Nghiên cứu các điều kiện tinh sạch và đánh giá một số tính chất của protein có hoạt tính kháng nấm từ chủng serratia marcescens DT3

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -***** - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA PROTEIN CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM TỪ CHỦNG Serratia marcescens DT3 Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực : Trần Thị Thoan Lớp : 1202 Hà Nội – 2016 : TS.Đỗ Thị Tuyên LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới TS Đỗ Thị Tuyên, Phụ trách phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, người cô quan tâm, tận tình bảo, định hướng nghiên cứu, hướng dẫn, sửa luận văn, giúp đỡ tạo điều kiện giúp trình hoàn thành đề tài luận văn Tôi xin cảm ơn ThS Lê Thanh Hoàng trực tiếp hướng dẫn trình hoàn thành luận văn tập thể anh, chị làm việc phòng Công nghệ sinh học enzyme nhiệt tình giúp đỡ để hoàn thành tốt luận văn Tôi xin cảm ơn thầy cô giáo Khoa Công nghệ sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi cho trình học tập hoàn thiện luận văn tốt nghiệp Cuối xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè động viên giúp đỡ thời suốt thời gian học tập Hà Nội, ngày tháng Sinh viên Trần Thị Thoan năm 2016 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC BẢNG CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG BIỂU MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cương vi khuẩn Serratia 1.2 Bệnh trồng nấm Fusarium Rhizoctonia gây 1.2.1 Đặc điểm sinh học nấm Fusarium Rhizoctonia hại trồng 1.2.2 Tình hình bệnh hại trồng nấm Fusarium nấm Rhizoctonia gây Việt Nam 1.2.3 Biện pháp phòng trừ bệnh nấm hại trồng .9 1.3 Tình hình nghiên cứu chủng Serratia marcescens 14 1.3.1 Tình hình nghiên cứu giới .14 1.3.2 Tình hình nghiên cứu nước .15 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 17 2.1 Vật liệu hóa chất 17 2.1.1 Chủng giống 17 2.1.2 Hóa chất 17 2.1.3 Các loại đệm dung dịch 17 2.1.5 Thiết bị thí nghiệm 19 2.2 Phương pháp nghiên cứu 20 2.2.1 Lên men chìm nuôi cấy vi sinh vật 20 2.2.2 Xác định hoạt tính kháng nấm 20 2.2.3 Phương pháp kết tủa phân đoạn 21 2.2.4 Sắc kí trao đổi ion .22 2.2.5 Xác định hàm lượng protein .24 2.2.6 Điện di protein gel polyacrylamide ( SDS-PAGE ) 24 2.2.7 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính kháng nấm 25 2.2.8 Ảnh hưởng pH lên hoạt tính kháng nấm 26 2.2.9 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 26 2.2.10 Xác định khả ức chế nảy mầm bào tử nấm 26 2.2.11 Xử lý số liệu 26 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 3.1 Hoạt tính kháng nấm dịch chiết ngoại bào chủng Serratia marcescens DT3 27 3.2 Tinh protein có hoạt tính kháng nấm 30 3.2.1 Tủa protein muối amonium sulfate 30 3.2.2 Tinh protein sắc ký trao đổi ion DEAE .33 3.2.3 Đánh giá số hoạt tính kháng nấm protein tinh 35 3.3 Đánh giá tính chất protein tinh 36 3.3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính kháng nấm 36 3.3.2 Ảnh hưởng pH lên hoạt tính kháng nấm 37 3.3.3 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) protein tinh 39 3.3.4 Xác định khả ức chế nẩy mầm bào tử nấm 41 KẾT LUẬN 43 KIẾN NGHỊ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 PHỤ LỤC BẢNG CHỮ VIẾT TẮT APS Ammonium persulphate DEAE-cellulose Dimethylaminoethyl-cellulose ĐC Đối chứng F.oxysporum Fusarium oxysporum kDa Kilo Dalton LB Luria and Bertani PDA Potato Dextrose Agar M Matker OD Optical density PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis Pr Protein R.solani Rhizoctonia solani SDS Sodium dodecyl sulfate S marcescens Serratia marcescens TB Trung bình TEMED N,N,N’,N’,- Tetramethyl ethylene diamine TN Thí nghiệm v/v Volume/volume (thể tích/thể tích) w/v Weight/volume (khối lượng/thể tích) DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1 Danh mục hóa chất sử dụng nghiên cứu 17 Bảng 2.2 Dung dịch sử dụng nghiên cứu 18 Bảng 2.3 Môi trường sử dụng nghiên cứu 19 Bảng 2.4 Các máy móc thiết bị sử dụng nghiên cứu 19 Bảng 2.5 Thành phần gel polyacrylamide 12,5% 25 Bảng 3.1 Ảnh hưởng dịch chiết ngoại bào S marcescens DT3 nuôi môi trường LB lên sinh trưởng nấm F oxysporum 28 Bảng 3.2 Ảnh hưởng dịch chiết ngoại bào S marcescens DT3 lên sinh trưởng nấm R.solani 29 Bảng 3.3 Ảnh hưởng nồng độ tủa muối amonium sulfate lên sinh trưởng nấm F oxysporum 31 Bảng 3.4 Ảnh hưởng nồng độ tủa muối amonium sulfate lên sinh trưởng nấm R solani 31 Bảng 3.5 Tóm tắt trình tinh protein có hoạt tính kháng nấm từ chủng S marcescens DT qua bước tinh 34 Bảng 3.6 Ảnh hưởng nồng độ tối thiểu protein tinh từ chủng S marcescens DT3 lên hoạt tính kháng nấm F oxysporum 39 Bảng 3.7 Ảnh hưởng nồng độ tối thiểu protein tinh từ chủng S marcescens DT3 lên hoạt tính kháng nấm R solani 40 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Hình ảnh chủng S marcescens DT3 môi trường LB đặc Hình 1.2 Hình ảnh nấm F oxysporum đĩa thạch PDA Hình 1.3 Hình ảnh nấm R solani đĩa thạch PDA Hình 2.1 Quy trình tinh protein kháng nấm từ chủng S marcescens DT3 23 Hình 2.2 Đường chuẩn protein sử dụng BSA làm chuẩn 24 Hình 3.1 Hoạt tính kháng nấm dịch chiết ngoại bào S marcescens DT3 nấm F.oxysporum sau ngày 28 Hình 3.2 Hoạt tính kháng nấm dịch chiết ngoại bào S marcescens DT3 nấm R solani sau ngày 29 Hình 3.3 Hoạt tính ức chế nấm nồng độ tủa muối amonium sulfate nấm F oxysporum sau ngày 31 Hình 3.4 Hoạt tính ức chế nấm nồng độ tủa muối amonium sulfate nấm R solani sau ngày 32 Hình 3.5 Hoạt tính kháng nấm nồng độ tủa muối amonium sulfate 20 - 80% nấm F oxysporum (A) nấm R solani (B) 32 Hình 3.6 (A) Sắc kí đồ phân đoạn protein sau qua cột trao đổi ion DEAE – cellulose; (B) Điện di đồ phân đoạn protein tinh qua cột trao đổi ion DEAE – cellulose (LC: dịch protein trước lên cột; 7-12: protein từ phân đoạn 7- 12 sau qua cột DEAE- sepharose; M: thị phân tử) 34 Hình 3.7Hoạt tính kháng nấm F oxysporum (A)và R solani (B) phân đoạn protein tinh từ chủng S.marcescens DT3 (Đ/C (-): đệm potasium phosphate 20 mM pH 6,8; Đ/C (+): dịch lên cột; - 14: protein tinh từ phân đoạn – 14 35 Hình 3.8 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính kháng nấm F oxysporum (A) nấm R solani (B) Đ/C (+): mẫu không xử lý nhiệt; Đ/C (-): đệm potasium phosphate 20 mM pH 6,8; 5-30 mẫu xử lý nhiệt độ 100oC khoảng thời gian phút, 10 phút, 15 phút 30 phút 37 B 38 Hình 3.9 Ảnh hưởng pH lên hoạt tính kháng nấm F oxysporum (A) nấm R solani (B) Đ/C (+): Dịch lên cột; Đ/C (-): đệm potasium phosphate 20 mM pH 6,8; M3: dịch protein tinh ủ đệm acetate (pH 3); M7: dịch protein tinh ủ đệm phosphate (pH 7); M9: dịch protein tinh ủ đệm Tris-HCl (pH 9) 38 Hình 3.10Ức chế nồng độ tối thiểu protein tinh từ chủng S marcescens DT3 lên hoạt tính kháng nấm nấm F oxysporum 40 Hình 3.11Ức chế nồng độ tối thiểu protein tinh từ chủng S marcescens DT3 lên hoạt tính kháng nấm nấm R solani 41 Hình 3.12 Khả ức chế nảy mầm bào tử nấm F.oxysporum protein tinh từ chủng S marcescens DT3 quan sát kính hiển vi quang học Bào từ nấm F oxysporum sau (A, D), 24 ( B, E) 28 (C, F); bào tử nấm ủ với protein tinh sau (D), 24 (E) 28 (F) 42 MỞ ĐẦU Trong năm gần đây, bệnh hại trồng gây thiệt hại nghiêm trọng cho nông nghiệp giới, làm giảm thu nhập nhiều nông dân qua việc làm giảm suất chất lượng nông sản Đặc biệt, số bệnh nấm gây chiếm khoảng 83%, bệnh nấm Fusarium Rhizoctonia chiếm tỷ trọng tương đối lớn Nấm bệnh Fusarium Rhizoctonia gây