3.4.4.1. Nghiên cứu điều kiện biểu hiện gen pagA
Tiến hành lựa chọn bốn khuẩn lạc bất kì và nuôi hoạt hóa qua đêm trong môi trường LB lỏng có bổ sung kanamycin ở 37oC. Sau đó, dịch nuôi được cấy chuyển 1 % và nuôi tiếp để OD đạt 0,5-0,8 (khoảng 2-3 giờ). Một phần mẫu được hút ra làm đối chứng, phần còn lại cảm ứng IPTG với nồng độ cuối là 1 mM. Cả 2 mẫu đối chứng và cảm ứng được nuôi ở 37oC với tốc độ 200 vòng/phút trong 4 giờ. Thu mẫu và điện di trên gel 12,6 % polyacrylamid (Hình 3.17):
Protein tái tổ hợp Thioredoxin-pagA-Histag được hình thành bởi sự kết nối 3 protein với nhau: TrxTag với 127 acid amin, PA với 735 acid amin và đuôi Histag với 6 acid amin, tổng cộng là 868 acid amin với trọng lượng phân tử tính theo lý thuyết khoảng 98 kDa.
Hình 3.17. Điện di sự biểu hiện protein PA trên gel 12,6 % polyacrylamide Giếng 1, 3, 6, 8 : Mẫu sau cảm ứng bằng IPTG
Giếng 2, 4, 7, 9: Mẫu không cảm ứng
Giếng 5: Thang DNA chuẩn (Fermentas)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 kDa 116 45 66 35 25 18,4
Hình 3.17 cho thấy, ở các giếng có cảm ứng 1, 3, 6, 8 xuất hiện một băng protein lạ có kích thước khoảng gần 100 kDa như tính toán lý thuyết. Như vậy có thể sơ bộ kết luận rằng quá trình biểu hiện đã thành công dưới sự kiểm soát của promotor T7. Ngoài ra, dòng được cảm ứng ở giếng số 3 cho kết quả biểu hiện tốt nhất. Do đó, lựa chọn dòng này cho những nghiên cứu tiếp theo.
Để xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp protein tái tổ hợp PA, tế bào E. coli BL21 được cấy lắc ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau là: 25, 28, 30, 37oC. Sau 4 giờ nuôi cấy, thu tế bào. Điện di mẫu trên gel 12,6 % polyacrylamide để tìm ra nhiệt độ tốt nhất cho quá trình biểu hiện. Kết quả được thể hiện trên hình 3.18:
Hình 3.18 cho thấy biểu hiện ở 30oC và 37oC tế bào cảm ứng tổng hợp protein là tốt như nhau nhưng do 37oC là nhiệt độ thích hợp cho enzyme protease hoạt động sẽ thuỷ phân protein tái tổ hợp mới được tạo thành. Do đó, lựa chọn nhiệt độ biểu hiện ở 30oC là tốt nhất.
Hình 3.18. Điện di protein tái tổ hợp PA theo nhiệt độ trên gel 12,6 % polyacrylamide
Giếng 1: Mẫu trƣớc cảm ứng
Giếng 2: Thang protein chuẩn (Fermentas),
Giếng 3, 5, 7, 9: Mẫu cảm ứng ở 25, 28, 30, 37oC
Giếng 4, 6, 8, 10: Mẫu không cảm ứng ở 25, 28, 30, 37oC
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 98 kDa kDa 66 45 35 25 18,4 14,4 116
Nồng độ IPTG là yếu tố quan trọng trong việc cảm ứng biểu hiện protein tái tổ hợp PA. Do đó, sau khi lựa chọn nhiệt độ cảm ứng là 30oC, tiến hành xác định nồng độ IPTG tối thiểu cho quá trình lên men sinh tổng hợp PA. Kết quả nghiên cứu các nồng độ cảm ứng IPTG là 0,2; 0,5; 0,7; 1; 2 mM đã thử nghiệm cho thấy sự tổng hợp protein PA là tối ưu khi được cảm ứng ở 1mM.
