Đây là phương pháp lai protein với kháng thể đặc hiệu, sử dụng trong các nghiên cứu protein và enzyme.
Các bước thực hiện phản ứng Western blot như sau:
– Bước 1: Protein PA được điện di trên gel 12,6 % polyacrylamide, – Bước 2: Ngâm màng PVDF trong methanol lạnh (–20 o
C) trong 5 phút rồi rửa bằng dung dịch blotting buffer,
– Bước 3: Chuyển protein sang màng PVDF trong blotting buffer (điện trường 100 V, 2 giờ trên máy khuấy từ, trong tủ lạnh),
– Bước 4: Thu màng PVDF và nhuộm đánh dấu bằng Ponceau trong 5 phút để đánh dấu băng protein,
– Bước 5: Rửa màng 3 lần bằng dH2O,
– Bước 6: Phủ màng bằng skim milk 5 % trong TTBS 1X, lắc ở nhiệt độ phòng, 2 giờ,
– Bước 7: Rửa màng 3 lần bằng TTBS 1X, 5 – 10 phút/lần, Rửa màng 3 lần bằng TBS 1X, 5 – 10 phút/lần,
– Bước 8: Nhuộm kháng thể 1 (kháng thể kháng protein PA tái tổ hợp) đã pha loãng 500 lần trong skim milk 1 % trong TTBS 1X, lắc ở nhiệt độ phòng, 2 giờ,
– Bước 9: Rửa màng 3 lần bằng TTBS 1X, 5 – 10 phút/lần, Rửa màng 3 lần bằng TBS 1X, 5 – 10 phút/lần,
– Bước 10: Nhuộm kháng thể dê kháng kháng thể thỏ cộng hợp HRP đã pha loãng 10.000 lần trong skim milk 1 % trong TTBS 1X, lắc ở nhiệt độ phòng, 2 giờ,
– Bước 11: Rửa màng 3 lần bằng TTBS 1X, 5 – 10 phút/lần, Rửa màng 3 lần bằng TBS 1X, 5 – 10 phút/lần,
– Bước 12: Bổ sung chất hiện màu (5 ml methanol + 15 mg HRP colour hòa trong 25 ml TBS + 25µl H2O2), để phản ứng xảy ra trong tối.
Hình 3.1. Điện di DNA tổng số trên gel 0,8% agarose
Giếng 1: DNA tổng số
1 2 CHƢƠNG 3-KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tách chiết DNA tổng số
Chủng vi khuẩn B. anthracis
VCM1167 được nuôi qua đêm trên môi trường LB, sau đó ly tâm để thu tế bào và tiến hành tách chiết DNA tổng số. Kết quả điện di trên gel 0,8 % agarose thể hiện ở hình 3.1:
Kết quả chỉ cho một băng duy nhất thể hiện ở hình 3.1 cho thấy
quy trình tách DNA tổng số và các hoá chất dùng cho việc tách chiết, tinh sạch DNA là phù hợp.
3.2. Khuếch đại đoạn gen pagA bằng phản ứng PCR
Sau khi tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn B. anthracis, tiến hành khuếch đại đoạn gen pagA bằng phản ứng PCR. Phản ứng này được thực hiện sử dụng cặp mồi BA1 và BA2, có sự tham gia của enzyme Taq polymerase và dNTPs. Sản phẩm PCR của gen pagA được kiểm tra bằng điện di trên gel 0,8% agarose , thể hiện ở hình 3.2:
Kết quả ở hình trên chỉ cho một băng duy nhất có kích thước ~ 2,2 kb như tính toán lý thuyết. Như vậy, cặp mồi BA1 và BA2 được thiết kế với độ đặc hiệu cao, chu trình nhiệt là phù hợp.