bệnh nhiều loại ngũ cốc, ăn công nghiệp lúa, ngô, cà chua, khoai tây, cà phê, tiêu, Chúng có khả tồn đất thời gian dài, phát sinh gây hại từ giai đoạn non kéo dài đến thu hoạch không áp dụng biện pháp phòng trừ triệt để Nấm gây triệu chứng thối đen rễ, lở cổ rễ, thối gốc thân, thối thân, khô vằn, thối Biện pháp phòng trừ bệnh hại trồng theo xu hướng chủ yếu chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ vi sinh vật gây bệnh hại Tuy nhiên, thuốc phòng trừ bệnh hại trồng có nguồn gốc hóa học dùng phổ biến tác dụng rộng, hiệu tác dụng nhanh thuốc hóa học ngày bộc lộ rõ nhược điểm hiệu ngày gây ô nhiễm môi trường Vì vậy, chế phẩm sinh học sử dụng rộng rãi nhằm tạo nông nghiệp hữu an toàn bền vững Serratia trực khuẩn Gram âm, kị khí tùy nghi, thuộc họ Enterobacteraceae Chúng có khả sinh chất có hoạt tính kháng nấm sử dụng kiểm soát nhiều bệnh hại trồng khác Trên giới có nhiều nghiên cứu ứng dụng Serratia để phòng trừ nấm bảo vệ trồng kết đạt nghiên cứu sử dụng chế phẩm hạn chế Bởi chi phí thuốc bảo vệ thực vật giới chiếm 1,9% tổng giá trị loại thuốc bảo vệ thực vật Chính vậy, việc nghiên cứu phát triển chế phẩm sinh học diệt nấm cần thiết Xuất phát từ lý trên, thực đề tài:‘‘ Nghiên cứu điều kiện tinh đánh giá số tính chất protein có hoạt tính kháng nấm từ chủng Serratia marcescens DT3’’ nhằm thực nội dung nghiên cứu: Nghiên cứu điều kiện tinh protein từ chủng Serratia marcescens DT3 có hoạt tính kháng nấm Đánh giá tính chất protein tinh từ chủng Serratia marcescens DT3 ủ với pH thể kháng nấm mạnh hai nấm, kết phù hợp với số nghiên cứu giới Năm 2011 Zarei cộng tách chiết chitinase từ chủng S marcescens B4A ủ pH thể hoạt tính kháng nấm nấm Bipolaris sp Alternaria brassicicola [47].Hay protein tách từ chủng Bacillus spp thể hoạt tính kháng nấm ủ dải pH từ đến chí đến pH 10 hoạt tính kháng nấm Rhizosphere [50] 3.3.3 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) protein tinh Từ kết thu tinh protein, tiếp tục nghiên cứu đánh giá nồng độ ức chế tối thiểu hoạt chất tinh thu được, thử nghiệm lại hoạt tính đối kháng với hai loại nấmF oxysporum R solani theo phương pháp ức chế theo nồng độ bổ sung Nghiên cứu xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) protein tinh bổ sung protein nồng độ 100 µg/ml, 150 µg/ml, 200 µg/ml 250µg/ml vào đĩa thạch PDA xác định hoạt tính ức chế nấm F.oxysporum nấm R solani theo đường tròn đồng tâm sau 3-5 ngày nuôi cấy Bảng 3.6Ảnh hưởng nồng độ tối thiểu protein tinh từ chủng S marcescens DT3 lên hoạt tính kháng nấm F.oxysporum Nồng độ protein tinh (µg/ml) Sinh trưởng nấm (d:cm) Hoạt tính ức chế (%) 100 150 200 250 2,5±0,2 2±0,06 1,7±0,2 0,8±0,25 72,2±2,2 77,4±0,61 81,1±1,9 90,7±2,8 39 Hình 3.10Ức chế nồng độ tối thiểu protein tinh từ chủng S marcescens DT3 lên hoạt tính kháng nấm nấm F.oxysporum Đánh giá khả ức chế nấm F.oxysporum nồng độ protein có hoạt tính kháng nấm tách chiết từ chủng S marcescens DT3 từ 100 µg/ml đến 250 µg/ml Nhận thấy nồng độ 100 µg/ml diện tích tản củanấm F.oxysporum 2,5 cm bị ức chế đến 72% sinh trưởng phát triển nấm Khi tăng nồng độ protein lên thể rõ ức chế mạnh nấm F oxysporum, cụ thể nồng độ 150 µg/ml nấm bị ức chế 77%, nồng độ 200 µg/ml ức chế 81% sinh trưởng phát triển nấm Đến nồng độ 250 µg/ml nấm F.oxysporum bị ức chế hoàn toàn ức chế 90% sinh trưởng phát triển nấm Bảng 3.7Ảnh hưởng nồng độ tối thiểu protein tinh từ chủngS marcescens DT3 lên hoạt tính kháng nấm R.solani Nồng độ protein tinh (µg/ml) Sinh trưởng nấm (d:cm) Hoạt tính ức chế (%) 100 150 200 250 6,3±0,25 4±0,2 3,7 ± 0,06 2,8±0,12 30,1±2,77 55,6±2,25 58±1,7 70±1,3 40 So với nấm F.oxysporum nấm R solani lại thể ức chế hơn, nồng độ protein từ 100 µg/ml