Thời gian lên men cũng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới năng suất biểu hiện protein tái tổ hợp PA, bởi vì lượng protein được tổng hợp ở các thời điểm là rất khác nhau. Nếu thu sớm thì protein chưa được tổng hợp tối đa, nếu thu muộn sẽ sinh ra các chất ức chế và phân hủy protein mới được tạo thành. Chính vì vậy, chúng tôi cố định nhiệt độ cảm ứng là 30oC, nồng độ IPTG cảm ứng là 1 mM và khảo sát sự biểu hiện protein tái tổ hợp theo thời gian (0, 1, 2, 3, 4, 5 giờ). Mẫu được xử lý và điện di kiểm tra trên gel 12,6 % polyacrylamide. Kết quả thể hiện ở hình 3.20:
25 116 98 kDa 35 66 45 1 2 3 4 5 6 7
Hình 3.19. Điện di biểu hiện protein tái tổ hợp PA theo nồng độ IPTG
Giếng 1-7: Mẫu trƣớc cảm ứng, thang protein chuẩn (Fermentas), mẫu không cảm ứng, 0,2; 0,5; 0,7; 1; 2 mM
Hình 3.20 cho thấy lượng protein tái tổ hợp tạo thành tăng theo thời gian. Lượng protein được tạo thành tại thời điểm 4 giờ tương tự như ở thời điểm 5 giờ. Nếu tiếp tục kéo dài thời gian lên men, lượng protein tái tổ hợp có thể giảm đi do quá trình lên men tạo ra các chất ức chế và phân hủy. Do đó, lựa chọn thời điểm 4 giờ để thu mẫu nhằm đảm bảo chất lượng sản phẩm và chi phí lên men.
3.4.4.2. Xác định khả năng hoà tan và định khu của protein
Để kiểm tra khả năng hòa tan của protein kháng nguyên bảo vệ PA, làm cơ sở cho các nghiên cứu về sau, chúng tôi đã nghiên cứu khả năng hòa tan của protein PA qua việc so sánh khả năng tổng hợp protein trong pha tan và phần cặn sau khi siêu âm phá tế bào. Sau khi cảm dòng E. coli BL21 (DE3) mang vector tái tổ hợp ở 30oC, 1 mM IPTG. Ly tâm thu tế bào và phá tế bào bằng siêu âm trong đệm xử lý mẫu. Phần tan và phần cặn được sau đó xử lý và điện di trên gel 12,6 % polyacrylamide (Hình 3.21):
Hình 3.20. Điện di mẫu protein PA theo thời gian trên gel 12,6 % polyacrylamide
Giếng 1: Mẫu trƣớc cảm ứng
Giếng 2: Thang protein chuẩn chuẩn (Fermentas) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Giếng 3, 4, 5, 6, 7, 8: lần lƣợt là mẫu đƣợc cảm ứng với IPTG lúc 0,1 2 3,4,5 giờ
98 kDa 116 66 45 35 25 14,4 18,4 kDa 1 2 3 4 5 6 7 8
Khả năng hòa tan của PA tái tổ hợp được đánh giá trên cơ sở so sánh giữa pha tan và pha không tan trong cùng một lần cảm ứng. Pha tan là phần dịch nổi, pha không tan (thể vùi-inclusion body) là phần cặn thu được sau khi phá tế bào bằng siêu âm và ly tâm. Kết quả hình 3.21 cho ta thấy protein tái tổ hợp PA được tổng hợp chủ yếu ở dạng thể vùi. Theo tài liệu đã công bố thì hiện tượng này xảy ra khá phổ biến đối với các gen được biểu hiện quá mạnh trong E. coli dẫn đến hiện tượng các sản phẩm protein tạo ra không kịp gấp nếp (folding) và tập trung với nhau trong nguyên sinh chất của tế bào vi khuẩn dưới dạng các hạt thể vùi. Do đó không thể tinh sạch ở điều kiện bình thường mà phải siêu âm phá tế bào và tinh sạch trong điều kiện biến tính.
