Protein tái tổ hợp được biểu hiện ở dạng inclusion bodies. Sử dụng phương pháp tinh sạch bằng Kit ProBond TM
của hãng invitrogen có thể chuyển protein từ dạng không hoà tan thành dạng hoà tan, điều này hết sức quan trọng cho mục đích tạo ra các protein tái tổ hợp để phát triển các Kit chuẩn đoán. Quá trình tinh sạch được thực hiện theo các bước sau:
Bƣớc 1: Chuẩn bị dịch tế bào trƣớc khi đƣa lên cột - Làm tan hoàn toàn Guanidinium Lysis Buffer
- Ly tâm huyền dịch tế bào (100 ml) đã kiểm tra khả năng biểu hiện, thu cặn tế bào.
- Hoà lại tế bào trong 8 ml Guanidinium Lysis Buffer, pH= 7,8.
- Làm tan cặn tế bào bằng cách lắc nhẹ trên máy vortex ở nhiệt độ phòng trong thời gian 5 phút.
- Phá màng tế bào bằng máy siêu âm trong thời gian 15 phút – 20 phút, để huyền dịch tế bào trên đá, phá tế bào bằng máy Labsonic
- Ly tâm dịch phá tế bào ở tốc độ 1000 vòng trong thời gian 15 phút, thu dịch nổi, loại xác tế bào.
Bƣớc 2: Chuẩn bị cột
- Lắc đều để proBond TM Resin tạo thành huyền dịch đồng nhất
- Dùng pipet hút 2ml huyền dịch Nikel Resin đưa lên cột tinh sạch dung tích 10ml
- Rửa cột bằng 6 ml nước khủ ion
- Bổ sung 6 ml Denaturing Binding Buffer
- Hoà lại Resin bằng cách đảo cột bằng tay, sau đó để cột lại theo phương thẳng đứng để Resin lắng xuống. Bổ sung 6 ml Denaturing Binding Buffer
- Hoà lại Resin bằng cách đảo cột bằng tay, sau đó để cột lại theo phương thẳng đứng để Resin lắng xuống và cho dịch chảy qua cột và cho dịch chảy qua cột
Bƣớc 3 : Đƣa protein lên cột và đẩy ra khỏi cột - Đưa 8 ml dung tích phá tế bào sau ly tâm lên cột
- Lắc nhẹ cột trên máy vortex trong thời gian 15 phút - 30 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó để cột lại theo phuong thẳng đứng để huyền dịch Nikel Resin lắng xuống và cho dịch chảy qua cột.
- Rửa cột bằng 4ml Denaturing Binding Buffer, pH= 7,8, lặp lại 3 lần. - Rửa cột bằng 4ml Denaturing Wash Buffer, lặp lại 3 lần
- Rửa cột bằng 8 ml Native Wash Buffer
- Đẩy protein tái tổ hợp ra khổi cột bằng 8 ml Native Elusion Buffer, thu 12 phân đoạn, mỗi phân đoạn 1ml
- Kiểm tra protein sau tinh sạch bằng điện di trên gel polyacrylamide 12,6%.