Nghiên cứu biểu hiện gen Paga mã hóa kháng nguyên bảo vệ PA của vi khuẩn Bacillus anthracis trong vi khuẩn E. Coli BL21

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN PHƢỢNG MINH NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN PAGA MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN BẢO VỆ PA CỦA VI KHUẨN BACILLUS ANTHRACIS TRONG VI KHUẨN E. COLI BL21 Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 01 03 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS NGÔ ĐÌNH BÍNH HÀ NỘI - 2013 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập và thực hiện luận văn, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ, hỗ trợ của thầy cô, bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Tôi xin trân trọng cảm ơn tất cả những tình cảm quý báu đó. Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Ngô Đình Bính, người thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ phòng Di truyền Vi sinh, Viện công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian dài thực tập. Tôi xin chân thành cảm ơn Thủ trưởng và cán bộ Viện Hóa học - Môi trường Quân sự nơi tôi công tác đã tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành luận văn của mình. Cuối cùng tôi xin cảm ơn bạn bè và gia đình, những người đã luôn ủng hộ tôi trong suốt thời gian qua! Hà Nội, ngày 24 tháng 11 năm 2013 Học viên Nguyễn Phượng Minh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ATP Acid Adenozin Triphosphate B. anthracis/ Ba Bacillus anthracis bp base pair CA Casamino Acid dH 2 O deion water DNA Deoxyribonucleic Acid dNTP Deoxyribonucleotide Triphosphate EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid EF Edema Factor FAO Food Agricultural Organisation h giờ kDa Kilo Dalton LB Lauria Betani LF Lethal Factor MPA Meat Pepton Agar MPB Meat Pepton Broth ORF Open Reading Frame PA Protective Antigen PCR Polymerase Chains Reaction SDS Sodium Dodecylsulphate TAE Tris – Acetate EDTA Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Sơ lƣợc về bệnh than 3 1.1.1. Lịch sử xuất hiện và phát triển của bệnh than 3 1.1.2. Các dạng bệnh than 4 1.1.2.1. Bệnh than thể da 5 1.1.2.3. Bệnh than hô hấp 7 1.1.2.4. Bệnh than thể màng não 7 1.1.3. Bệnh than và chiến tranh sinh học 8 1.2. Tác nhân gây bệnh than 9 1.2.1. Đặc điểm vi khuẩn Bacillus anthracis 10 1.2.2. Độc tố của vi khuẩn B. anthracis 11 1.2.2.1. Độc tố vỏ nhày 11 1.2.2.2. Độc tố than 12 1.2.2.2.1. Kháng nguyên bảo vệ PA (Protective antigen – PA) 12 1.2.2.2.2. Tác nhân gây phù thũng (Edema factor – EF) 13 ện của các gen gây độc trong vi khuẩn B. anthracis 15 1.3. Kháng nguyên bảo vệ PA 17 1.3.1. Vai trò của kháng nguyên bảo vệ PA 17 1.3.2. Cấu trúc kháng nguyên bảo vệ PA 18 1.3.3. Cơ chế dẫn truyền độc tố của kháng nguyên bảo vệ PA 20 1.4. Gen mã hoá kháng nguyên bảo vệ PA 22 1.5. Biểu hiện gen pagA 23 1.5.1. Vector biểu hiện 23 1.5.2. Lựa chọn chủng biểu hiện 25 1.5.3 Phƣơng pháp biểu hiện 26 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 28 2.1. Vật liệu 28 28 2.2. Hoá chất và môi trƣờng 29 2.2.1. Hoá chất, dung dịch 29 2.2.2. Môi trƣờng 34 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 34 2.3.1. Phƣơng pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn [30]. 