Năm 2003, Hồ ðỡnh Chỳc và Ngụ Thanh Long ủó sử dụng kit ELISA CHECKIT - FMD- 3ABC ủể phỏt hiện trõu bũ nhiễm virus LMLM [3].
Năm 2004, Tụ Long Thành và cộng sự ủó phõn lập thành cụng virus LMLM trờn tế bào BHK21. Sử dụng kỹ thuật RT- PCR với cặp mồi chung 1F/1R ủặc hiệu cho 7 type của virus LMLM gõy bệnh LMLM và cặp mồi P33/P38 ủặc hiệu cho type O ủó ủược xỏc ủịnh virus LMLM phõn lập ủược là virus LMLM type O [27].
Năm 2005, Lờ Văn Phan và cộng sự ủó tỏch dũng và giải mó thành cụng
ủoạn mó hoỏ cho serotype O của virus LMLM gõy bệnh LMLM thu thập tại Quảng Trị [18].
Thỏng 10/2005, Nguyễn Viết Khụng và cộng sự ủó phỏt hiện type Asia1 của virus LMLM tại Khỏnh Hũa. Như vậy, ở Nha Trang ủược ghi nhận cú 3 type virus LMLM là O, A và Asia1 [10].
Năm 2006, Thỏi Thuỷ Phượng và Lờ Thanh Hoà ủó tỏch dũng, giải trỡnh tự và phõn tớch chuỗi gene từ cỏc mẫu bệnh phẩm từ bũ lai và lợn ðồng Thỏp
ủó phỏt hiện ra topotype khỏc biệt của virus LMLM [20].
Năm 2007, Thỏi Thủy Phượng, Lờ Thanh Hoà ủó ủịnh type virus LMLM trờn heo, bũ tại Tiền Giang và ðồng Thỏp qua sử dụng chỉ thị phõn tử gene khỏng nguyờn 1D- 2A- 2B (VP1-2A-2B) [21].
Như vậy ở nước ta hiện nay cú 3 serotype virus LMLM gõy bệnh LMLM O, A, Asia1. Virus LMLM serotype O cú 3 topotype: Topotype SAE (South- EAST), topotype Cathay, topotype ME-SA (Trong ủú topotype Cathay và topotype ME-SA là phổ biến nhất trong cỏc ổ dịch).
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………27
PHẦN III
ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, ðỊA ðIỂM, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
3.1. ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ ðỊA ðIỂM NGHIấN CỨU 3.1.1. ðối tượng nghiờn cứu
Gia sỳc nghi mắc bệnh LMLM, mẫu bệnh phẩm nghi cú virus LMLM.
3.1.2. Nội dung nghiờn cứu
- Nhận xột, ủỏnh giỏ chất lượng mẫu bệnh phẩm ủược gửi ủến Trung tõm Chẩn ủoỏn Thỳ y TƯ và mẫu bệnh phẩm do cỏn bộ Trung tõm ủi lấy.
- Chẩn ủoỏn phỏt hiện virus LMLM bằng phương phỏp ELISA.
- Chẩn ủoỏn phỏt hiện virus LMLM bằng phương phỏp Real-time PCR. - Chẩn ủoỏn phỏt hiện virus LMLM bằng phương phỏp phõn lập virus trờn tế
bào BHK21.
- Thu thập kết quả, ủỏnh giỏ, so sỏnh ủộ nhạy tương ủối, thời gian chẩn ủoỏn, chi phớ giữa cỏc phương phỏp dựa trờn kết quả ủạt ủược. Kiến nghị phương phỏp chẩn ủoỏn phỏt hiện virus tối ưu.
- Khảo sỏt năng lực thực hiện ba phương phỏp chẩn ủoỏn trờn tại một số ủơn vị.
3.1.3. ðịa ủiểm nghiờn cứu
- Một số tỉnh cú dịch.
- Trung tõm Chẩn ủoỏn Thỳ y TƯ.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………28
3.2. VẬT LIỆU NGHIấN CỨU 3.2.1. Mỏy múc
- Tủ lạnh õm - Tủ lạnh thường - Tủấm 37oC
- Mỏy lắc ủĩa (orbital shaker) - Mỏy lắc trộn (vortex mixer) - Nồi ủun cỏch thuỷ (water bath) - Mỏy ủọc ELISA với kớnh lọc 492 nm - Mỏy rửa ủĩa ELISA.