đến 250 µg/ml Khi bổ sung nồng độ protein 100 µg/ml; 150 µg/ml; 200 µg/ml 250 µg/ml vào môi trường PDA đặt nấm R solani nuôi 30oC, ngày Nhận thấy, nồng độ protein 100 µg/ml nấm R solani bị ức chế 30% sinh trưởng phát triển.Nhưng nồng độ 250 µg/ml nấm R solani bị ức chế đến 70% sinh trưởng phát triển Tuy nhiên, ức chế nồng độ protein 100 µg/ml nấm F.oxysporum (Hình 3.12) Hình 3.11Ức chế nồng độ tối thiểu protein tinh từ chủng S marcescens DT3 lên hoạt tính kháng nấm nấm R solani Từ kết trên, lần chứng tỏ protein có hoạt tính kháng nấm tách chiết từ chủng S marcescens DT3 có khả ức chế sinh trưởng phát triển nấm F.oxysporum tốt nấm R solani 3.3.4 Xác định khả ức chế nẩy mầm bào tử nấm Protein tinh bổ sung vàodịch bào từ nấm F.oxysporumvới hàm lượng 130 µg/ml ủ 30oC từ đến 28 giờ, mẫu đối chứng thay protein tinh 0,2% (w/v) Tween 20 ủ điều kiện, sau quan sát nảy mầm bào tử nấm kính hiển vi điện tử (Hình 3.12) 41 Kết quan sát kính hiển vi điện tử cho thấy bào tử nấm ủ với Tween 20 nồng độ 0,2% (w/v) sau đến 28 bắt đầu nảy mầm phát triển thành sợi nấm (Hình 3.12 A, B, C), cònsau ủ với protein tinh bào tử nấm F.oxysporum sau chưa nảy mầm đến 28 bào tử nấm có dấu hiệu nảy mầm (Hình 3.12 D, E, F) A D B C EF Hình 3.12Khả ức chế nảy mầm bào tử nấmF.oxysporum protein tinh từ chủng S.marcescens DT3 quan sát kính hiển vi quang học Bào từ nấm F.oxysporum sau (A, D), 24 ( B, E) 28 (C, F); bào tử nấm ủ với protein tinh sau (D), 24 (E) 28 (F) Như vậy, protein tinh từ chủng S.marcescens DT3 có khả ức chế nảy nầm bào tử nấm khoảng thời gian 28 42 KẾT LUẬN Dịch chiết ngoại bào chủng S marcescens DT3 nồng độ 10% ức chế 20% nấmF.oxysporum 11,4 %nấm R.solani Ở nồng độ 50% ức chế 67% - 80% sinh trưởng phát triển hai nấm tương ứng F.oxysporum vàR.solani, nấm R.solani khả ngày thứ Tinh protein có hoạt tính kháng nấm với khối lượng phân tử 56kDa từ chủng S.marcescens DT3 qua bước tinh sạch: tủa muối amonium sulfate nồng độ bão hòa 30% , 70% qua cột sắc ký trao đổi ion DEAE- cellulose Protein có hoạt tính kháng nấm bền với nhiệt độ, ủ nhiệt độ 100oC 30 phút thể hoạt tính kháng nấm hai nấm F.oxysporum nấm R.solani Khi ủ pH 3, pH 7, pH với tỉ lệ 1:1thì protein tinh (0,26mg/ml) thể hiệnhoạt tính kháng nấm tăng dần với nấm F.oxysporum nấm R.solani Đặc biệt, pH thể mạnh rõ ràng nấm F.oxysporum Đã xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) protein tinh Ở nồng độ 250 µg/ml ức chế70 -90 % sinh trưởng phát triển tương ứng nấm R solani nấmF.oxysporum Protein tinh sạchcòn có khả ức chế nảy mầm bảo tử nấm F.oxysporum sau 28 ủ KIẾN NGHỊ Hoàn thiện quy trình tinh protein có hoạt tính kháng nấm quy mô lên men lớn ứng dụng tạo sản phẩm sinh học có khả kháng nấm phục vụ phát triển nông nghiệp bền vững 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Cục Y Tê Dự Phòng Và Môi Trường - Bộ Y Tế (2009), “Gần 5000 người nhiễm độc thuốc bảo vệ thực vật.” Đỗ Tấn Dũng (2006), “Nghiên cứu bệnh lở cổ rễ (Rhizoctonia solani Kuhn) số trồng vùng Hà Nội năm 2005-2006 ” Đỗ Thị Tuyên, Lê Đình Quyền, Quyền Đình Thi, and Nguyễn Ngọc Dũng (2011), “Tinh protein có hoạt tính kháng nấm từ chủng Bacillus subtilis XL62”, Tạp chí Công Nghệ Sinh Học, 3, pp 1811-4989 Đoàn Thị Thanh (2005), “Nghiên cứu đa dạng sinh học isolates nấm Fusarium spp”, Tập san BVTV Nguyễn Kim Vân (2003), “Nghiên cứu chủng nấm Rhizoctonia solani Kuhn gây hại bắp cải bước đầu khảo sát biện pháp phòng trừ ”, Tạp chí BVTV, 192, pp 18-21 Nguyễn Thị Tuyết Nhung, Nguyễn Minh Anh, Phan Thị Hoài Anh, and Nguyễn Ngọc Dũng (2006), “Nghiên cứu chế kháng nấm Fusarium oxysporum gây bệnh trồng số chủng vi khuẩn Pseudomonas huỳnh quang chọn lọc”, Tc Sinh học, 28, pp 77-81 Vũ Trọng