35 2.3.2. Phƣơng pháp tinh sạch plasmid [30]. 35 2.3.3. Phƣơng pháp PCR 36 2.3.4. Phƣơng pháp điện di trên gel agarose [30]. 36 2.3.5. Phƣơng pháp cắt bằng enzym giới hạn [30] 37 2.3.7. Phƣơng pháp làm tế bào khả biến E. coli 39 2.3.8. Phƣơng pháp biến nạp vào tế bào khả biến [30] 39 2.3.9. Phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide 12,6 % [30] 40 2.3.10. Phƣơng pháp biểu hiện gen 41 2.3.11. Khảo sát điều kiện biểu hiện thích hợp cho quá trình biểu hiện 41 2.3.12. Xác định khả năng hoà tan của protein 42 2.3.13. Tinh chế protein dung hợp bằng cột Probond Nikel Resin 42 2.3.14. Phƣơng pháp Western Blot [3, 25] 44 CHƢƠNG 3-KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46 3.1. Tách chiết DNA tổng số 46 3.2. Khuếch đại đoạn gen pagA bằng phản ứng PCR 46 3.3. Tách dòng gen pagA 47 3.3.1. Biến nạp vector mang gen pagA vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5α 47 3.3.2. Kiểm tra sự tồn tại của gen pagA trong vector tái tổ hợp 47 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 3.3.3. Đọc trình tự nucleotide của gen pagA 51 3.4. Biểu hiện gen pagA mã hóa kháng nguyên bảo vệ PA 54 3.4.1. Thiết kế vector biểu hiện mang gen pagA 54 3.4.2. Gắn đoạn gen pagA vào vector biểu hiện pET-TRX-FUS 54 3.4.3. Tạo chủng E. coli BL21 tái tổ hợp mang gen pagA 55 3.4.3.1. Biến nạp vector tái tổ hợp pET-TRX-FUS-pagA vào chủng trung gian E. coli DH5α 55 3.4.3.2. Kiểm tra sự tồn tại của pagA trong plasmid tái tổ hợp 55 3.4.3.3. Kiểm tra khung đọc của vector tái tổ hợp pET-TRX-FUS-pagA . 57 3.4.3.4. Biến nạp plasmid tái tổ hợp pET-TRX-pagA vào E. coli BL21 (DE3) 58 3.4.4. Nghiên cứu biểu hiện gen pagA trong E. coli BL21 59 3.4.4.1. Nghiên cứu điều kiện biểu hiện gen pagA 59 3.4.4.2. Xác định khả năng hoà tan và định khu của protein 62 3.5. Tinh chế protein tái tổ hợp bằng cột sắc kí ái lực Probond Nikel Resin 63 3.6. Khẳng định sự biểu hiện của protein tái tổ hợp PA bằng phản ứng Western blot 64 66 66 KIẾN NGHỊ 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC HÌNH 5 ủa bệnh nhân nhiễm than đường tiêu hóa 6 Hình 1.3: Phổi bị nhiễm bệnh than 7 Hình1. 4: Não của người bị nhiễm bệnh 8 Hình 1.5: Hình thái tế bào (A) và bào tử (B) của vi khuẩn B. anthracis 10 Hình 1.6: Nhân tố gây chết EF 13 Hình 1.7: Nhân tố gây chết LF 14 Hình 1.8: Cấu trúc đơn phân kháng nguyên bảo vệ PA 18 Hình 1.9: Cấu trúc vòng heptam của kháng nguyên bảo vệ PA 20 Hình 1.10: Cơ chế dẫn truyền độc tố của kháng nguyên bảo vệ PA 20 Hình 1.11: Vector biểu hiện 23 Hình 1.12: Sơ đồ cấu trúc và vị trí cắt giới hạn của vectơ pET-28a(+). 