3.5. Tinh chế protein tái tổ hợp bằng cột sắc kí ái lực Probond Nikel Resin
Do protein tái tổ hợp có đuôi ái lực 6x histidine, vì vậy sử dụng cột sắc kí ái lực, chất giá được dùng để nhồi cột là Ni(+). 8ml dịch phá tế bào được ly tâm, phần dịch nổi có chứa protein tái tổ hợp được đưa lên cột. Các protein có đuôi Histag có ái lực với Ni(+) và được bám chặt chất giá trên cột. Sau khi rửa cột bằng đệm rửa các protein của E. coli sẽ bị trôi khỏi cột chỉ còn các protein có ái lực được giữ lại. Sau đó protein có ái lực được đẩy ra khỏi cột
1 2 3 4 5 6 98 kDa 116 66 45 35 25 18,4 14,4 kDa 98 kDa
Hình 3.21. Điện di protein tan và không tan trên gel 12,6 % polyacrylamide Giếng 1: Mẫu cảm ứng lúc 4h
Giếng 2: Mẫu trƣớc cảm ứng Giếng 3: Mẫu không cảm ứng
Giếng 4: Thang protein chuẩn (Fermentas) Giếng 5: protein hoà tan
nhờ đệm đẩy, chúng tôi thu được 7 phân đoạn, mỗi phân đoạn 1 ml. Sau khi tinh chế protein được kiểm tra độ sạch bằng điện di trên gel 12,6 % polyacrylamide (Hình 3.22):
Sau khi tinh sạch trên hình 3.22 chỉ xuất hiện một băng tương đương với kích thước của protein tái tổ hợp trước khi tinh sạch (98 kDa). Như vậy, protein tái tổ hợp PA đã được tinh sạch thành công bằng cột sắc ký ái lực Histag.
3.6. Khẳng định sự biểu hiện của protein tái tổ hợp PA bằng phản ứng Western blot Western blot
Để khẳng định protein được biểu hiện và ghi nhận trên SDS-PAGE là dạng dung hợp Thioredoxin, chúng tôi sử dụng phương pháp Western blot với kháng thể đặc hiệu kháng Thioredoxin đánh dấu bằng HPR (Hình 3.25a). Ngoài ra, sau khi thu nhận kháng thể đặc hiệu kháng PA và kháng thể kháng bệnh than tự nhiên trên thỏ, tiến hành kiểm tra phản ứng với protein tái tổ hợp bằng Western blot (Hình 3.25b,c). Cả 3 phản ứng lai được phát hiện bằng kháng thể anti-rabbit IgG-HPR. Kết quả cho thấy có một vạch (98 kDa) tương đương với kích thước protein tái tổ hợp theo tính toán lý thuyết. Như vậy, dựa trên các kết quả Western blot và khả năng kích thích cơ thể sản sinh đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể kháng bệnh than cho phép kết luận protein có trọng lượng khoảng 98 kDa đã được biểu hiện chính là protein dung hợp Thioredoxin-PA-Histag. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 116 98 kDa 66 6 45 6 kDa
Hình 3.22. Điện di protein sau khi tinh sạch trên gel 12,6 % polyacrylamide Giếng 1-7: Các phân đoạn đẩy ra khỏi cột (7- 1)
Giếng 8: Protein trƣớc khi tinh sạch Giếng 9: Mẫu không cảm ứng
Ngoài ra, khả năng phản ứng của protein tái tổ hợp PA với kháng thể kháng bệnh than tự nhiên cho thấy protein PA có khả năng sử dụng làm kit phát hiện kháng thể kháng PA trong huyết thanh bệnh nhân.