- Buồng cấy vụ trựng (BSC-Biosafety cabinet) - Mỏy ly tõm, mỏy ly tõm lạnh
- Mỏy real-time PCR Smart Cycler
3.2.2. Dụng cụ
- Bỡnh tam giỏc cỏc cỡ: 100, 200, 500 và 1000 ml
- Ống ủong thuỷ tinh cỏc cỡ: 50, 100, 200, 500 và 1000 ml - Cốc cú mỏ cỏc cỡ: 100, 200, 500 và 1000 ml
- Ống nghiệm
- Lọ nhỏ chắt huyết thanh
- Mỏng trộn chất phản ứng (reagent trough) - Pipette thuỷ tinh: 1, 5 và 10 ml
- Micropipette ủơn: 0,5-10, 5-40, 40-200, 200-1000 àl - Micropipette ủa kờnh (8-12): 5-50, 50-300 àl
- Bộ cối, chày sứ
- Cỏt sạch ủể nghiền bệnh phẩm - Khăn bụng
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………29
3.2.3. Hoỏ chất
- Nước cất hoặc nước khử ion - Water free RNA
- Dung dịch ủệm Phosphate/citrate
- Chất phỏt màu OPD (ortho-phenylenediamine) - Cơ chất (H2O2) - Viờn Carbonate/bicarbonate - ðỏ phenol 1% - Tween 20 - Axit citric - HCl - H2SO4 1,25M - Na2HPO4.2H2O - KH2PO4 - KCl - NaCl. - Ethanol 100% - Dung dịch TE - Dung dịch TAE 50X. - B-Mercaptoethanol 3.2.4. Nguyờn liệu
3.2.4.1. Bộ kit ELISA phỏt hiện khỏng nguyờn LMLM (Pirbright- Anh Quốc) 3.2.4.2. Bộ kit Qiagen và primer phỏt hiện khỏng nguyờn LMLM (Qiagen- Hàn Quốc)
3.2.4.3. Nguyờn liệu cho phõn lập tế bào
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………30
- Mụi trường cơ bản RPMI 1640, MEM (Minimum Essential Medium), MEM non essential amino acid solution 100x, MEM amino acid solution 50x, Foetal Bovine (Cafl) Serum, Dimethylsulfoxide (DMSO), L - Glutamine, Sodium pyruvate, Penicilline - Streptomycine, Amphotericin, Trypsin, Trypan blue, Hepes free acid, NaHCO3, PBS Ca2+, Mg2+ free, HCl 1N, NaOH 1N…
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
3.3.1. Phương phỏp lấy mẫu, bảo quản, vận chuyển bệnh phẩm phỏt hiện virus LMLM Mẫu bệnh phẩm ủể phỏt hiện bệnh và ủịnh type virus là cỏc mẫu biểu mụ, nơi cú bệnh tớch ở lợi, lưỡi, mộp, chõn, vỳ … ; dịch mụn nước lấy từ cỏc mụn nước chưa vỡở cỏc tổ chức trờn. Cỏch lấy: - Dựng panh, kộo cắt vựng cú bệnh tớch mới vỡ, lấy phần biểu mụ. Lượng biểu mụ lấy ớt nhất là 2 g cho vào lọ cú dung dịch bảo quản.
- Nếu mụn nước chưa vỡ cú thể dựng bơm tiờm 5 ml hỳt dịch bờn trong cho vào lọ ủựng bệnh phẩm sạch (khụng cú dung dịch bảo quản), lấy ớt nhất 2ml dịch mụn nước.
Bảo quản:
- Mẫu tổ chức biểu mụ sau khi lấy ủựng trong lọ thuỷ tinh dày, cú nỳt vặn kớn với dung dịch bảo quản ớt nhất là 20 ml. Phớa ngoài lọ ủựng bệnh phẩm phải ghi nhón về chủ gia sỳc, loại gia sỳc, loại bệnh phẩm, nơi lấy mẫu...