Lượng, Nguyễn Sỹ Lê Thanh, Đỗ Thị Tuyên, and Nguyễn Thị Hồng Nhung (2015), “Nghiên cứu tách chiết, tinh đánh giá hoạt tính hoạt chất chống khuẩn chống nấm Prodigiosin từ chủng Seratia marcescens M6”, Y Học Việt Nam, 433, pp 190-195 Nguyễn Việt Long, 2001 Hiệu phòng trừ bệnh đốm vằn lúa hai chủng vi khuẩn đối kháng với nấm Rhizoctonia solani ruộng lúa ĐồngTháp Luận văn thạc sĩ ngành Nông Học đại học Nông Lâm, HCM Trần Thị Thùy Linh, Nguyễn Quang Huy, Nguyễn Sỹ Lê Thanh, Đỗ Thị Tuyên, ‘‘Đánh giá hoạt tính kháng nấm dịch chiết ngoại bào Serratia marcescens DT3 môi trường khác nhau’’,Tc Sinh học,2015 44 10 Burgess, T.E., Phan Thúy Hiền, Cẩm Nang Chuẩn Đoán Bệnh, NXB ACIAR, 2009 Tài liệu tiếng Anh 11 Andrews, J.H (1992), “Biological control in the phyllosphere”, Annual review of phytopathology, 30, pp 603-635 12 Babashpour, S., S Aminzadeh, N Farrokhi, A Karkhane, and K Haghbeen (2012), “Characterization of a chitinase (Chit62) from Serratia marcescens B4A and its efficacy as a bioshield against plant fungal pathogens”, Biochemical genetics, 50 (9-10), pp 722-735 13 Bach E, Sant’Anna V, Daroit D, Corrêa A P F, Segalin J, and Brandelli A (2012), “Production, one-step purification, and characterization of a keratinolytic protease from Serratia marcescens P3”, Process Biochemistry, 47 (12), pp 2455-2462 14 Bezuglova, O.S and G.V Motuzova (2007), “ Environmental monitoring of soil.”, Gaudeamus,Moscow 15 Bradford, M.M (1976), “A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding”, Analytical biochemistry, 72, pp 248-254 16 Ceresin, Gp (2011), “Rhizoctonia solani” 17 Chitarra, G.S., P Breeuwer, M.J Nout, A.C Van Aelst, F.M Rombouts, and T Abee (2003), “An antifungal compound produced by Bacillussubtilis YM 10-20 inhibits germination of penicillium roqueforti conidiospores”, Journal of applied microbiology, 94 (2), pp 159-166 18 David, P and H Kelsey (2007), “Public health and costs of pesticides”, in Encyclopedia of Pest Management, Taylor & Francis, pp 677-680 19 Farr Df, G.F.B., George P Chamuris, and Amy Y Rossmanrogerson, Clarkt and B Boom (1990), “Fungi on plants and plant products in the United States ”, Brittonia, 42 (3), pp 243-246 45 20 Gerhardson, B (2002), “Biological substitutes for pesticides”, Trends in biotechnology, 20 (8), pp 338-343 21 Giri, A.V., N Anandkumar, G Muthukumaran, and G Pennathur (2004), “A novel medium for the enhanced cell growth and production of prodigiosin from Serratia marcescens isolated from soil”, BMC microbiology, 4, pp 11 22 Gordon, T.R and R.D Martyn (1997), “The evolutionary biology of Fusarium oxysporum”, Annual review of phytopathology, 35, pp 111128 23 Green, A.A and W.L Hughes (1955), “Protein fractionation on the basis of solubility in aqueous solutions of salts and organic solvents”, Methods Enzymol, 1, pp 67-90 24 Roman G.M Mi, Holguisn-Melensdez F, Dunn Mf, G.-N K, and Huerta-Palacios G (2015), “Antifungal activity of Serratia marcescens CFFSUR-B2 purified chitinolytic enzymes and prodigiosin against Mycosphaerella fijiensis, causal agent of black Sigatoka in banana (Musa spp.)”, BioControl, 60 (4), pp 565-572 25 Huber, J., H Bochow, and H Junge (1987), “Selektion und biotechnische herstellung von kulturlösungen mikrobieller antagonisten zur Unterdrückung phytopathogener Bodenpilze”, Journal of Basic Microbiology, 27 (9), pp 497-503 26 Xia, J., Liu, B Huang, and Z.