25 Hình 2.1: Mô hình phản ứng Western blot 44 Hình 3.1. Điện di DNA tổng số trên gel 0,8% agarose 46 Hình3.2. Điện di sản phẩm PCR của gen pagA trên gel 0,8% agarose 46 Hình 3.3. Khuẩn lạc E. coli DH5α trên môi trường LBA chứa X - gal và ampicillin 47 Hình 3.4. Điện di DNA plasmid từ các dòng khuẩn lạc xanh và trắng trên gel 0,8 % agarose 48 Hình 3.5. Điện di sản phẩm cắt bằng EcoRI trên gel 1,5% agarose 49 Hình 3.6. Điện di sản phẩm cắt DNA plasmid tách chiết từ các khuẩn lạc trắng dòng 1, 10 bằng enzyme BamHI và XhoI trên gel 1 % agarose 50 Hình 3.7. Điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen pagA với cặp mồi BA1 và BA2 từ các dòng khuẩn lạc 1,2 trên gel 0,8% agarose 51 Hình 3.8. So sánh trình tự gen pagA của chủng B. anthracis VCM1167 với Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ các trình tự đã công bố trên ngân hàng gen quốc tế 52 Hình 3.9. Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện pET-TRX-FUS-pagA 54 Hình 3.10. Điện di sau khi thôi gel trên gel 1% agarose 55 Hình 3.11. Khuẩn lạc của E. coli DH5α trên môi trường LBA 55 Hình 3.12. Điện di plasmid từ các khuẩn lạc E. coli DH5a trên gel 1 % agarose 56 Hình 3.13. Điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp trên gel 1 % agarose 56 Hình 3.14. Điện di sản phẩm PCR trên gel 1 % agarose 57 Hình 3.15. Trình tự acid amin của protein kháng nguyên bảo vệ trên lý thuyết 58 Hình 3.16. Khuẩn lạc của vi khuẩn E. coli chủng BL21 trên môi trường LBA 58 Hình 3.17. Điện di sự biểu hiện protein PA trên gel 12,6 % polyacrylamide 59 Hình 3.18. Điện di protein tái tổ hợp PA theo nhiệt độ trên gel 12,6 % polyacrylamide 60 Hình 3.19. Điện di biểu hiện protein tái tổ hợp PA theo nồng độ IPTG 61 Hình 3.20. Điện di mẫu protein PA theo thời gian trên gel 12,6 % polyacrylamide 62 Hình 3.21. Điện di protein tan và không tan trên gel 12,6 % polyacrylamide 63 Hình 3.22. Điện di protein sau khi tinh sạch trên gel 12,6 % polyacrylamide 64 Hình 3.22a. Phản ứng của protein tái tổ hợp PA gắn Thioredoxin với kháng thể kháng Thioredoxin trên màng lai PVDF 65 Hình 3.22b. Phản ứng của protein tái tổ hợp PA gắn Thioredoxin với kháng thể kháng PA trên màng lai PVDF 65 Hình 3.22c. Phản ứng western blot giữa protein tái tổ hợp PA với kháng thể kháng PA tự nhiên 65 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh than là một căn bệnh nhiễm khuẩn cấp tính do vi khuẩn Bacillus anthracis (B. anthracis) gây ra cho gia súc, đặc biệt là cho các động vật ăn cỏ như trâu, bò, dê cừu ngựa Bệnh than có khả năng lây nhiễm sang người thành dịch với tỷ lệ tử vong cao. Bệnh có nhiều dạng biểu hiện khác nhau tuỳ theo cách tiếp xúc với bệnh, nhưng nhìn chung, bệnh than bao gồm 4 dạng: than thể da, than thể hô hấp, than thể tiêu hoá và than thể màng não. Bệnh than là một căn bệnh vô cùng nguy hiểm. Nó mang một số đặc điểm được trung tâm kiểm soát và ngừa bệnh Hoa Kỳ dùng để nhận biết các trường hợp có thể làm vũ khí sinh học như thời gian lây nhiễm nhanh, tỷ lệ gây chết cao, tác nhân gây bệnh có thể chống chịu được với điều kiện khắc nghiệt. Chính vì vậy, việc nghiên cứu phát hiện, chẩn đoán bệnh than và tác nhân gây bệnh than là rất quan trọng Kháng nguyên tái tổ hợp Protective Antigen (PA) là một trong 3 loại độc tố than của vi khuẩn Bacillus anthracis. PA là nhân tố quyết định tính độc của vi khuẩn than. Bản thân PA không gây độc nhưng khi kết hợp với nhân tố gây chết Lethal Factor (LF) hay nhân tố gây phù