- Bờn ngoài lọủựng bệnh phẩm phải khử trựng.
- Lọ mẫu bệnh phẩm sau khi lấy nếu chưa kịp gửi ủến phũng xột nghiệm cần bảo quản ngay trong ngăn ủỏ tủ lạnh hoặc tủ lạnh õm.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………31
Vận chuyển:
Khi gửi mẫu cần quấn bụng thấm nước quanh lọ ủể chống vỡ và cho vào 2 lượt tỳi nilon bờn trong cú phiếu gửi bệnh phẩm, buộc kớn. Mẫu bệnh phẩm ủược ủể vào hộp giữ lạnh cú ủủủỏ trong quỏ trỡnh vận chuyển, ủậy nắp, gắn nhón bờn ngoài, ghi rừ tờn và ủịa chỉ nơi gửi và gửi nhanh ủến phũng chẩn ủoỏn xột nghiệm.
Ghi phiếu gửi bệnh phẩm (cần cú những thụng tin sau):
- Tờn và ủịa chỉ nơi gửi - Tờn và ủịa chỉ chủ gia sỳc
- Số lượng, loài, và giống gia sỳc mắc bệnh trờn tổng số
- Bệnh phẩm: loại bệnh phẩm, ngày lấy mẫu, ngày gửi mẫu - Tuổi của ủàn mắc bệnh
- Ngày mắc bệnh, mức ủộ lõy lan
- Lịch sử bệnh: ủó từng mắc bệnh hay ủó tiờm phũng, loại vacxin…
3.3.2. Phương phỏp nuụi cấy virus LMLM trờn mụi trường tế bào BHK21 BHK21
3.3.2.1. Hồi phục tế bào BHK21 từ nguồn giống bảo quản ở tủ õm sõu
- Giống tế bào BHK21 ủược giữ tại Bộ mụn Virus, Trung tõm Chẩn ủoỏn Thỳ y TƯ.
- Cỏc bước tiến hành hồi phục tế bào BHK21:
+ Bước 1: Giải ủụng: Lấy 1 ống tế bào ra khỏi tủ õm sõu (-800C), cho vào cốc nước sạch và ủểở nhiệt ủộ phũng, quan sỏt ủến khi ống tế bào chuyển màu và tan ủụng.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………32
+ Bước 2: Cõn bằng mụi trường: Thờm 1ml mụi trường ủầy ủủ (10% FCS) (ủó làm ấm ở 37oC trước khi giải ủụng tế bào) vào ống tế bào. Nhẹ nhàng dựng pipette chuyển huyễn dịch tế bào sang ống ly tõm 15ml.
+ Bước 3: Ly tõm loại bỏ dung dịch bảo quản: Ly tõm 700 vũng/phỳt trong 5 phỳt, dựng pipette loại bỏ phần dung dịch ở trờn (giữ lại cặn tế bào màu trắng).
+ Bước 4: Hoà tan trong mụi trường nuụi cấy tế bào: Thờm vào ống 1-2 ml mụi trường ủầy ủủ (10% FCS), sau ủú nhẹ nhàng dựng pipette hoà tan tế bào. + Bước 5: Cấy tế bào vào chai nuụi (T25): Chuyển huyễn dịch trờn sang chai nuụi cấy tế bào T25 ( ủỏy 25 cm2) ủó cú sẵn 4-5 ml mụi trường ủầy ủủ (10% FCS). Ghi tờn tế bào, ngày, giờ nuụi.
+ Bước 6: Theo dừi tế bào phỏt triển: Giữ ở 37oC, 5% CO2. Quan sỏt tế bào phỏt triển trờn kớnh hiển vi ủến khi ủạt mật ủộ cần thiết.
3.3.2.2. Nuụi trờn ủĩa nhựa 6 giếng và 24 giếng
+ Loại bỏ mụi trường cũ. Trỏng chai bằng dung dịch PBS (-) hoặc bằng Trypsin: 0,1- 0,2 ml/cm2.
+ Cho 0,1 ml/cm2 trypsin vào chai, ủể từ 3-5 phỳt hoặc trong tủấm 37oC (nếu nhiệt ủộ thấp).