-Y Nie (2011), “Production of chitinase and its optimization from a Novel Isolate Serratia marcescens XJ-01”, Indian J Microbiol, 51 (3), pp 301-306 27 Kalbe, C., P Marten, and G Berg (1996), “Strains of the genus Serratia as beneficial Rhizobacteria of oilseed rape with antifungal properties”, Microbiological Research, 151 (4), pp 433-439 28 Kamensky, M., M Ovadis, I Chet, and L Chernin (2003), “Soil-borne strain IC14 of Serratia plymuthica with multiple mechanisms of 46 antifungal activity provides biocontrol of Botrytis cinerea and Sclerotinia sclerotiorum diseases”, Soil Biology and Biochemistry, 35 (2), pp 323-331 29 Laemmli, U.K (1970), “Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4”, Nature, 227 (5259), pp 680685 30 Li, J., Q Yang, L.H Zhao, S.M Zhang, Y.X Wang, and X.Y Zhao (2009), “Purification and characterization of a novel antifungal protein from Bacillus subtilis strain B29”, J Zhejiang Univ Sci B, 10 (4), pp 264-272 31 X Liu, Bimerew M., Ma Y., Müller H., Ovadis M., Eberl L., Berg G., Chernin L.,(2007), “Quorum-sensing signaling is required for production of the antibiotic pyrrolnitrin in a rhizospheric biocontrol strain of Serratia plymuthica”, FEMS microbiology letters, 270 (2), pp 299-305 32 Liu, J Jia, H Li, M Camara et al (2010), “Biocontrol potential of an endophytic Serratia sp G3 and its mode of action”, World J Microbiol Biotechnol, 26 (8), pp 1465-1471 33 Liu, J Jia, Li Jun, Roman P et al (2011), “Characterisation of two quorum sensing systems in the endophytic Serratia plymuthica strain G3: differential control of motility and biofilm formation according to life-style”, BMC microbiology, 11 (1), pp 26 34 Mahlen S D (2011), “Serratia infections: from military experiments to current practice”, Clinical microbiology reviews, 24 (4), pp 755-791 35 Nalini S and Parthasarathi R (2014), “Production and characterization of rhamnolipids produced by Serratia rubidaea SNAU02 under solidstate fermentation and its application as biocontrol agent”, Bioresource technology, 173, pp 231-238 47 36 Okay, S., M Özdal, and E.B Kurbanoğlu (2013), “Characterization, antifungal activity, and cell immobilization of a chitinase from Serratia marcescens MO-1”, Turk J Biol, 37, pp 639-644 37 Parani, K., G.P Shetty, and B.K Saha (2011), “Isolation of Serratia marcescens SR1 as a source of chitinase having potentiality of using as a biocontrol agent”, Indian J Microbiol, 51 (3), pp 247-250 38 Paul D and Sarma Y (2006), “ Antagonistic effects of metabolites of Pseudomonas fluorescens strains on the different growth phases of Phytophthora capsici, foot rot pathogen of black pepper (Piper nigrum L.)”, Arch Phytopathol Plant Protect, 39, pp 311–314 39 David P., Hugh A., P Rice, M Silva, et al (1993), “Assessment of environmental and economic impacts of pesticide use”, in The Pesticide Question, D Pimentel and H Lehman, Editors, Springer US, pp 47-84 40 Rattanachuay P, Kantachote D, T M, Nitoda T, and Kanzaki H (2010), “Inhibition of shrimp pathogenic vibrios by extracellular compounds from a proteolytic bacterium Pseudomonas sp W3”, Electronic Journal of Biotechnology, 13 41 Shokouhfard, M., R.K Kermanshahi, R.V Shahandashti, M.M Feizabadi, and S Teimourian (2015), “The inhibitory effect of a Lactobacillus acidophilus derived biosurfactant on biofilm producer Serratia marcescens”, Iranian journal of basic medical sciences, 18 (10), pp 1001-1007 42 Someya, N., M Nakajima, K Hirayae, T Hibi, and K Akutsu (2001), “Synergistic antifungal activity of chitinolytic enzymes and prodigiosin produced by biocontrol bacterium, Serratia marcescens Strain B2 against Gray Mold Pathogen, Botrytis cinerea”, J Gen Plant Pathol, 67 (4), pp 312-317 43 Stuart, S (2003), “Development of resistance in pest population” 48 44 Tariq Al, Reyaz Al, and Prabakaran J John (2011), “Purification and characterization of 56 kDa cold-active protease from Serratia marcescens”, Afr J Microbiol Res, 