 1 mẫu 98.000 98.000 8 H2O free RNA 10 ml 1.600 16.000 9 Ethanol 100% 10 ml 380 3.800 10 Beta-Mercaptoehanol 2 àl 2.600 5.200
11 Kit nhõn gene Qiagen One-step
(loại 100 mẫu) 3 mẫu 126.000 378.000
12 Primer FMDV 3 àl 200 600
13 Probe 3 àl 1.000 3.000
14 MgCl2 4 àl 900 3.600
15 Ống Smart cycler 3 Cỏi 22.000 66.000
Giỏ một mẫu xột nghiệm (ủồng) 662.000
Ghi chỳ: Giỏ 1mẫu xột nghiệm = tổng chớ phớ nguyờn vật liệu cho 1mẫu*10% (hao hụt + ủiện nước).
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ẦẦẦ63 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cũng như kỹ thuật ELISA, cỏc nguyờn liệu dựng cho kỹ thuật real-time PCR ủều phải nhập khẩu từ nước ngoài, nờn giỏ thành rất ủắt. Yờu cầu chất lượng ủối với cỏc nguyờn liệu dựng cho kỹ thuật real-time PCR ủũi hỏi cao hơn. Tất cả cỏc nguyờn liệu dựng 1 lần như ủầu tớp, ống eppendorfẦ kể cả
nước ủều phải khụng cú RNA, DNA. Cỏc ủầu tớp dựng trong phản ứng cũng
ủược thiết kế cú tấm lọc ủể loại bỏ nguy cơ RNA, DNA tạp nhiễm từ bờn ngoài. Vỡ ủõy là kỹ thuật nhõn gene nờn bất cứ gene nào khụng phải từ mẫu chiết tỏch ra ủều là nguyờn nhõn dẫn ủến sai lệch kết quả chẩn ủoỏn, kể cả do thao tỏc kỹ thuật sai. Qua bảng 11 chỳng tụi thấy, giỏ cho một mẫu xột nghiệm phỏt hiện virus LMLM bằng kỹ thuật này là 662 nghỡn ủồng. Cú tới 15 loại nguyờn liệu, húa chất khỏc nhau ủược sử dụng cho 1 lần xột nghiệm bằng kỹ thuật này. Cỏc nguyờn liệu này cũng rất ủắt tiền, nờn chi phớ cho 1 mẫu xột nghiệm phỏt hiện virus LMLM bằng phương phỏp này cao. Nguyờn liệu ủắt tiền nhất là Kit nhõn gen Qiagen One-step với giỏ là 378 nghỡn ủồng cho 1 mẫu xột nghiệm. Kớt chiết tỏch Rneasy và ống Smart cycler cũng là 2 trong số những nguyờn liệu cú chi phớ tốn kộm, tương ứng là 98 nghỡn và 66 nghỡn ủồng cho 1 mẫu.
4.5.3. Chi phớ xột nghiệm cho một mẫu bệnh phầm LMLM bằng phương phỏp phõn lập trờn tế bào BHK21 phỏp phõn lập trờn tế bào BHK21
Kết quả thống kờ chi phớ cho nguyờn vật liệu, húa chất dựng cho xột nghiệm mẫu bệnh phẩm LMLM bằng phương phỏp phõn lập trờn mụi trường tế bào ủược trỡnh bày ở bảng 4.12.
Qua bảng 4.12 chỳng tụi thấy, chi phớ cho xột nghiệm 1 mẫu bệnh phẩm nghi LMLM là 171 nghỡn ủồng. Cỏc nguyờn vật liệu dựng cho phương phỏp này cũng khỏ ủắt tiền. Chai dựng ủể nuụi cấy tế bào cũng ủắt tiền, chai loại 75 cm2 và 25 cm2 cú giỏ lần lượt là 45 nghỡn và 25 nghỡn ủồng. Cỏc loại tờ bào dũng núi chung và tế bào BHK 21 núi riờng ủều rất khú tớnh khi nuụi cấy, nếu gặp bất cứ một nguyờn nhõn bất lợi nào dự nhỏ nhất cũng ủều làm chết tế bào. Vớ dụ pH của mụi trường quỏ nghiờng về axit hoặc kiềm. Mụi trường nuụi tế
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ẦẦẦ64
cỏc loại thành phần dinh dưỡng cần thiết cho quỏ trỡnh sinh trưởng và phỏt triển của tế bào như axit amin, ủường, vitamin, huyết thanhẦ do ủú nú cũng là ủiều kiện rất thuận lợi cho cỏc loại vi khuẩn, nấm phỏt triển làm chết tế
bào. Chớnh vỡ vậy ngoài thao tỏc tốt thỡ nguyờn liệu dựng cho phương phỏp này cũng phải ủảm bảo sạch, vụ trựng.