+ Sau khi tế bào bong ra bổ sung ngay từ 5-7 ml mụi trường cú chứa huyết thanh, vỗ vào thành chai.
+ Dựng pipette làm tan cỏc tế bào, sau ủú hỳt hết tế bào vào ống ly tõm 15ml và ly tõm ở 700 vũng/phỳt trong 5 phỳt.
+ Ly tõm xong, bỏ dịch nổi phớa trờn, lấy cặn tế bào.
+ Hoà tan cặn tế bào trong 2-3 ml mụi trường ủầy ủủ, pipette ủể tỏch rời tế
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………33
+ Bổ sung mụi trường ủầy ủủ tới lượng cần thiết. Dựng pipette 10ml hỳt mụi trường cú chứa tế bào ở trờn và cho vào cỏc giếng của ủĩa nuụi cấy ủược xếp theo bố trớ thớ nghiệm: 3ml/giếng (ủối với ủĩa 6 giếng), 1ml/giếng (ủối với ủĩa 24 giếng).
+ Ghi tờn tế bào nuụi, ngày, giờ, nồng ủộ pha loóng… trờn cỏc ủĩa.
+ Theo dừi tế bào phỏt triển: Giữở 37oC, 5% CO2. Quan sỏt sự phỏt triển của tế bào trờn kớnh hiển vi ủến khi ủạt mật ủộ cần thiết.
3.3.2.3. Phõn lập virus LMLM trờn tế bào BHK21
Xử lý bệnh phẩm
Mẫu bệnh phẩm là biểu mụ của mụn nước ủược nghiền trong cối chày sứ với dung dịch PBS 0,04M tỷ lệ 1:10. Ly tõm huyễn dịch bệnh phẩm 2.000 vũng/10 phỳt. Lấy dịch nước trong ở trờn, xử lý khỏng sinh.
Phõn lập trờn mụi trường tế bào BHK21
Chuyển 1ml huyễn dịch bệnh phẩm ủó ủược xử lý ở trờn vào chai tế
bào (T25) hoặc ủĩa 6 giếng, 0,5ml/ giếng với ủĩa 24 giếng.
- Ủ ở nhiệt ủộ 37oC/60 phỳt, sau cho dung dịch MEM (Eagle’s) khụng cú huyết thanh nuụi tiếp.
- Theo dừi hàng ngày kiểm tra bệnh lý tế bào (CPE: Cytopathic Effect): theo dừi ủến 96 giờ.
Nếu xuất hiện CPE: dương tớnh
Nếu sau 96 giờ khụng cú CPE xuất hiện: õm tớnh (khụng cú virus LMLM).
3.3.3. Phương phỏp ELISA xỏc ủịnh type virus LMLM
3.3.3.1. Nguyờn lý
Khỏng nguyờn tương ứng sẽủược gắn với khỏng thểủặc hiệu cho từng type virus ủó ủược hấp phụ lờn bề mặt cỏc giếng của ủĩa phản ứng, khỏng thể
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………34
sẽủược gắn vào cỏc lỗ của ủĩa, mẫu khỏng nguyờn khụng tương ứng sẽ bị rửa trụi. Mẫu dương tớnh sẽ kết hợp với conjugate cú gắn enzyme, phản ứng chuyển màu sẽ xảy ra khi cú sự tham gia của chất xỳc tỏc Substrate/Chromogen.
3.3.3.2. Tiến hành
a. Sơủồủĩa
ðĩa xột nghiệm gồm 96 lỗ, ủược ủỏnh số hàng ngang theo thứ tự từ 1- 12 và theo hàng dọc từ A-H (08 hàng).
