3.4.1. Thiết kế vector biểu hiện mang gen pagA
Đoạn gen pagA có kích thước 2,2 kb mã hóa kháng nguyên bảo vệ
pagA được cắt ra khỏi plasmid pVCM_PA1 bằng 2 enzyme giới hạn
BamHI và XhoI, sau đó được ghép vào vector biểu hiện pET-TRX-FUS đã
được cắt mở vòng bằng 2 enzyme này để tạo plasmid tái tổ hợp pET- TRX-FUS-pagA. Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện pET-TRX-FUS-pagA
được thể hiện ở hình 3.9:
3.4.2. Gắn đoạn gen pagA vào vector biểu hiện pET-TRX-FUS
Đoạn gen pagA (2,2kb) và vector biểu hiện pET-TRX-FUS được xử lý với 2 enzyme BamHI và XhoI được điện di trên gel 1 % agarose và thu lại bằng cách cắt gel. Sản phẩm cắt được tinh sạch qua cột của hãng Invitrogen. Kết quả thể hiện ở hình 3.10:
Phản ứng gắn đoạn gen pagA vào vector pET-TRX-FUS được xử lý bằng enzyme BamHI và XhoI được thực hiện nhờ T4 ligase. Dưới tác dụng của enzyme nối đoạn gen pagA được gắn vào vector pET-TRX-FUS để tạo ra vector tái tổ hợp pET-TRX-FUS-pagA.
pCR2.1pagA 6,1kb pET-TRX- FUS 5,8kb BamHI XhoI pagA (2,2kb) BamHI XhoI pET-TRX-FUS pagA 7,6kb pagA (2,2kb)
3.4.3. Tạo chủng E. coli BL21 tái tổ hợp mang gen pagA
3.4.3.1. Biến nạp vector tái tổ hợp pET-TRX-FUS-pagA vào chủng trung gian E. coli DH5α gian E. coli DH5α
Sản phẩm lai được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5α nhờ sốc nhiệt ở 42oC trong 60 giây và nuôi trong môi trường LB ở nhiệt độ 37oC. Nhờ bộ máy tổng hợp của vi khuẩn, plasmid tái tổ hợp được tạo ra với số lượng lớn các bản sao. Tiến hành cấy trải dịch nuôi trên môi trường LPA có chứa kháng sinh kanamycin (25 mg/ml) với nồng độ cuối là 50 μg/ml. Sau khi nuôi qua đêm ở 37oC trên đĩa petri xuất hiện khuẩn lạc màu trắng, thể hiện ở hình sau:
3.4.3.2. Kiểm tra sự tồn tại của pagA trong plasmid tái tổ hợp
Lựa chọn các khuẩn lạc mọc trên đĩa petri, tiến hành tách chiết DNA plasmid và điện di. Kết quả thể hiện ở hình 3.11
Hình 3.11.Khuẩn lạc của E. coli DH5α trên môi trường LBA Hình 3.10. Điện di sau khi thôi gel trên
gel 1% agarose
Giếng 1: Gen pagA thu đƣợc sau khi đƣợc xử
lý bằng BamHI và XhoI
Giếng 2: Vector pET-TRX-FUS thu đƣợc sau
khi đƣợc xử lý bằng BamHI và XhoI
Giếng 3: Thang DNA chuẩn (Fermentas)
1 2 3 2,2 5,8 kb kb 7 5 3 2
Dựa trên hình 3.12 có thể dự đoán DNA plasmid của dòng khuẩn lạc số 2 và 6 mang gen pagA. Do đó, plasmid tái tổ hợp của hai dòng khuẩn lạc 2 và 6 tiếp tục được kiểm tra bằng phương pháp cắt bằng enzyme giới hạn và PCR.
a. Phƣơng pháp cắt giới hạn BamHI và XhoI
Chúng tôi sử dụng enzyme giới hạn là BamHI và XhoI. Kết quả điện di sản phẩm cắt trên gel agarose thể hiện ở hình sau:
Kết quả trên hình cho thấy, mỗi giếng xuất hiện hai băng, băng ở trên có kích thước tương tự kích thước của vector pET-TRX-FUS (5,8 kb), băng ở
Hình 3.12. Điện di plasmid từ các khuẩn lạc E. coli DH5a trên gel 1 % agarose Giếng 2,6: Dòng khuẩn lạc mang gen pagA
Giếng 1,3,4,5,7,8: Dòng khuẩn lạc không mang gen pagA (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
7 5 3 2 5,8 2,2 1 2 3 4 kb kb
Hình 3.13. Điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp trên gel 1 % agarose
Giếng 1, 2: Sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp
Giếng 3: Vector pET- TRX - FUS
dưới có kích thước khoảng 2,2 kb tương tự kích thước của đoạn gen pagA. Do đó sản phẩm cắt DNA plasmid của dòng khuẩn lạc này tạo ra 2 băng là hoàn toàn phù hợp lý thuyết.
