Western blot
Để khẳng định protein được biểu hiện và ghi nhận trên SDS-PAGE là dạng dung hợp Thioredoxin, chúng tôi sử dụng phương pháp Western blot với kháng thể đặc hiệu kháng Thioredoxin đánh dấu bằng HPR (Hình 3.25a). Ngoài ra, sau khi thu nhận kháng thể đặc hiệu kháng PA và kháng thể kháng bệnh than tự nhiên trên thỏ, tiến hành kiểm tra phản ứng với protein tái tổ hợp bằng Western blot (Hình 3.25b,c). Cả 3 phản ứng lai được phát hiện bằng kháng thể anti-rabbit IgG-HPR. Kết quả cho thấy có một vạch (98 kDa) tương đương với kích thước protein tái tổ hợp theo tính toán lý thuyết. Như vậy, dựa trên các kết quả Western blot và khả năng kích thích cơ thể sản sinh đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể kháng bệnh than cho phép kết luận protein có trọng lượng khoảng 98 kDa đã được biểu hiện chính là protein dung hợp Thioredoxin-PA-Histag. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 116 98 kDa 66 6 45 6 kDa
Hình 3.22. Điện di protein sau khi tinh sạch trên gel 12,6 % polyacrylamide Giếng 1-7: Các phân đoạn đẩy ra khỏi cột (7- 1)
Giếng 8: Protein trƣớc khi tinh sạch Giếng 9: Mẫu không cảm ứng
Ngoài ra, khả năng phản ứng của protein tái tổ hợp PA với kháng thể kháng bệnh than tự nhiên cho thấy protein PA có khả năng sử dụng làm kit phát hiện kháng thể kháng PA trong huyết thanh bệnh nhân.
1 2 3 4 5 6 kDa 170 72 130 95 55 98 kDa
Hình 3.22a. Phản ứng của protein tái tổ hợp PA gắn Thioredoxin với kháng thể kháng Thioredoxin trên màng lai PVDF
Giếng 3. Thang chuẩn protein
Hình 3.22c. Phản ứng western blot giữa protein tái tổ hợp PA với kháng thể kháng PA tự nhiên
Giếng 1: Mẫu huyết thanh thỏ sau khi gây miễn dịch Giếng 4: Thang protein chuẩn
98 kDa 170 130 95 72 55 1 2 3 4 170 130 95 98 kDa 1 2 3 4 5 6 7 8 72 55 kDa
Hình 3.22b. Phản ứng của protein tái tổ hợp PA gắn Thioredoxin với kháng thể kháng PA trên màng lai PVDF
Giếng 7: Thang protein chuẩn (Fermentas)
1. Đã tách dòng và đọc trình tự gen pagA, gen pagA được đọc
trình tự có kích thước 2210 bp, độ tương đồng 99 % so với gen
pagA của B. anthracis trên ngân hàng gen quốc tế (M22589) 404322.
pagA 9 vị trí thay đổi nucleotide. Trong đó có 2 vị trí nucleotide thay đổi đã được công bố và 7 vị trí thay đổi nucleotide mới.
2. Đã thiết kế thành công vector biểu hiện pET-TRX-FUS-pagA trong đó vector pET-TRX có chứa trình tự mã hóa protein Thioredoxin và 6 acid amin Histidine.
3. Đã biểu hiện thành công gen pagA mã hoá kháng nguyên bảo vệ PA của vi khuẩn B. anthracis trong E. coli BL21, trong đó nhiệt độ thích hợp cho sự cảm ứng tổng hợp protein PA là 30oC, nồng độ IPTG là 1mM và thời gian kết thúc cảm ứng là 4 giờ. Protein PA tái tổ hợp có khối lượng phân tử 98 kDa.
4. Đã tinh sạch được protein PA bằng cột Probond Nikel Resin.
5. Đã kiểm tra khả năng phản ứng của protein PA tái tổ hợp với kháng thể đặc hiệu kháng PA và kháng thể tự nhiên kháng bệnh than
Western blot. Protein PA do vi khuẩn Bacillus anthracis sinh ra có phản ứng miễn dịch với kháng thể PA tái tổ hợp.
KIẾN NGHỊ
Tiếp tục nghiên cứu vùng 4 của kháng nguyên bảo vệ PA. Theo các tài liệu đã công bố gần đây, vùng 4 là vùng liên kết thụ thể và chứa vị trí epitop quyết định kháng nguyên. Vùng này được chứng minh là có khả năng đáp ứng miễn dịch.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. ê Bacillus anthracis . 2003. NXB KHKT, Hà Nội. 150 – 154. 2. , Ngu Bacillus anthracis . . NXB KHKT. 42– 45. 3. Bacillus anthracis 870.
Tài liệu tiếng Anh (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
4. Ash C, Farrow JA, Dorsch M, Stackebrandt E, Collins MD (1991).
Comparative analysis of Bacillus anthracis, Bacillus cereus, and related species on the basis of reverse transcriptase sequencing of 16S rRNA. Int J Syst Bacteriol.41(3): 343 – 346.
