Dữ liệu về trình tự của dòng plasmid tái tổ hợp thu được được sử dụng để dịch mã ra acid amin trên lý thuyết nhằm kiểm tra khung đọc của gen sử dụng công cụ EXPASY. Kết quả cho thấy trình tự gen pagA được dịch mã thông, bao gồm 735 acid amin:
10 20 30 40 50 60 EVKQENRLLN ESESSSQGLL GYYFSDLNFQ APMVVTSSTT GDLSIPSSEL ENIPSENQYF
70 80 90 100 110 120 QSAIWSGFIK VKKSDEYTFA TSADNHVTMW VDDQEVINKA SNSNKIRLEK GRLYQIKIQY
Hình 3.14. Điện di sản phẩm PCR trên gel 1 % agarose
Giếng 1: DNA plasmid pCR2.1-pagA Giếng 2,3: DNA plasmid từ dòng 2 và 6
Giếng 4: Thang DNA chuẩn (Fermentas)
kb
2,2 kb 2
130 140 150 160 170 180 QREDPTEKGL DFKLYWTDSQ NKKEVISSDN LQLPELKQKS SNSKKRRSTS AGPTVPDRDN
190 200 210 220 230 240 DGIPDSLEVE GYTVDVKNKR TFLSPWISNI HEKKGLTKYK SSPEKWSTAS DPYSDFEKVT
250 260 270 280 290 300 GRIDKNVSPE ARHPLVAAYP IVHVDMENII LSKNEDQSTQ NTDSQTRTIS KNTSTSRTHT
310 320 330 340 350 360 SEVHNGAEVH ASFFDIGGSV SAGFSNSNSS TVAIDHSLSL AGERTWAETM GLNTADTARL
370 380 390 400 410 420 NANIRYVNTG TAPIYNVLPT TSLVLGKNQT LATIKAKENQ LSQILAPNNY YPSKNLAPIA
430 440 450 460 470 480 LNAQDDFSST PITMNYNQFL ELEKTKQLRL DTDQVYNGIA TYNFENGRVR VDTGSNWSEV
490 500 510 520 530 540 LPQIQETTAR IIFNGKDLNL VERRIAAVNP SDPLETTKPD MTLKEALKIA FGFNEPNNGL
550 560 570 580 590 600 QYQGKDITEF DFNFDQQTSQ NIKNQLAELN ATNIYTVLDK IKLNAKMNIL IRDKRFHYDR
610 620 630 640 650 660 NNIAVGADES VVKEAHREVI NSSTEGLLLN IDKDIRKILS GYIVEIEDTE GLKEVINDRY
670 680 690 700 710 720 DMLNISSLQQ DGKTFIDFKK YNDKLPLYIS NPNYKVNVYA VTKENTIINP SENGDTSTNG
730 IKRILIFSKK GYEIG
Hình 3.15. Trình tự acid amin của protein kháng nguyên bảo vệ trên lý thuyết
3.4.3.4. Biến nạp plasmid tái tổ hợp pET-TRX-pagA vào E. coli BL21 (DE3)
Sau khi thu được vector biểu hiện tái tổ hợp mang gen pagA với khung đọc chuẩn, tiến hành biến nạp vào E. coli BL21 bằng phương pháp sốc nhiệt. Dịch nuôi lắc 37oC (1 giờ) được cấy trải trên môi trường LBA có chứa knamycin. Sau khi ủ qua đêm ở 37oC, trên đĩa petri xuất hiện các khuẩn lạc như hình 3.16:
Như vậy, đã tạo được chủng E. coli BL21 mang vector tái tổ hợp pET-
TRX-FUS mang gen pagA.