b.Kiểm tra sự có mặt của gen trong vector biểu hiện bằng phương pháp PCR
Sau khi tách chiết DNA plasmid của chủng biểu hiện
E. coli DH5α, tiến hành kiểm tra sự có mặt của đoạn gen
pagA bằng phản ứng PCR. Phản ứng này được thực hiện sử dụng cặp mồi BA1 và BA2, có sự tham gia của
emzyme Taq polymerase và dNTPs với chu trình nhiệt thích hợp đã được thiết kế. Sản phẩm PCR của gen pagA được kiểm tra bằng điện di trên gel 1 % agarose, thể hiện ở hình sau:
Kết quả ở hình 3.14 chỉ cho một băng duy nhất có kích thước ~ 2,2 kb. Băng sản phẩm này tương tự băng sản phẩm thu được từ DNA plasmid tái tổ hợp pCR2.1 pagA.
3.4.3.3. Kiểm tra khung đọc của vector tái tổ hợp pET-TRX-FUS-pagA
Dữ liệu về trình tự của dòng plasmid tái tổ hợp thu được được sử dụng để dịch mã ra acid amin trên lý thuyết nhằm kiểm tra khung đọc của gen sử dụng công cụ EXPASY. Kết quả cho thấy trình tự gen pagA được dịch mã thông, bao gồm 735 acid amin:
10 20 30 40 50 60 EVKQENRLLN ESESSSQGLL GYYFSDLNFQ APMVVTSSTT GDLSIPSSEL ENIPSENQYF
70 80 90 100 110 120 QSAIWSGFIK VKKSDEYTFA TSADNHVTMW VDDQEVINKA SNSNKIRLEK GRLYQIKIQY
Hình 3.14. Điện di sản phẩm PCR trên gel 1 % agarose
Giếng 1: DNA plasmid pCR2.1-pagA Giếng 2,3: DNA plasmid từ dòng 2 và 6
Giếng 4: Thang DNA chuẩn (Fermentas)
kb
2,2 kb 2
130 140 150 160 170 180 QREDPTEKGL DFKLYWTDSQ NKKEVISSDN LQLPELKQKS SNSKKRRSTS AGPTVPDRDN
190 200 210 220 230 240 DGIPDSLEVE GYTVDVKNKR TFLSPWISNI HEKKGLTKYK SSPEKWSTAS DPYSDFEKVT
250 260 270 280 290 300 GRIDKNVSPE ARHPLVAAYP IVHVDMENII LSKNEDQSTQ NTDSQTRTIS KNTSTSRTHT
310 320 330 340 350 360 SEVHNGAEVH ASFFDIGGSV SAGFSNSNSS TVAIDHSLSL AGERTWAETM GLNTADTARL
370 380 390 400 410 420 NANIRYVNTG TAPIYNVLPT TSLVLGKNQT LATIKAKENQ LSQILAPNNY YPSKNLAPIA
430 440 450 460 470 480 LNAQDDFSST PITMNYNQFL ELEKTKQLRL DTDQVYNGIA TYNFENGRVR VDTGSNWSEV
490 500 510 520 530 540 LPQIQETTAR IIFNGKDLNL VERRIAAVNP SDPLETTKPD MTLKEALKIA FGFNEPNNGL
550 560 570 580 590 600 QYQGKDITEF DFNFDQQTSQ NIKNQLAELN ATNIYTVLDK IKLNAKMNIL IRDKRFHYDR (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
610 620 630 640 650 660 NNIAVGADES VVKEAHREVI NSSTEGLLLN IDKDIRKILS GYIVEIEDTE GLKEVINDRY
670 680 690 700 710 720 DMLNISSLQQ DGKTFIDFKK YNDKLPLYIS NPNYKVNVYA VTKENTIINP SENGDTSTNG
730 IKRILIFSKK GYEIG
Hình 3.15. Trình tự acid amin của protein kháng nguyên bảo vệ trên lý thuyết
3.4.3.4. Biến nạp plasmid tái tổ hợp pET-TRX-pagA vào E. coli BL21 (DE3)
Sau khi thu được vector biểu hiện tái tổ hợp mang gen pagA với khung đọc chuẩn, tiến hành biến nạp vào E. coli BL21 bằng phương pháp sốc nhiệt. Dịch nuôi lắc 37oC (1 giờ) được cấy trải trên môi trường LBA có chứa knamycin. Sau khi ủ qua đêm ở 37oC, trên đĩa petri xuất hiện các khuẩn lạc như hình 3.16:
Như vậy, đã tạo được chủng E. coli BL21 mang vector tái tổ hợp pET-
TRX-FUS mang gen pagA.