+ Theo hàng dọc: ủĩa ủược chia làm 2 phần từ A-D và từ E-H tương
ứng từng hàng với cỏc serotype O, A ,C , Asia 1. + Theo hàng ngang: Từ cột số 1- 4 là cỏc ủối chứng khỏng nguyờn (+) mạnh và cỏc khỏng nguyờn (+) yếu. Sơ ủồủĩa phản ứng ELISA phỏt hiện khỏng nguyờn (+) mạnh (+) yếu Blank Mẫu 1 Mẫu 3 Mẫu 5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 O A C Asia 1 O A C Asia 1 Mẫu 2 Mẫu 4 Mẫu 6
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………35
b. Sơủồ xột nghiệm
Phương phỏp ELISA ủể phỏt hiện khỏng nguyờn virus LMLM ủược tiến hành theo sơủồ sau:
Hấp thụ khỏng thể thỏ khỏng virus LMLM của cỏc serotype O, A, C, Asia1 ủược pha theo tỷ lệ 1:1000 với dung dịch gắn Carbonate/bicacbonate 50 àl/lỗ theo hàng tương ứng.
ủ 40C qua ủờm hoặc lắc 1 giờ ở 370C. Rửa 3 lần (dung dịch PBS 0,002 M) Thấm khụ.
Cho khỏng nguyờn ủối chứng (+) của từng type virus O, A, C, Asia 1 và cỏc huyễn dịch mẫu bệnh phẩm cần kiểm tra vào cỏc hàng tương ứng ủó gắn khỏng thể thỏ.
Lắc, ủở nhiệt ủộ 370C/1 giờ. Rửa 3 lần.
Thấm khụ.
Cho khỏng thể chuột lang khỏng virus LMLM của từng serotype O, A, C, Asia1 vào cỏc hàng tương ứng, 50 àl/ lỗ.
Lắc, ủở nhiệt ủộ 370C/1 giờ. Rửa 3 lần.
Thấm khụ.
Gắn Conjugate bằng dung dịch Buffer 1:200, cho 50 àl/ lỗ. Lắc, ủở nhiệt ủộ 370C/1 giờ. Rửa 3 lần.
Thấm khụ.
Cho Substrate/Chromogen lượng 50 àl/lỗ tham gia phản ứng và cột BLANK.
ðể nhiệt ủộ phũng 15 phỳt trong hộp tối Dừng phản ứng, cho H2SO4 1,25 M 50 àl/lỗ tham gia phản ứng và cột BLANK.
ðọc kết quả trờn mỏy ELISA, kớnh lọc 492 nm. Cỏc mẫu kiểm tra cú OD > 0,1 ủược coi là dương tớnh.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………36
3.3.4. Phương phỏp Real-time PCR phỏt hiện virus LMLM
3.3.4.1. Nguyờn lý của phản ứng Real-time PCR
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) ủược Kary Mullis và cộng sự
phỏt minh ra vào năm 1985. Kỹ thuật này tiếp tục ủược hoàn thiện, phỏt triển thụng qua sự phõn lập và sản xuất thành cụng emzyme tổng hợp DNA chịu nhiệt từ vi khuẩn Thermus aquaticus và sự thiết kế thành cụng cỏc mỏy chu kỳ nhiệt cho phộp thay ủổi nhanh chúng và chớnh xỏc nhiệt ủộ cho từng giai
ủoạn phản ứng. Kỹ thuật PCR cho phộp khuếch ủại một ủoạn gene ủặc hiệu. Trong PCR thụng thường, sau 20 – 30 vũng cú tới hàng triệu phõn tử ủược copy từ một phõn tử DNA (1 ủoạn gene), cú thể quan sỏt ủược trờn màn hỡnh mỏy tớnh sau từng chu kỳ.
RT-PCR: ðối với virus LMLM, trước khi tiến hành PCR thụng thường RNA của virus LMLM cần ủược chuyển thành cDNA nhờ enzyme Reverse Transcriptase. Phương phỏp PCR như vậy ủược gọi là RT-PCR. RT-PCR
ủược ỏp dụng rộng rói trong chẩn ủoỏn nhanh và ủịnh type virus LMLM. Phương phỏp PCR ủặc biệt cú ý nghĩa trong chẩn ủoỏn phõn biệt bệnh LMLM và bệnh mụn nước do virus LMLM ở lợn.
Nguyờn lý của phản ứng PCR: Dựa vào ủặc ủiểm sao chộp DNA; DNA Polymease sử dụng cỏc ủoạn DNA mạch ủơn làm khuụn mẫu ủể tổng hợp nờn sợi DNA bổ sung, bắt ủầu từ ủầu 3’OH của chuỗi oligo nucleotide (mồi hay