Hình 3.2. Điện di sản phẩm PCR của gen pagA trên gel 0,8% agarose
Giếng 1: Thang DNA chuẩn (Fermentas) Giếng 2: Sản phẩm PCR 1 2 2,2 kb 3 2 kb
3.3. Tách dòng gen pagA
3.3.1. Biến nạp vector mang gen pagA vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5α DH5α
Để khẳng định kết quả của kĩ thuật PCR, chúng tôi tiến hành tách dòng gen pagA mã hoá kháng nguyên bảo vệ PA. Sản phẩm PCR được gắn vào vector pCR2.1 nhờ enzyme nối T4 ligase. Sau đó, sản phẩm lai được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5α nhờ sốc nhiệt và nuôi trong môi trường SOC ở 37o
C. Tiến hành cấy trải dịch nuôi trên môi trường LBA có chứa nhân tố chọn lọc X-gal và ampicillin. Sau khi ủ qua đêm ở 37oC, trên đĩa petri xuất hiện hai dòng khuẩn lạc xanh và trắng, thể hiện ở hình 3.3:
Theo lý thuyết, những dòng khuẩn lạc trắng có khả năng mang đoạn gen
pagA mong muốn. Tuy nhiên, cần phải tiếp tục nghiên cứu các dòng khuẩn lạc trắng để đưa ra kết luận chính xác.
3.3.2. Kiểm tra sự tồn tại của gen pagA trong vector tái tổ hợp
Các khuẩn lạc trắng riêng rẽ được nuôi cấy trong môi trường LB có chứa ampicillin, lắc 200 v/p để qua đêm ở 37oC. Sau đó tiến hành tách chiết plasmid và kiểm tra bằng điện di trên gel 0,8 % agarose. Kết quả thể hiện ở hình 3.4:
Hình 3.3. Khuẩn lạc E. coli DH5α trên môi trường LBA chứa X - gal và ampicillin
Theo lý thuyết điện di, DNA kích thước lớn hơn sẽ chạy chậm hơn nghĩa là ảnh quan sát được là vạch sáng cao hơn và ngược lại. Do đó, có thể dự đoán DNA plasmid của dòng khuẩn lạc số 1 và 9 đã mang gen pagA. Tuy nhiên để kết luận chính xác về hai dòng này cần thực hiện phản ứng cắt bằng en zym giới hạn và phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu của gen pagA với khuôn là 1 dòng plasmid 1 và 9.
a. Phương pháp cắt bằng enzyme giới hạn
Trước tiên, DNA plasmid được xử lý bằng enzyme giới hạn EcoRI để kiểm tra sự có mặt của gen pagA. Kết quả thể hiện ở hình 3.5 cho thấy các plasmid từ các dòng khuẩn lạc 1, 9 (giếng 2,3) sau khi cắt bằng enzyme
EcoRI cho hai băng tương ứng với sản phẩm PCR đã được cắt bằng EcoRI (giếng 1). Điều này chứng tỏ đoạn gen pagA 2,2 kb của vi khuẩn này có chứa điểm cắt của EcoRI. Theo trình tự gen pagA đã công bố, chúng tôi nhận thấy vị trí cắt của EcoRI chia đoạn pagA thành hai đoạn có kích thước khoảng 1 kb và 1,2 kb. Như vậy các dòng 1, 9 là các dòng có mang plasmid tái tổ hợp chứa đoạn gen pagA có kích thước 2,2 kb của vi khuẩn B. anthracis. Còn dòng khuẩn lạc xanh (giếng 4) chỉ có vector 3,9 kb mà không mang đoạn gen này.
Hình 3.4. Điện di DNA plasmid từ các dòng khuẩn lạc xanh và trắng trên gel 0,8 % agarose
Do trên 2 mồi BA1 và BA2 có chứa vị trí cắt của enzyme giới hạn
BamHI và XhoI nên đề tài tiến hành cắt kiểm tra để đảm bảo rằng quá trình tách dòng không làm ảnh hưởng đến vị trí cắt của enzyme giới hạn nhằm phục vụ cho việc lắp ghép đoạn gen pagA vào vector biểu hiện sau này. Sản phẩm cắt được điện di trên gel 0,8 % agarose (Hình 3.6). Kết quả cho thấy plasmid dòng số 1, 9 sau khi cắt bằng 2 enzyme tạo ra 2 băng, băng lớn là vector tách dòng có kích thước 3,9 kb, băng nhỏ có kích thước khoảng 2,2 kb tương ứng với sản phẩm PCR của gen pagA. Điều này chứng tỏ 2 plasmid tái tổ hợp có mang đoạn gen pagA 2,2 kb và quá trình tách dòng không ảnh hưởng đến 2 vị trí cắt của enzyme giới hạn trên 2 mồi.