3.4.4. Nghiên cứu biểu hiện gen pagA trong E. coli BL21 3.4.4.1. Nghiên cứu điều kiện biểu hiện gen pagA 3.4.4.1. Nghiên cứu điều kiện biểu hiện gen pagA
Tiến hành lựa chọn bốn khuẩn lạc bất kì và nuôi hoạt hóa qua đêm trong môi trường LB lỏng có bổ sung kanamycin ở 37oC. Sau đó, dịch nuôi được cấy chuyển 1 % và nuôi tiếp để OD đạt 0,5-0,8 (khoảng 2-3 giờ). Một phần mẫu được hút ra làm đối chứng, phần còn lại cảm ứng IPTG với nồng độ cuối là 1 mM. Cả 2 mẫu đối chứng và cảm ứng được nuôi ở 37oC với tốc độ 200 vòng/phút trong 4 giờ. Thu mẫu và điện di trên gel 12,6 % polyacrylamid (Hình 3.17):
Protein tái tổ hợp Thioredoxin-pagA-Histag được hình thành bởi sự kết nối 3 protein với nhau: TrxTag với 127 acid amin, PA với 735 acid amin và đuôi Histag với 6 acid amin, tổng cộng là 868 acid amin với trọng lượng phân tử tính theo lý thuyết khoảng 98 kDa.
Hình 3.17. Điện di sự biểu hiện protein PA trên gel 12,6 % polyacrylamide Giếng 1, 3, 6, 8 : Mẫu sau cảm ứng bằng IPTG
Giếng 2, 4, 7, 9: Mẫu không cảm ứng
Giếng 5: Thang DNA chuẩn (Fermentas)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 kDa 116 45 66 35 25 18,4
Hình 3.17 cho thấy, ở các giếng có cảm ứng 1, 3, 6, 8 xuất hiện một băng protein lạ có kích thước khoảng gần 100 kDa như tính toán lý thuyết. Như vậy có thể sơ bộ kết luận rằng quá trình biểu hiện đã thành công dưới sự kiểm soát của promotor T7. Ngoài ra, dòng được cảm ứng ở giếng số 3 cho kết quả biểu hiện tốt nhất. Do đó, lựa chọn dòng này cho những nghiên cứu tiếp theo.
Để xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp protein tái tổ hợp PA, tế bào E. coli BL21 được cấy lắc ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau là: 25, 28, 30, 37oC. Sau 4 giờ nuôi cấy, thu tế bào. Điện di mẫu trên gel 12,6 % polyacrylamide để tìm ra nhiệt độ tốt nhất cho quá trình biểu hiện. Kết quả được thể hiện trên hình 3.18:
Hình 3.18 cho thấy biểu hiện ở 30oC và 37oC tế bào cảm ứng tổng hợp protein là tốt như nhau nhưng do 37oC là nhiệt độ thích hợp cho enzyme protease hoạt động sẽ thuỷ phân protein tái tổ hợp mới được tạo thành. Do đó, lựa chọn nhiệt độ biểu hiện ở 30oC là tốt nhất.