5, pp 5841-5847 45 Wan, M.H., B Wu, W Ren, and B He (2010), “Screening, characterization, and cloning of a solvent-tolerant protease from Serratia marcescens MH6”, Journal of microbiology and biotechnology, 20 (5), pp 881-888 46 Wang K., Zhao T.F., Cao X.L., Shao C, et al (2013), “Potential of chitinolytic Serratia marcescens strain JPP1 for biological control of Aspergillus parasiticus and aflatoxin”, BioMed research international, 2013 47 Zarei M., Aminzadeh S., Safahieh A., Motallebi A., et al (2011), “Characterization of a chitinase with antifungal activity from a native Serratia marcescens B4A”, Brazilian journal of microbiology : [publication of the Brazilian Society for Microbiology], 42 (3), pp 10171029 48 Zeng, H.-W., Y.-J Cai, X.-R Liao, S.-L Qian, F Zhang, and D.-B Zhang (2010), “Optimization of catalase production and purification and characterization of a novel cold-adapted Cat-2 from mesophilic bacterium Serratia marcescens SYBC-01”, Ann Microbiol, 60 (4), pp 701-708 49 Zhou P., Zhao Y., Wu G., Li J., et al (2012), “Dietary exposure to persistent organochlorine pesticides in 2007 chinese total diet study”, Environment international, 42, pp 152-159 50 Balouiri M, Harki E, et al (2015), “Antifugal activity of Bacillus spp.isolated from calotropis procera ait, Rhizosphere aginst candida albicans”, Journal Metrics, ISSN: 0974–2441 49 50 PHỤ LỤC Hình P1 Hoạt tính ức chế nấm nồng độ tủa muối amonium sulfate20 80% nấm R.solani sau ngày ( ĐC: đối chứng không bỏ sung dịch) Hình P2 Hoạt tính ức chế nấm nồng độ tủa muối amonium sulfate 20 - 80% nấm F.oxysporum sau ngày ( ĐC: đối chứng không bỏ sung dịch) Bảng P1 Bảng đo hàm lượng protein qua cột DEAE-cellulose Phân đoạn OD1 OD2 ODTB HLP1 HLP2 HLPTB 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 0,053 0,071 0,073 0,078 0,121 0,273 0,473 0,568 0,977 1,018 0,956 0,855 0,731 0,401 0,155 0,126 0,087 0,095 0,074 0,066 0,064 0,059 0,047 0,035 0,04 0,048 0,074 0,073 0,077 0,122 0,266 0,468 0,594 0,963 1,017 0,923 0,841 0,738 0,49 0,161 0,12 0,099 0,064 0,065 0,07 0,065 0,039 0,038 0,046 0,038 0,0505 0,0725 0,073 0,0775 0,1215 0,2695 0,4705 0,581 0,97 1,0175 0,9395 0,848 0,7345 0,4455 0,158 0,123 0,093 0,0795 0,073 0,068 0,0645 0,049 0,0425 0,0405 0,039 0,008072 0,01366 0,014281 0,015834 0,029183 0,076374 0,138466 0,16796 0,294939 0,307668 0,28842 0,257063 0,218566 0,116113 0,039739 0,030736 0,018628 0,021111 0,014592 0,012108 0,011487 0,009935 0,006209 0,002484 0,004036 0,00652 0,014592 0,014281 0,015523 0,029494 0,074201 0,136914 0,176032 0,290593 0,307358 0,278174 0,252717 0,220739 0,143744 0,041602 0,028873 0,022353 0,011487 0,011798 0,01335 0,011798 0,003726 0,003415 0,005899 0,003415 0,007296 0,014126 0,014281 0,015678 0,029339 0,075287 0,13769 0,171996 0,292766 0,307513 0,283297 0,25489 0,219652 0,129929 0,040671 0,029804 0,020491 0,016299 0,013195 0,012729 0,011642 0,00683 0,004812 0,004191 0,003726 HLP1: Hàm lượng protein đo OD bước sóng 595 lần HLP2: Hàm lượng protein đo OD bước sóng 595 lần HLPTB: Hàm lượng protein trung bình hai lần đo [...]... màng lọc Thử hoạt tính kháng nấm Tủa 30% ammonium sulfate Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút Tủa 70% ammonium sulfate Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút Tủa thu được hòa vào đệm, loại muối bằng thẩm tích DEAE Hoạt chất tinh sạch Thử hoạt tính kháng nấm - Thử hoạt tính kháng nấm R solanivà F oxysporum Điện di SDS-PAGE để kiểm tra, đánh giá độ sạch Đánh giá tính chất lí hóa của protein tinh sạch Hình... 2,4-diacetylphoroglucinol từ S marcescens kháng F oxysporum [6] Năm 15 2015,Vũ Trọng Lượng và cộng sự đã nghiên cứu về hoạt tính kháng nấm của