1 2 3 4 5 6 kDa 170 72 130 95 55 98 kDa
Hình 3.22a. Phản ứng của protein tái tổ hợp PA gắn Thioredoxin với kháng thể kháng Thioredoxin trên màng lai PVDF
Giếng 3. Thang chuẩn protein
Hình 3.22c. Phản ứng western blot giữa protein tái tổ hợp PA với kháng thể kháng PA tự nhiên
Giếng 1: Mẫu huyết thanh thỏ sau khi gây miễn dịch Giếng 4: Thang protein chuẩn
98 kDa 170 130 95 72 55 1 2 3 4 170 130 95 98 kDa 1 2 3 4 5 6 7 8 72 55 kDa
Hình 3.22b. Phản ứng của protein tái tổ hợp PA gắn Thioredoxin với kháng thể kháng PA trên màng lai PVDF
Giếng 7: Thang protein chuẩn (Fermentas)
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
1. Đã tách dòng và đọc trình tự gen pagA, gen pagA được đọc
trình tự có kích thước 2210 bp, độ tương đồng 99 % so với gen
pagA của B. anthracis trên ngân hàng gen quốc tế (M22589) 404322.
pagA 9 vị trí thay đổi nucleotide. Trong đó có 2 vị trí nucleotide thay đổi đã được công bố và 7 vị trí thay đổi nucleotide mới.
2. Đã thiết kế thành công vector biểu hiện pET-TRX-FUS-pagA trong đó vector pET-TRX có chứa trình tự mã hóa protein Thioredoxin và 6 acid amin Histidine.
3. Đã biểu hiện thành công gen pagA mã hoá kháng nguyên bảo vệ PA của vi khuẩn B. anthracis trong E. coli BL21, trong đó nhiệt độ thích hợp cho sự cảm ứng tổng hợp protein PA là 30oC, nồng độ IPTG là 1mM và thời gian kết thúc cảm ứng là 4 giờ. Protein PA tái tổ hợp có khối lượng phân tử 98 kDa.
4. Đã tinh sạch được protein PA bằng cột Probond Nikel Resin.
5. Đã kiểm tra khả năng phản ứng của protein PA tái tổ hợp với kháng thể đặc hiệu kháng PA và kháng thể tự nhiên kháng bệnh than
Western blot. Protein PA do vi khuẩn Bacillus anthracis sinh ra có phản ứng miễn dịch với kháng thể PA tái tổ hợp.
KIẾN NGHỊ
Tiếp tục nghiên cứu vùng 4 của kháng nguyên bảo vệ PA. Theo các tài liệu đã công bố gần đây, vùng 4 là vùng liên kết thụ thể và chứa vị trí epitop quyết định kháng nguyên. Vùng này được chứng minh là có khả năng đáp ứng miễn dịch.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. ê Bacillus anthracis . 2003. NXB KHKT, Hà Nội. 150 – 154. 2. , Ngu Bacillus anthracis . . NXB KHKT. 42– 45. 3. Bacillus anthracis 870.
Tài liệu tiếng Anh
4. Ash C, Farrow JA, Dorsch M, Stackebrandt E, Collins MD (1991).
Comparative analysis of Bacillus anthracis, Bacillus cereus, and related species on the basis of reverse transcriptase sequencing of 16S rRNA. Int J Syst Bacteriol.41(3): 343 – 346.
5. Brachman PS, Gold H, Plotkin SA, Fekety FR, Werrin M, Ingraham NR (1962). Field Evaluation of a Human Anthrax Vaccine. Am J
Public Health Nations Health. 52 (4): 632 – 645.
6. Brossier F, Weber–Levy M, Mock M, Sirard JC (2000). Role of toxin
functional domains in anthrax pathogenesis. Infect Immun. 68 (4): 1781 – 1786.
7. Dixon TC, Meselson M, Guillemin J, Hanna PC (1999). Anthrax. N
Engl J Med. 341 (11): 815 – 826.
8. Ezzell JW Jr, Abshire TG (1988). Immunological analysis of cell–associated antigens of Bacillus anthracis. Infect Immun. 56 (2): 349 – 56.
9. Gupta P, Waheed SM, Bhatnagar R (1999). Expression and purification of the recombinant protective antigen of Bacillus anthracis. Protein Expr Purif. 16 (3): 369 – 376.