Hình 3.18. Điện di protein tái tổ hợp PA theo nhiệt độ trên gel 12,6 % polyacrylamide
Giếng 1: Mẫu trƣớc cảm ứng
Giếng 2: Thang protein chuẩn (Fermentas),
Giếng 3, 5, 7, 9: Mẫu cảm ứng ở 25, 28, 30, 37oC
Giếng 4, 6, 8, 10: Mẫu không cảm ứng ở 25, 28, 30, 37oC
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 98 kDa kDa 66 45 35 25 18,4 14,4 116
Nồng độ IPTG là yếu tố quan trọng trong việc cảm ứng biểu hiện protein tái tổ hợp PA. Do đó, sau khi lựa chọn nhiệt độ cảm ứng là 30oC, tiến hành xác định nồng độ IPTG tối thiểu cho quá trình lên men sinh tổng hợp PA. Kết quả nghiên cứu các nồng độ cảm ứng IPTG là 0,2; 0,5; 0,7; 1; 2 mM đã thử nghiệm cho thấy sự tổng hợp protein PA là tối ưu khi được cảm ứng ở 1mM.
Thời gian lên men cũng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới năng suất biểu hiện protein tái tổ hợp PA, bởi vì lượng protein được tổng hợp ở các thời điểm là rất khác nhau. Nếu thu sớm thì protein chưa được tổng hợp tối đa, nếu thu muộn sẽ sinh ra các chất ức chế và phân hủy protein mới được tạo thành. Chính vì vậy, chúng tôi cố định nhiệt độ cảm ứng là 30oC, nồng độ IPTG cảm ứng là 1 mM và khảo sát sự biểu hiện protein tái tổ hợp theo thời gian (0, 1, 2, 3, 4, 5 giờ). Mẫu được xử lý và điện di kiểm tra trên gel 12,6 % polyacrylamide. Kết quả thể hiện ở hình 3.20: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
25 116 98 kDa 35 66 45 1 2 3 4 5 6 7
Hình 3.19. Điện di biểu hiện protein tái tổ hợp PA theo nồng độ IPTG
Giếng 1-7: Mẫu trƣớc cảm ứng, thang protein chuẩn (Fermentas), mẫu không cảm ứng, 0,2; 0,5; 0,7; 1; 2 mM
Hình 3.20 cho thấy lượng protein tái tổ hợp tạo thành tăng theo thời gian. Lượng protein được tạo thành tại thời điểm 4 giờ tương tự như ở thời điểm 5 giờ. Nếu tiếp tục kéo dài thời gian lên men, lượng protein tái tổ hợp có thể giảm đi do quá trình lên men tạo ra các chất ức chế và phân hủy. Do đó, lựa chọn thời điểm 4 giờ để thu mẫu nhằm đảm bảo chất lượng sản phẩm và chi phí lên men.
3.4.4.2. Xác định khả năng hoà tan và định khu của protein
Để kiểm tra khả năng hòa tan của protein kháng nguyên bảo vệ PA, làm cơ sở cho các nghiên cứu về sau, chúng tôi đã nghiên cứu khả năng hòa tan của protein PA qua việc so sánh khả năng tổng hợp protein trong pha tan và phần cặn sau khi siêu âm phá tế bào. Sau khi cảm dòng E. coli BL21 (DE3) mang vector tái tổ hợp ở 30oC, 1 mM IPTG. Ly tâm thu tế bào và phá tế bào bằng siêu âm trong đệm xử lý mẫu. Phần tan và phần cặn được sau đó xử lý và điện di trên gel 12,6 % polyacrylamide (Hình 3.21):
Hình 3.20. Điện di mẫu protein PA theo thời gian trên gel 12,6 % polyacrylamide
Giếng 1: Mẫu trƣớc cảm ứng
Giếng 2: Thang protein chuẩn chuẩn (Fermentas)
Giếng 3, 4, 5, 6, 7, 8: lần lƣợt là mẫu đƣợc cảm ứng với IPTG lúc 0,1 2 3,4,5 giờ
98 kDa 116 66 45 35 25 14,4 18,4 kDa 1 2 3 4 5 6 7 8
Khả năng hòa tan của PA tái tổ hợp được đánh giá trên cơ sở so sánh giữa pha tan và pha không tan trong cùng một lần cảm ứng. Pha tan là phần dịch nổi, pha không tan (thể vùi-inclusion body) là phần cặn thu được sau khi phá tế bào bằng siêu âm và ly tâm. Kết quả hình 3.21 cho ta thấy protein tái tổ hợp PA được tổng hợp chủ yếu ở dạng thể vùi. Theo tài liệu đã công bố thì hiện tượng này xảy ra khá phổ biến đối với các gen được biểu hiện quá mạnh trong E. coli dẫn đến hiện tượng các sản phẩm protein tạo ra không kịp gấp nếp (folding) và tập trung với nhau trong nguyên sinh chất của tế bào vi khuẩn dưới dạng các hạt thể vùi. Do đó không thể tinh sạch ở điều kiện bình thường mà phải siêu âm phá tế bào và tinh sạch trong điều kiện biến tính.