3,9 1,2 1,0 5 1 2 3 4 5 6 kb kb 3 2,2
Hình 3.5. Điện di sản phẩm cắt bằng EcoRI trên gel 1,5% agarose Giếng 1: Sản phẩm PCR được cắt bằng EcoRI
Giếng 2,3: DNA plasmid tái tổ hợp của dòng 1, 9 Giếng 4: DNA plasmid của dòng khuẩn lạc xanh Giếng 5: Thang DNA chuẩn (Fermentas)
b. Khẳng định sự tồn tại của gen pagA trong plasmid bằng phƣơng pháp PCR
Để có kết luận chính xác hơn về plasmid tái tổ hợp có mang đoạn gen mong muốn hay không, đề tài tiến hành phản ứng PCR sử dụng cặp mồi BA1 và BA2 với khuôn DNA là plasmid tái tổ hợp dòng 1, 9. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel 0,8 % agarose và kết quả cho một băng DNA có kích thước khoảng 2,2 kb tương ứng với sản phẩm PCR từ DNA tổng số của B. anthracis VCM1167 (giếng 2) (Hình 3.7) :
1 2 3 4 5 kb 3 2 kb 3,9 2,2
Hình 3.6. Điện di sản phẩm cắt DNA plasmid tách chiết từ các khuẩn lạc trắng dòng 1, 10 bằng enzyme BamHI và XhoI trên gel 1 % agarose
Giếng 1:ĐC (B. anthracis)
Giếng 2,3: Khuẩn lạc trắng dòng 1, 9 Giếng 4: Thang DNA chuẩn (Fermentas)
3.3.3. Đọc trình tự nucleotide của gen pagA Sau khi thu nhận được plasmid tái tổ hợp có mang gen pagA của hai dòng khuẩn lạc 1 và 9, đề tài tiến hành đọc trình tự của đoạn gen pagA đã được tách dòng. Trình tự nucleotide của sản phẩm tách dòng được đọc trên máy xác định trình tự DNA tự động. Kết quả trình tự được so sánh và phân tích với các gen trên ngân hàng gen quốc tế bằng phần mềm BioEdit, Seqcape, Blast (Hình 3.8): M22589 CAGAAGTTAA ACAGGAGAAC CGGTTATTAA ATGAATCAGA ATCAAGTTCC CAGGGGTTAC 60
VCM1167 .C... ... ... ... ... ...
AY997299 ... ... ... ... ... ...
AY700758 TG... ... ... ... ... ...
AF306778 ... ... ... ... ... ...
AF306782 ... ... ... ... ... ...
M22589 TAGGATACTA TTTTAGTGAT TTGAATTTTC AAGCACCCAT GGTGGTTACC TCTTCTACTA 120 VCM1167 ... ... ... ... ... ... AY997299 ... ... ... ... ... ... AY700758 ... ... ... ... ... ... AF306778 ... ... ... ... ... ... AF306782 ... ... ... ... ...T ... ...
M22589 ATCAACGAGA AAATCCTACT GAAAAAGGAT TGGATTTCAA GTTGTACTGG ACCGATTCTC 420 VCM1167 ... .G... ... ... ... ... AY997299 ... ... ... ... ... ... AY700758 ... ... ... ... ... ... AF306778 ... ... ... ... ... ... AF306782 ... ... ... ... ... ... ...
M22589 CTTCGAACTC AAGAAAAAAG CGAAGTACAA GTGCTGGACC TACGGTTCCA GACCGTGACA 540 VCM1167 ... ..A...G. ... ... ... ... AY997299 ... ... ... ... ... ... AY700758 ... ... ... ... ... ... AF306778 ... ... ... ... ... ... AF306782 ... ... ... ... ... ... Hình 3.7. Điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen pagA với cặp mồi BA1 và BA2 từ các dòng khuẩn lạc 1,2 trên gel 0,8% agarose Giếng 1,3: Dòng 1, 9 Giếng 2: ĐC (B. anthracis) 1 2 3 4 2 kb 2,2 kb
...
M22589 AGAATACTGA TAGTGAAACG AGAACAATAA GTAAAAATAC TTCTACAAGT AGGACACATA 900 VCM1167 ... ....C... ... ... ... ...
AY997299 ... ....C... ... ... ... ...
AY700758 ... ....C... ... ... ... ...
AF306778 ... ....C... ... ... ... ...
AF306782 ... ....C... ... ... ... ...
M22589 CTAGTGAAGT ACATGGAAAT GCAGAAGTGC ATGCGTCGTT CTTTGATATT GGTGGGAGTG 960 VCM1167 ... ... ... ... ... ...