Bảng 4.12: Chi phớ xột nghiệm cho một mẫu bệnh phẩm LMLM bằng phương phỏp phõn lập trờn tế bào BHK21
STT Nguyờn liệu, húa chất lượng Số đơn vị giỏ (ủ) đơn tiền (ủ) Thành
1 đầu tip cú lọc 1000 àl 20 cỏi 2.300 46.000
2 đầu tip 1000 àl 3 Cỏi 500 1.500
3 đầu tip 5-5000 àl 22 cỏi 3.000 66.000
4 đầu tip cú lọc 200àl 20 cỏi 2.000 40.000
5 Ống eppendorf free RNA 28 Cỏi 800 22.400
6 PBS (-) 5 ml 3.360 16.800
7 đĩa tế bào 24 giếng 1 ủĩa 30.000 30.000
8 Tế bào BHK 21 1 ủĩa 100.000 100.000
9 Trypsin EDTA 4 ml 2.500 10.000
10 Chai tế bào T25 11 chiếc 25.000 275.000
11 Chai tế bào T75 11 chiếc 45.000 495.000
12 Mụi trường EMEM 300 ml 150 45.000
13 FCS (huyết thanh bào thai bờ) 15 ml 17.000 255.000
14 Nước khử ion 1.000 ml 3 3.000
15 Ống Falcon 50 ml 12 Cỏi 7.000 84.000
16 Ống Falcon 15 ml 11 Cỏi 6.000 66.000
Giỏ một mẫu xột nghiệm (ủồng) 171.000
Ghi chỳ: Giỏ 1mẫu xột nghiệm ={tổng chớ phớ nguyờn vật liệu cho 10 mẫu * 10% (hao hụt + ủiện nước)}/10.
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ẦẦẦ65 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
4.5.4. So sỏnh chi phớ giữa cỏc phương phỏp cho một mẫu xột nghiệm Bảng 4.13: So sỏnh chi phớ giữa cỏc phương phỏp Bảng 4.13: So sỏnh chi phớ giữa cỏc phương phỏp
cho một mẫu xột nghiệm
Phương phỏp ELISA Real-time PCR tế bào BHK21 Phõn lập trờn Chi phớ cho 1 mẫu
xột nghiệm (ủồng) 399.000 622.000 171.000
Trong chẩn ủoỏn xột nghiệm, ngoài yờu cầu chớnh xỏc, nhanh chúng thỡ giỏ thành cho một mẫu xột nghiệm cũng ủược quan tõm tới. Tựy vào mục
ủớch, yờu cầu của xột nghiệm mà ta nờn ưu tiờn chọn yếu tố nào trước. Chi phớ cho xột nghiệm 1 mẫu bệnh phẩm LMLM ủược tổng hợp tại bảng 4.13. Qua bảng 4.13 chỳng tụi thấy, chi phớ cho xột nghiệm bằng kỹ thuật ELISA là 399 nghỡn ủồng, real-time PCR là 662 nghỡn ủồng và phõn lập virus trờn tế bào BHK21 là 171 nghỡn ủồng. Như vậy, phương phỏp real-time PCR cú chi phớ cao nhất, tiếp theo ủú là ELISA, sau cựng là phõn lập trờn mụi trường tế bào. Chi phớ xột nghiệm cho 1 mẫu bệnh phẩm LMLM bằng phương phỏp real- time PCR cao gấp 3,6 lần so với phương phỏp phõn lập virus trờn mụi trường tế bào, gấp 1,6 lần so với phương phỏp ELISA. Mặc dự vậy nú vẫn ủược ỏp dụng trong cỏc phũng thớ nghiệm chẩn ủoỏn vỡ thời gian xột nghiệm của phương phỏp này là ngắn nhất.