chủngS .marcescens M6 phân lập ở mẫu đất, trong khi dịch chiết ức chế ngoại bào chỉ ức chế nấm được 20-30% khả năng sinh trưởng và phát triển của nấm F.oxysporum vàR.solani, còn hoạt chất prodigiosin tinh sạch tách ra từ chủng này đã ức chế lên đến hơn 75% ở nồng độ hoạt chất đạt... cây trồng Năm 1996 Kalbe và các cộng sự đã công bố tìm thấy các hoạt chất kháng nấm phytopathogenic từ các chủng Serratia được phân lập từ rễ của cây cái dầu [27] Năm 2001 Someya và cộng sự đã tách chiết được chitinase và prodigiosin có khả năng chống lại các bệnh mốc xám và các bệnh héo do nấm Fusarium gây ra ở các cây Anh thảo từ chủng S marcescens B2 [42].Năm 2002 Kamensky và các cộng sự đã công bố... hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính kháng nấm Protein có hoạt tính kháng nấm sau khi tinh sạch qua cột DEAE – cellulose, được ủ ở nhiệt độ 100oC trong các khoảng thời gian 5, 10,15 và 30 phút Dịch protein sau khi sốc nhiệt được bổ sung 20µl vào khoanh giấy lọc, mẫu đối chứng là 20µl đệm potasium photphate 20 mM pH 6,8 Các khoanh giấy được đặt vào đĩa thạch nuôi cấy các chủng nấm F oxysporum và nấm R solani... một số loại nấm như Botrytis cinerea, Cryphonectria paracitica, R cerealis và Valsa sordida từ chủng Serratia sp.G3 [32].Năm 2013 Wang và cộng sự đã công bố việc sử dụng chủng S marcescens được phân lập từ vỏ lạc để sản xuất ra các chất có hoạt tính ức chế sự tăng trưởng của sợi nấm A.paraciticus và aflatoxin [46] Cũng năm này, Okay và cộng sự đã nghiên cứu tách chiết được chitinase từ chủng S .marcescens. .. dõi sự nảy mầm của bào tử nấm trên kính hiển vi điện tử từ 4 giờ đến 28 giờ 2.2.11 Xử lý số liệu Phần mềm Microsoft Excel được sử dụng để xử lý số liệu thu được trong quá trình thực nghiệm và tính giá trị của tham số thống kê CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 3.1 Hoạt tính kháng nấm của dịch chiết ngoại bào chủng Serratia marcescens DT3 Chủng S .marcescens DT3 được nuôi trên môi trường LB và nuôi lắc trong... sinh trưởng của nấm 25 2.2.8 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính kháng nấm Protein tinh sạch sau khi qua cột DEAE – cellulose, được ủ ở các pH 3, pH7 và pH 9 Sau đó, dịch protein được bổ sung 100µl vào giếng thạch, mẫu đối chứng là pH tương ứng Các giếng thạch được đục cách đều trong đĩa thạch nuôi cấy các chủng nấm F oxysporum và nấm R solani sau 3-5 ngày kiểm tra khả năng ức chế sinh trưởng của nấm 2.2.9... lập từ đất xung quanh rễ cây dưa để kháng nấm phytopathogenic trong ống nghiệm [28] Năm 2004 Givi và cộng sự đã tách chiết được prodigiosin từ chủng S marcescens có khả năng kháng một số nấm [21] 14 Năm 2007 Liu và cộng sự đã tách chiết được pyrrolnitrin từ chủng S.plymuthica có khả năng chống lại các bệnh héo do nấm Verticillium gây ra [31] Năm 2010 Liu và cộng sự đã tìm thấy chất có khả năng kháng một. .. Tình hình nghiên cứu trong nước Việc nghiên cứu các protein có hoạt tính kháng nấm ở cây trồng đã và đang được quan tâm ở Việt Nam Một số cơ sở nghiên cứu trong nước như Viện Công nghệ sinh học và Viện Sinh học nhiệt đới (Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam ), Viện bảo vệ thực vật và Viện Thổ nhưỡng và nông hóa (Bộ NN& PTNT), Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Đại Học Cần Thơ Và các công... bằng đệm potasium phosphate 20 mM; pH 6,8 có chứa 1M NaCl, với tốc độ dòng chảy 25ml/giờ Thu 25 phân đoạn, mỗi phân đoạn 2 ml và các phân đoạn này được xác định hàm lượng protein theo phương pháp của Braford Sau đó, lựa chọn những phân đoạn có hoạt tính protein cao để xác định hoạt tính kháng nấm 22 Quá trình tách chiết và tinh sạch protein có hoạt tính kháng nấm được tóm tắt theo sơ đồ hình 2.1 Dịch