thũng Edema Factor (EF) lại sinh sản độc tố gây chết hoặc phù thũng cho tế bào vật chủ. Ngoài ra, PA còn có chứa vùng liên kết thụ thể và có khả năng gây đáp ứng miễn dịch chống bệnh than. Chính vì vậy, hiện nay có nhiều nghiên cứu sử dụng kháng nguyên bảo vệ PA để tạo protein tái tổ hợp làm nguyên liệu để tạo kit chuẩn đoán bệnh than cũng như tạo vaccine phòng chống bệnh than. Xuất phát từ tính cấp thiết chúng tôi tiến hành đề tài: “ Nghiên cứu biểu hiện gen pagA mã hóa kháng nguyên bảo vệ PA của vi khuẩn Bacillus anthracis trong vi khuẩn E . coli BL21”. Mục tiêu của đề tài: 1. Biểu hiện Protein PA của vi khuần Bacillus anthracis trong vi khuẩn E . coli BL21, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 2. Thu nhận kháng nguyên bảo vệ PA tái tổ hợp phục vụ các nghiên cứu chuyên sâu. Nhiệm vụ của đề tài: 1. Tách dòng và giải trình tự gen pagA mã hóa kháng nguyên bảo vệ PA, 2. Thiết kế vector biểu hiện pET-TRX-FUS mang gen pagA, 3. Nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn E . coli BL21 tái tổ hợp mang gen pagA, 4. Nghiên cứu tìm ra điều kiện thích hợp cho quá trình biểu hiện về nhiệt độ, nồng độ chất cảm ứng (IPTG), thời gian, 5. Tinh sạch được protein PA trên cột sắc ký ái lực Probond Nikel Resin, 6. Kiểm tra khả năng phản ứng của protein PA tái tổ hợp với kháng thể đặc hiệu kháng PA bằng phản ứng Western blot. [...]... và gen mã hoá vỏ capsulee trong vi khuẩn B anthracis được điều khiển bởi ba nhân tố điều hoà là acpA, atxA và pagR Đồng thời 2 yếu tố CO2/bicarbonate và nhiệt độ cũng chi phối sự biểu hiện của các gen độc tố [7, 19, 20] Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 1.3 Kháng nguyên bảo vệ PA 1.3.1 Vai trò của kháng nguyên bảo vệ PA Kháng nguyên bảo vệ PA là thành phần quan trọng trong quá... chế sự acid hoá của endosome, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ cùng với bề mặt có tính acid của kênh truyền dẫn, cho phép nhân tố EF và LF đi vào bên trong tế bào chất để sinh sản độc tố gây phù thũng và độc tố gây chết [19, 20] 1.4 Gen mã hoá kháng nguyên bảo vệ PA Kháng nguyên bảo vệ PA được mã hoá bởi gen cấu trúc pagA nằm trên plasmid pXO1 Kháng nguyên bảo vệ PA bản thân nó... dịch mã và không có quá trình glycosyl hoá - Một số chủng vi khuẩn E coli có thể gây bệnh hoặc tạo các độc tố khi biểu hiện gen của sinh vật bậc cao - Mặt khác, khả năng tạo và tiết protein ngoại bào của các chủng vi khuẩn E coli tương đối thấp 1.5.3 Phƣơng pháp biểu hiện Để biểu hiện gen pagA, đầu tiên người ta phải tách dòng gen pagA và đem cài gen đã được tách dòng này vào một vector biểu hiện Để... trò của những vùng chức năng khác nhau của PA trong quá trình gắn lên màng tế bào đích để đưa các nhân tố gây độc LF và EF vào bên trong tế bào chất gây ra hiệu quả độc tố [28] Gen mã hoá cho kháng nguyên bảo vệ PA là gen pagA nằm trên plasmid pXO1 Theo tài liệu nghiên cứu trên thế giới, gen pagA có khung đọc mở (ORF) dài 2319 codon, trong đó đoạn có kích thước 2205 bp mã hoá cho 735 acid amin của PA. .. xuất hiện của yếu tố lạ bị đình chỉ, từ đó các protease sẽ phá huỷ cấu trúc