Dựng phương phỏp real-time PCR và phõn lập trờn mụi trường tế bào, nếu muốn ủi ủến kết quả cuối cựng là ủịnh type virus, mẫu xột nghiệm sẽ phải làm tiếp phương phỏp ELISA hoặc RT-PCR. Trong phạm vi luận văn này, chỳng tụi khụng thực hiện phương phỏp RT-PCR vậy nếu ủịnh type tiếp bằng phương phỏp ELISA thỡ thời gian chẩn ủoỏn của phương phỏp real-time PCR sẽ là 8h ổ 65 phỳt, phương phỏp phõn lập trờn mụi trường tế bào sẽ là từ 2 ủến 5 ngày; chi phớ cho xột nghiệm bằng real-time PCR sẽ là 1.061 nghỡn ủồng và
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ẦẦẦ66
phõn lập trờn mụi trường tế bào sẽ là 570 nghỡn ủồng. Như vậy ủể ủi ủến kết quả cuối cựng trong chẩn ủoỏn virus LMLM là ủịnh type virus, phương phỏp ELISA là phương phỏp nhanh nhất, chi phớ ớt nhất; hai phương phỏp cũn lại thời gian và chi phớ xột nghiệm ủều cao hơn. Khụng những vậy khả năng phổ
biến của phương phỏp ELISA là dễ dàng hơn, trang thiết bị khụng quỏ phức tạp, dễủào tạo xột nghiệm viờn hơn.
4.6. NĂNG LỰC THỰC HIỆN CÁC PHƯƠNG PHÁP
Bảng 4.14: Năng lực thực hiện cỏc phương phỏp chẩn ủoỏn virus LMLM của một số ủơn vị
Phương phỏp chuyờn trỏch Cú người
đơn vị ELISA Real-time PCR Phõn lập trờn tế bào Cú Khụng TT Chẩn ủoỏn TYTW + + + + CQ TY Vựng 1 - - - + CQ TY Vựng 2 - - - + CQ TY Vựng 3 - - - + CQ TY Vựng 4 - - - + CQ TY Vựng 5 - - - + CQ TY Vựng 6 + + + + CQ TY Vựng 7 - - - +
(+): Cú ủầy ủủ trang thiết bị, người chuyờn trỏch, làm thường xuyờn (-): Thiếu trang thiết bị cần thiết, khụng làm.
Nhằm ủỏnh giỏ về khả năng thực hiện cỏc phương phỏp chẩn ủoỏn bệnh LMLM, chỳng tụi ủó tiến hành khảo sỏt năng lực thực hiện cỏc phương phỏp
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ẦẦẦ67
chẩn ủoỏn virus LMLM tại một số ủơn vị. Kết quả ủược trỡnh bày tại bảng 4.14. Qua bảng 4.14 chỳng tụi thấy, chỉ cú 2 ủơn vị cú khả năng làm ủược cả
3 phương phỏp chẩn ủoỏn phỏt hiện virus LMLM ủú là Trung tõm Chẩn ủoỏn Thỳ y TƯở miền bắc và Cơ quan Thỳ y vựng 6 ở miền nam. Hai cơ quan trờn
ủều cú người chuyờn trỏch ủảm nhiệm việc xột nghiệm cỏc mẫu bệnh phẩm LMLM. Trang thiết bị, nguyờn liệu cũng ủược ủầu tư hiện ủại, ủồng bộ cho phũng thớ nghiệm chẩn ủoỏn sử dụng cỏc phương phỏp trờn. Cũn cỏc phũng thớ nghiệm thuộc cỏc Cơ quan Thỳ y Vựng khỏc khụng thực hiện ủược. Nguyờn nhõn ởủõy là do tại cỏc phũng thớ nghiệm ủú hoặc họ khụng cú trang thiết bị, mỏy múc cần thiết, ủồng bộ hoặc khụng cú con người ủược ủào tạo chuyờn trỏch về lĩnh vực xột nghiệm này.
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ẦẦẦ68
PHẦN V
KẾT LUẬN VÀ đỀ NGHỊ
5.1. KẾT LUẬN
Từ những kết quả nghiờn cứu ủó trỡnh bày ở trờn, chỳng tụi rỳt ra một số kết luận sau:
- Chất lượng mẫu xột nghiệm là quan trọng. Kỹ thuật lấy mẫu, bảo quản mẫu, lượng mẫu ủược lấy là cỏc yếu tố quyết ủịnh ủến chất lượng.