5. Brachman PS, Gold H, Plotkin SA, Fekety FR, Werrin M, Ingraham NR (1962). Field Evaluation of a Human Anthrax Vaccine. Am J
Public Health Nations Health. 52 (4): 632 – 645.
6. Brossier F, Weber–Levy M, Mock M, Sirard JC (2000). Role of toxin
functional domains in anthrax pathogenesis. Infect Immun. 68 (4): 1781 – 1786.
7. Dixon TC, Meselson M, Guillemin J, Hanna PC (1999). Anthrax. N
Engl J Med. 341 (11): 815 – 826.
8. Ezzell JW Jr, Abshire TG (1988). Immunological analysis of cell–associated antigens of Bacillus anthracis. Infect Immun. 56 (2): 349 – 56.
9. Gupta P, Waheed SM, Bhatnagar R (1999). Expression and purification of the recombinant protective antigen of Bacillus anthracis. Protein Expr Purif. 16 (3): 369 – 376.
10. Green BD, Battisti L, Koehler TM, Thorne CB, Ivins BE (1985).
Demonstration of a capsulee plasmid in Bacillus anthracis. Infect Immun. 49 (2): 291 – 297.
11. Haines Bw, Klein F, Lincoln Re (1965). Quantitative assay for crude
anthrax toxins. J Bacteriol. 89: 74 – 83.
12. Hoffmaster AR, Koehler TM (1999). Control of virulence gene
expression in Bacillus anthracis. J Appl Microbiol. (2): 279 –281. 13. Hoffmaster AR, Koehler TM. (1999). Autogenous regulation of the
Bacillus anthracis pag operon. J Bacteriol. 181 (15): 4485 – 4492. 14. Koehler TM, Dai Z, Kaufman–Yarbray M (1994). Regulation of the
Bacillus anthracis protective antigen gene: CO2 and a trans–acting element activate transcription from one of two promoters. J Bacteriol. 176 (3): 586 – 595.
15. Leppla SH (1982). Anthrax toxin edema factor: a bacterial adenylate cyclase that increases cyclic AMP concentrations of eukaryotic cells. Proc Natl Acad Sci U S A.79 (10): 3162 – 3166.
16. Little SF, Knudson GB. (1986). Comparative efficacy of Bacillus anthracis live spore vaccine and protective antigen vaccine against anthrax in the guinea pig. Infect Immun. 52 (2): 509 – 512.
17. Meselson M, Guillemin J, Hugh–Jones M, Langmuir A, Popova I, Shelokov A, Yampolskaya O (1994). The Sverdlovsk anthrax
18. Mock M, Fouet A (2001). Anthrax. Annu Rev Microbiol. 55: 647 – 671. 19. Petosa C, Collier RJ, Klimpel KR, Leppla SH, Liddington RC (1997).
Crystal structure of the anthrax toxin protective antigen. Nature. 385 (6619): 833 – 838.
20. Price LB, Hugh–Jones M, Jackson PJ, Keim P (1999). Genetic
diversity in the protective antigen gene of Bacillus anthracis. J Bacteriol.181 (8): 2358 – 2362.
21. Puziss M, Manning Lc, Lynch Jw, Barclaye, Abelow I, Wright Gg
(1963). Large–scale production of protective antigen of Bacillus anthracis in anaerobic cultures. Appl Microbiol. 11: 330 – 334.
23. Puziss M, Wright Gg (1954). Studies on immunity in anthrax. IV. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Factors influencing elaboration of the protective antigen of Bacillus antracis in chemically defined media. J Bacteriol. 68 (4): 474 – 482. 24. Puziss M, Wright Gg (1963). Studies on immunity in anthrax. X. Gel–
adsorbed protective antigen for immunization of man. J Bacteriol. 85: 230 – 236.
25. Towbin H, Staehelin T, Gordon J. (1992). Electrophoretic transfer of
proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Biotechnology. 24: 145 – 149.
26. Ristroph JD, Ivins BE. (1983). Elaboration of Bacillus anthracis antigens in a new, defined culture medium. Infect Immun. 39 (1): 483 – 486.
27. Strange Re, Thorne Cb (1958). Further purification studies on the
protective antigen of Bacillus anthracis produced in vitro. J Bacteriol. 76 (2): 192 – 202.
28. Welkos SL, Lowe JR, Eden–McCutchan F, Vodkin M, Leppla SH, Schmidt JJ. (1988). Sequence and analysis of the DNA encoding
29. Wright Gg, Green Tw, Kanode Rg Jr (1954). Studies on immunity in anthrax. V. Immunizing activity of alum–precipitated protective antigen. J Immunol. 73 (6): 387 – 391.
30. Sambroo J and Rusell WD (2001). Molecular cloning: A laboratory
manual , 3rd , ed. Cold spring harbor laboratory press, cold spring harbor NY.
Các trang web
31 http://textbookofbacteriology.net/themicrobialworld/anthrax.html 32. http://en.wikipedia.org/wiki/2001_anthrax_attacks