nội bào gây chết cho tế bào vật chủ 1.2.3 Bi u hiện của các gen gây độc trong vi khuẩn B anthracis Người ta đã xác định được rằng có hai nhân tố chính điều hoà sự dịch mã và biểu hiện của gen là atxA và acpA Gen acpA nằm trên plasmind pXO2 hoạt hoá sự biểu hiện của gen capB (một trong các gen mã hoá vỏ capsulee) Gen atxA nằm... các gen độc tố thì không có đặc tính trên Điều đó thể hiện sự liên quan chặt chẽ của atxA và các gen độc tố [14] Cùng với hai nhân tố điều hoà acpA và atxA, người ta cũng tìm thấy một gen pag kích thước 300 bp, nó cùng được dịch mã xuôi chiều với gen pagA Gen pagR mã hoá cho một protein có trình tự acid amin giống các tác nhân điều hoà dịch mã trong các sinh vật khác Gen pagR ức chế sự biểu hiện của gen. .. biểu hiện E coli sẽ tránh được hiện tượng glycosyl hoá Biểu hiện E coli hệ thống biểu hiện E coli có rất nhiều ưu điểm hơn hẳn các hệ thống biểu hiện khác như [4]: - Vi khuẩn E coli có tốc độ sinh trưởng nhanh, khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp mạnh, chỉ sau 8 giờ nuôi cấy ở điều kiện thích hợp đã có sản phẩm protein tái tổ hợp Khả năng tạo sản phẩm gen cao từ 50 mg/l đến 500 mg/l - Biểu hiện gen. .. tương ứng với nhiều loại tế bào biểu hiện khác nhau Dựa trên những đặc điểm của vector biểu hiện đã nêu trên, để biểu hiện gen pagA mã hoá kháng nguyên bảo vệ PA chúng tôi sử dụng vectơ pET-TRX (pET-TRX Fusion Expression Vector System) làm vectơ biểu hiện Vectơ pET-TRX có kích thước khoảng 5800bp, được thiết kế dựa trên cơ sở của vectơ pET-28a(+) nhưng được gắn thêm đoạn gen mã hoá cho protein Thioredoxin... Tách plasmid từ các thể biến nạp trong E coli và kiểm tra gen và đặc biệt là chiều của gen trong vector biểu hiện Gen cần biểu hiện phải nằm đúng chiều của promoter Bước 9: Biến nạp vector biểu hiện có mang gen vào tế bào chủ E coli và tiến hành biểu hiện Sau khi tiến hành biểu hiện thành công, tiến hành điện di kiểm tra trên gel polyacrylamid và tinh sạch protein Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/... thũng cho tế bào vật chủ Hình 1.9: Cấu trúc vòng heptam của kháng nguyên bảo vệ PA 1.3.3 Cơ chế dẫn truyền độc tố của kháng nguyên bảo vệ PA Hình 1.10: Cơ chế dẫn truyền độc tố của kháng nguyên bảo vệ PA (1) PA liên kết với thụ thể bề mặt tế bào, enzyme nội bào phân cắt PA tạo PA2 0 và PA6 3 (2) PA đã được phân cắt hình thành heptam (PA6 3)7, EF hoặcLF liên kết vào heptam tạo phức hợp xâm nhập vào nang có . http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 3.3.3. Đọc trình tự nucleotide của gen pagA 51 3.4. Biểu hiện gen pagA mã hóa kháng nguyên bảo vệ PA 54 3.4.1. Thiết kế vector biểu hiện mang gen pagA 54 3.4.2. Gắn đoạn gen pagA. tự gen pagA mã hóa kháng nguyên bảo vệ PA, 2. Thiết kế vector biểu hiện pET-TRX-FUS mang gen pagA, 3. Nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn E . coli BL21 tái tổ hợp mang gen pagA, 4. Nghiên cứu. kháng nguyên bảo vệ PA của vi khuẩn Bacillus anthracis trong vi khuẩn E . coli BL21 . Mục tiêu của đề tài: 1. Biểu hiện Protein PA của vi khuần Bacillus anthracis trong vi khuẩn E . coli BL21,