10. Green BD, Battisti L, Koehler TM, Thorne CB, Ivins BE (1985).
Demonstration of a capsulee plasmid in Bacillus anthracis. Infect Immun. 49 (2): 291 – 297.
11. Haines Bw, Klein F, Lincoln Re (1965). Quantitative assay for crude
anthrax toxins. J Bacteriol. 89: 74 – 83. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
12. Hoffmaster AR, Koehler TM (1999). Control of virulence gene
expression in Bacillus anthracis. J Appl Microbiol. (2): 279 –281. 13. Hoffmaster AR, Koehler TM. (1999). Autogenous regulation of the
Bacillus anthracis pag operon. J Bacteriol. 181 (15): 4485 – 4492. 14. Koehler TM, Dai Z, Kaufman–Yarbray M (1994). Regulation of the
Bacillus anthracis protective antigen gene: CO2 and a trans–acting element activate transcription from one of two promoters. J Bacteriol. 176 (3): 586 – 595.
15. Leppla SH (1982). Anthrax toxin edema factor: a bacterial adenylate cyclase that increases cyclic AMP concentrations of eukaryotic cells. Proc Natl Acad Sci U S A.79 (10): 3162 – 3166.
16. Little SF, Knudson GB. (1986). Comparative efficacy of Bacillus anthracis live spore vaccine and protective antigen vaccine against anthrax in the guinea pig. Infect Immun. 52 (2): 509 – 512.
17. Meselson M, Guillemin J, Hugh–Jones M, Langmuir A, Popova I, Shelokov A, Yampolskaya O (1994). The Sverdlovsk anthrax
18. Mock M, Fouet A (2001). Anthrax. Annu Rev Microbiol. 55: 647 – 671. 19. Petosa C, Collier RJ, Klimpel KR, Leppla SH, Liddington RC (1997).
Crystal structure of the anthrax toxin protective antigen. Nature. 385 (6619): 833 – 838.
20. Price LB, Hugh–Jones M, Jackson PJ, Keim P (1999). Genetic
diversity in the protective antigen gene of Bacillus anthracis. J Bacteriol.181 (8): 2358 – 2362.
21. Puziss M, Manning Lc, Lynch Jw, Barclaye, Abelow I, Wright Gg
(1963). Large–scale production of protective antigen of Bacillus anthracis in anaerobic cultures. Appl Microbiol. 11: 330 – 334.
23. Puziss M, Wright Gg (1954). Studies on immunity in anthrax. IV.
Factors influencing elaboration of the protective antigen of Bacillus antracis in chemically defined media. J Bacteriol. 68 (4): 474 – 482. 24. Puziss M, Wright Gg (1963). Studies on immunity in anthrax. X. Gel–
adsorbed protective antigen for immunization of man. J Bacteriol. 85: 230 – 236.
25. Towbin H, Staehelin T, Gordon J. (1992). Electrophoretic transfer of
proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Biotechnology. 24: 145 – 149.
26. Ristroph JD, Ivins BE. (1983). Elaboration of Bacillus anthracis antigens in a new, defined culture medium. Infect Immun. 39 (1): 483 – 486.
27. Strange Re, Thorne Cb (1958). Further purification studies on the
protective antigen of Bacillus anthracis produced in vitro. J Bacteriol. 76 (2): 192 – 202.
28. Welkos SL, Lowe JR, Eden–McCutchan F, Vodkin M, Leppla SH, Schmidt JJ. (1988). Sequence and analysis of the DNA encoding
29. Wright Gg, Green Tw, Kanode Rg Jr (1954). Studies on immunity in anthrax. V. Immunizing activity of alum–precipitated protective antigen. J Immunol. 73 (6): 387 – 391.
30. Sambroo J and Rusell WD (2001). Molecular cloning: A laboratory
manual , 3rd , ed. Cold spring harbor laboratory press, cold spring harbor NY.
Các trang web
31 http://textbookofbacteriology.net/themicrobialworld/anthrax.html 32. http://en.wikipedia.org/wiki/2001_anthrax_attacks
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});