3.5. Tinh chế protein tái tổ hợp bằng cột sắc kí ái lực Probond Nikel Resin
Do protein tái tổ hợp có đuôi ái lực 6x histidine, vì vậy sử dụng cột sắc kí ái lực, chất giá được dùng để nhồi cột là Ni(+). 8ml dịch phá tế bào được ly tâm, phần dịch nổi có chứa protein tái tổ hợp được đưa lên cột. Các protein có đuôi Histag có ái lực với Ni(+) và được bám chặt chất giá trên cột. Sau khi rửa cột bằng đệm rửa các protein của E. coli sẽ bị trôi khỏi cột chỉ còn các protein có ái lực được giữ lại. Sau đó protein có ái lực được đẩy ra khỏi cột
1 2 3 4 5 6 98 kDa 116 66 45 35 25 18,4 14,4 kDa 98 kDa
Hình 3.21. Điện di protein tan và không tan trên gel 12,6 % polyacrylamide Giếng 1: Mẫu cảm ứng lúc 4h
Giếng 2: Mẫu trƣớc cảm ứng Giếng 3: Mẫu không cảm ứng
Giếng 4: Thang protein chuẩn (Fermentas) Giếng 5: protein hoà tan
nhờ đệm đẩy, chúng tôi thu được 7 phân đoạn, mỗi phân đoạn 1 ml. Sau khi tinh chế protein được kiểm tra độ sạch bằng điện di trên gel 12,6 % polyacrylamide (Hình 3.22):
Sau khi tinh sạch trên hình 3.22 chỉ xuất hiện một băng tương đương với kích thước của protein tái tổ hợp trước khi tinh sạch (98 kDa). Như vậy, protein tái tổ hợp PA đã được tinh sạch thành công bằng cột sắc ký ái lực Histag.
3.6. Khẳng định sự biểu hiện của protein tái tổ hợp PA bằng phản ứng Western blot Western blot
Để khẳng định protein được biểu hiện và ghi nhận trên SDS-PAGE là dạng dung hợp Thioredoxin, chúng tôi sử dụng phương pháp Western blot với kháng thể đặc hiệu kháng Thioredoxin đánh dấu bằng HPR (Hình 3.25a). Ngoài ra, sau khi thu nhận kháng thể đặc hiệu kháng PA và kháng thể kháng bệnh than tự nhiên trên thỏ, tiến hành kiểm tra phản ứng với protein tái tổ hợp bằng Western blot (Hình 3.25b,c). Cả 3 phản ứng lai được phát hiện bằng kháng thể anti-rabbit IgG-HPR. Kết quả cho thấy có một vạch (98 kDa) tương đương với kích thước protein tái tổ hợp theo tính toán lý thuyết. Như vậy, dựa trên các kết quả Western blot và khả năng kích thích cơ thể sản sinh đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể kháng bệnh than cho phép kết luận protein có trọng lượng khoảng 98 kDa đã được biểu hiện chính là protein dung hợp Thioredoxin-PA-Histag. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 116 98 kDa 66 6 45 6 kDa
Hình 3.22. Điện di protein sau khi tinh sạch trên gel 12,6 % polyacrylamide Giếng 1-7: Các phân đoạn đẩy ra khỏi cột (7- 1)
Giếng 8: Protein trƣớc khi tinh sạch Giếng 9: Mẫu không cảm ứng
Ngoài ra, khả năng phản ứng của protein tái tổ hợp PA với kháng thể kháng bệnh than tự nhiên cho thấy protein PA có khả năng sử dụng làm kit phát hiện kháng thể kháng PA trong huyết thanh bệnh nhân. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
1 2 3 4 5 6 kDa 170 72 130 95 55 98 kDa
Hình 3.22a. Phản ứng của protein tái tổ hợp PA gắn Thioredoxin với kháng thể kháng Thioredoxin trên màng lai PVDF
Giếng 3. Thang chuẩn protein
Hình 3.22c. Phản ứng western blot giữa protein tái tổ hợp PA với kháng thể kháng PA tự nhiên
Giếng 1: Mẫu huyết thanh thỏ sau khi gây miễn dịch