- Trong ba phương phỏp trờn, hiện nay chỉ cú phương phỏp ELISA là cú thể
vừa phỏt hiện virus vừa ủịnh type virus LMLM.
- độ nhạy tương ủối của phương phỏp ELISA là 96,55%, phõn lập trờn mụi trường tế bào là 72,41% so với phương phỏp real-time PCR trong xột nghiệm phỏt hiện virus LMLM.
- Thời gian cú ủược kết quả của phương phỏp real-time PCR là nhanh nhất sau ủú ủến ELISA, cuối cựng là phõn lập virus trờn mụi trường tế bào. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Chi phớ cho một mẫu xột nghiệm phỏt hiện virus LMLM bằng phương phỏp real-time PCR là ủắt nhất.
- Cỏc cơ quan trực thuộc Cục Thỳ y, hiện chỉ cú Trung tõm Chẩn ủoỏn Thỳ y TƯ và Cơ quan Thỳ y vựng 6 là thực hiện chẩn ủoỏn phỏt hiện virus LMLM bằng cả ba phương phỏp trờn.
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ẦẦẦ69
5.2. đỀ NGHỊ
Từ cỏc kết luận trờn, chỳng tụi cú một sốủề nghị sau:
- Nờn tổ chức nhiều khúa tập huấn hơn nữa cho cỏc cỏn bộ thỳ y về phương phỏp lấy mẫu xột nghiệm núi chung và lấy mẫu dựng trong xột nghiệm chẩn
ủoỏn virus LMLM núi riờng.
- Áp dụng phương phỏp ELISA cho chẩn ủoỏn bệnh LMLM tại cỏc phũng thớ nghiệm chẩn ủoỏn bệnh LMLM tại Việt Nam.
- Trong phạm vi của ủề tài, chỳng tụi chưa làm ủược cả ba phương phỏp với dung lượng mẫu lớn, ủề nghị tiến hành phương phỏp này với dung lượng mẫu lớn hơn ủể cú ủược kết quảủộ nhạy chớnh xỏc hơn.
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ẦẦẦ70
TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Blancou J., Ozawa Yoshiro (1995), Bệnh lở mồm long múng ở đụng Nam Á- Tỡnh hỡnh và kế hoạch phũng chống (tài liệu do Thanh Thuận dịch), Tạp chớ KHKT Thỳ y, 2, 83-89.
2. Cụng ty Marial - Pirbright (2004), Tiờm chủng nhắc lại vacxin chế từ
khỏng nguyờn tinh khiết vụ hoạt ủậm ủặc khụng tạo khỏng thể khỏng protein khụng cấu trỳc của virus lở mồm long múng (tài liệu do Hoàng Thị
Xuõn Mai dịch), Tạp chớ KHKT Thỳ y, 10, 82-88.
3. Hồ đỡnh Chỳc, Ngụ Thanh Long (2003), Phỏt hiện trõu bũ nhiễm virus lở
mồm long múng bằng KIT ELISA CHEKIT- FMD- 3ABC, Tạp chớ KHKT Thỳ y, 10, 14-32.
4. Cục Thỳ y, Sổ tay phũng chống bệnh lở mồm long múng (2003), nhà Xuất Bản Nụng Nghiệp 1-90.
5. Cục Thỳ y (2005), Chương trỡnh Quốc Gia khống chế và thanh toỏn bệnh lở mồm long múng giai ủoạn 2006-2010, Tạp chớ KHKT Thỳ y 7, 1-51. 6. đào Trọng đạt (2000), Gúp phần vào việc ủấu tranh phũng chống bệnh lở
mồm long múng, Tạp chớ KHKT Thỳ y, 7, 6-7.
7. Doel T.R.(2003), ỘMiễn dịch lở mồm long múng tự nhiờn và do tiờm phũng, những triển vọng cải tiến vacxinỢ (tài liệu do Nguyễn Thiờn Dũng dịch), Tạp chớ KHKT Thỳ y, 10, 75-85.
8. Donalsson A.I. (2000), ỘBệnh lý học và dịch tễ học của bệnh lở mồm long múngỢ (tài liệu do Lờ Minh Hà dịch), Tạp chớ KHKT Thỳ y, 7, 43-47.
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ẦẦẦ71