AY997299 ... ... ... ... ... ...
AY700758 ... ... ... ... ... ...T....
AF306778 ... ... ... ... ... ...
AF306782 ... ... ... ... ... ...
M22589 TACAATATCA AGGGAAAGAC ATAACCGAAT TTGATTTTAA TTTCGATCAA CAAACATCTC 1680 VCM1167 ... ... ... ....C... ... ...
AY997299 ... ... ... ... ... ...
AY700758 ... ... ... ... ... ...
AF306778 ... ... ... ... ... ...
AF306782 ... ... ... ... ... ...
M22589 AAAATATCAA GAATCAGTTA GCGGAATTAA ACGCAACTAA CATATATACT GTATTAGATA 1740 VCM1167 ... ... ... ... ... ...
AY997299 ... ... ... ... ... ...
AY700758 ... ... ... ... ... ...
AF306778 ... ... ... ... ... ...
AF306782 ... ... ... ...T... ... ...
M22589 AAATCAAATT AAATGCAAAA ATGAATATTT TAATAAGAGA TAAACGTTTT CATTATGATA 1800 VCM1167 ... ... ... .G... ... ... AY997299 ... ... ... ... ... ... AY700758 ... ... ... ... ... ... AF306778 ... ... ... ... ... ... AF306782 ... ... ... ... ... ... ...
M22589 ATGATATGTT GAATATTTCT AGTTTACGGC AAGATGGAAA AACATTTATA GATTTTAAAA 2040 VCM1167 ... ... ...A.. ... ... ... AY997299 ... ... ... ... ... ... AY700758 ... ... ... ... ... ... AF306778 ... ... ... ... ... ... AF306782 ... ... ... ... ... ... ...
M22589 GGATCAAGAA AATTTTAATC TTTTCTAAAA AAGGCTATGA GATAGGATAA 2210 VCM1167 ...G ... ... ... ...
AY997299 ... ... ... ... ...
AY700758 ... ... ... ... ...
AF306778 ... ... ... ... ...
AF306782 ... ... ... ... ...
Hình 3.8. So sánh trình tự gen pagA của chủng B. anthracis VCM1167 với các trình tự đã công bố trên ngân hàng gen quốc tế
Đoạn gen được tách dòng kích thước 2210 nucleotid có độ tương đồng 99 % so với gen pagA của B. anthracis trên ngân hàng gen quốc tế (số đăng ký M22589). Trình tự pagA có 9 vị trí thay đổi so với các trình tự pagA khác trên ngân hàng gen quốc tế cho thấy trong 9 vị trí thay đổi này có 2 vị trí đã được công bố (Vị trí 2 và 855) và 7 vị trí thay đổi mới. Trình tự gen pagA đã được đăng kí trên ngân hàng gen quốc tế (Gen Bank) với mã số AM404332.
Sau đó, trình tự gen pagA được dịch mã ra acid amin trên lý thuyết nhằm đảm bảo trình tự gen dịch mã thông và không bị mã kết thúc trong gen khi gắn vào vector biểu hiện. Kết quả cho thấy trong 9 vị trí thay đổi này, có 6 vị trí thay đổi liên quan đến sự biến đổi acid amin, trong đó có 2 acid amin bị biến đổi nằm ở vùng IV của protein PA (Bảng 3.2). Sự thay đổi này không ảnh hưởng đến vùng liên kết thụ thể (680 - 692). Tuy nhiên hoạt tính sinh học của PA83 vẫn cần nghiên cứu tiếp.
Bảng 3.2. Sự thay đổi acid amin
Vị trí Nu thay đổi Acid amin biến đổi
2 A C -
372 A G
(N D) Asparagin Axit Aspartic
493 G A (R K) Arginin Lysin
499 A G (K R) Lysin Arginin
855 G C
(E Q) Axit glutamic Glutamin
1655 T C -
1772 A G -
2008 G A (R Q) Arginin Glutamin
3.4. Biểu hiện gen pagA mã hóa kháng nguyên bảo vệ PA 3.4.1. Thiết kế vector biểu hiện mang gen pagA 3.4.1. Thiết kế vector biểu hiện mang gen pagA
Đoạn gen pagA có kích thước 2,2 kb mã hóa kháng nguyên bảo vệ
pagA được cắt ra khỏi plasmid pVCM_PA1 bằng 2 enzyme giới hạn
BamHI và XhoI, sau đó được ghép vào vector biểu hiện pET-TRX-FUS đã
được cắt mở vòng bằng 2 enzyme này để tạo plasmid tái tổ hợp pET- TRX-FUS-pagA. Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện pET-TRX-FUS-pagA
được thể hiện ở hình 3.9:
3.4.2. Gắn đoạn gen pagA vào vector biểu hiện pET-TRX-FUS
Đoạn gen pagA (2,2kb) và vector biểu hiện pET-TRX-FUS được xử lý với 2 enzyme BamHI và XhoI được điện di trên gel 1 % agarose và thu lại bằng cách cắt gel. Sản phẩm cắt được tinh sạch qua cột của hãng Invitrogen. Kết quả thể hiện ở hình 3.10:
Phản ứng gắn đoạn gen pagA vào vector pET-TRX-FUS được xử lý bằng enzyme BamHI và XhoI được thực hiện nhờ T4 ligase. Dưới tác dụng của enzyme nối đoạn gen pagA được gắn vào vector pET-TRX-FUS để tạo ra vector tái tổ hợp pET-TRX-FUS-pagA.
pCR2.1pagA 6,1kb pET-TRX- FUS 5,8kb BamHI XhoI pagA (2,2kb) BamHI XhoI pET-TRX-FUS pagA 7,6kb pagA (2,2kb)
3.4.3. Tạo chủng E. coli BL21 tái tổ hợp mang gen pagA
3.4.3.1. Biến nạp vector tái tổ hợp pET-TRX-FUS-pagA vào chủng trung gian E. coli DH5α gian E. coli DH5α
Sản phẩm lai được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5α nhờ sốc nhiệt ở 42oC trong 60 giây và nuôi trong môi trường LB ở nhiệt độ 37oC. Nhờ bộ máy tổng hợp của vi khuẩn, plasmid tái tổ hợp được tạo ra với số lượng lớn các bản sao. Tiến hành cấy trải dịch nuôi trên môi trường LPA có chứa kháng sinh kanamycin (25 mg/ml) với nồng độ cuối là 50 μg/ml. Sau khi nuôi qua đêm ở 37oC trên đĩa petri xuất hiện khuẩn lạc màu trắng, thể hiện ở hình sau:
3.4.3.2. Kiểm tra sự tồn tại của pagA trong plasmid tái tổ hợp
Lựa chọn các khuẩn lạc mọc trên đĩa petri, tiến hành tách chiết DNA plasmid và điện di. Kết quả thể hiện ở hình 3.11
Hình 3.11.Khuẩn lạc của E. coli DH5α trên môi trường LBA Hình 3.10. Điện di sau khi thôi gel trên
gel 1% agarose
Giếng 1: Gen pagA thu đƣợc sau khi đƣợc xử
lý bằng BamHI và XhoI
Giếng 2: Vector pET-TRX-FUS thu đƣợc sau
khi đƣợc xử lý bằng BamHI và XhoI
Giếng 3: Thang DNA chuẩn (Fermentas)
1 2 3 2,2 5,8 kb kb 7 5 3 2
Dựa trên hình 3.12 có thể dự đoán DNA plasmid của dòng khuẩn lạc số 2 và 6 mang gen pagA. Do đó, plasmid tái tổ hợp của hai dòng khuẩn lạc 2 và 6 tiếp tục được kiểm tra bằng phương pháp cắt bằng enzyme giới hạn và PCR.
a. Phƣơng pháp cắt giới hạn BamHI và XhoI
Chúng tôi sử dụng enzyme giới hạn là BamHI và XhoI. Kết quả điện di sản phẩm cắt trên gel agarose thể hiện ở hình sau:
Kết quả trên hình cho thấy, mỗi giếng xuất hiện hai băng, băng ở trên có kích thước tương tự kích thước của vector pET-TRX-FUS (5,8 kb), băng ở
Hình 3.12. Điện di plasmid từ các khuẩn lạc E. coli DH5a trên gel 1 % agarose Giếng 2,6: Dòng khuẩn lạc mang gen pagA
Giếng 1,3,4,5,7,8: Dòng khuẩn lạc không mang gen pagA
7 5 3 2 5,8 2,2 1 2 3 4 kb kb
Hình 3.13. Điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp trên gel 1 % agarose