Nghiên cứu phát hiện người mang gen gây bệnh, chẩn đoán trước sinh ứng dụng trong việc sàng lọc bệnh nhược cơ Duchenne Becker ở cộng đồng

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI NCKH CẤP BỘ NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN NGƯỜI MANG GEN GÂY BỆNH, CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH ỨNG DỤNG TRONG SÀNG LỌC BỆNH LOẠN DƯỠNG CƠ DUCHENNE/BECKER Ở CỘNG ĐỒNG CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: TS TRẦN VÂN KHÁNH CƠ QUAN CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI: TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI CƠ QUAN CHỦ QUẢN: BỘ Y TẾ THỜI GIAN THỰC HIỆN: Từ tháng 11/2007 đến tháng 11/2009 (Quyết định phê duyệt số 4066 /QĐ-BYT ngày 25 tháng 10 năm2007) 8520 HÀ NỘI, NĂM 2009 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI NCKH CẤP BỘ NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN NGƯỜI MANG GEN GÂY BỆNH, CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH ỨNG DỤNG TRONG SÀNG LỌC BỆNH LOẠN DƯỠNG CƠ DUCHENNE/BECKER Ở CỘNG ĐỒNG CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: TS TRẦN VÂN KHÁNH CƠ QUAN CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI: TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI CƠ QUAN CHỦ QUẢN: BỘ Y TẾ THỜI GIAN THỰC HIỆN: Từ tháng 11/2007 đến tháng 11/2009 (Quyết định phê duyệt số 4066 /QĐ-BYT ngày 25 tháng 10 năm2007) Tổng kinh phí thực đề tài: 470.000.000 đ Trong kinh phí SNKH: 470.000.000 đ HÀ NỘI, NĂM 2009 DANH SÁCH CÁ NHÂN VÀ ĐƠN VỊ THAM GIA THỰC HIỆN ĐỀ TÀI 1- Tên đề tài: “Nghiên cứu phát người mang gen gây bệnh, chẩn đoán trước sinh ứng dụng sàng lọc bệnh loạn dưỡng Duchenne/Becker cộng đồng” 2- Thời gian thực hiện: Tháng 11/2007 – tháng 11/2009 3- Cơ quan chủ trì đề tài: Trường Đại học Y Hà Nội 4- Bộ chủ quản: Bộ Y Tế 5- Danh sách người tham gia: STT Họ Tên, Học hàm, Học vị Cơ quan công tác TS Trần Vân Khánh Trung tâm nghiên cứu Gen-Protein, ĐHYHN PGS.TS Tạ Thành Văn Bộ mơn Hóa sinh, ĐHYHN PGS.TS Nguyễn Thị Hà Bộ mơn Hóa sinh, ĐHYHN PGS TS Nguyễn Thị Hoàn Bệnh viện Nhi Trung ương ThS Nguyễn Thị Băng Sương Bộ mơn Hóa sinh, ĐHY Huế BS Đỗ Ngọc Hải Khoa Hóa sinh, bv Việt-Tiệp, Hải Phịng BS.Nguyễn Thị Thanh Hải BSNT Bộ mơn Hóa sinh, ĐHYHN CN Nguyễn Thị Phương Thúy Bộ mơn Hóa sinh, ĐHYHN CN Nguyễn Hồng Việt Trung tâm nghiên cứu Gen-Protein, ĐHYHN TL HIỆU TRƯỞNG PGS.TS Nguyễn Ngọc Hùng MỤC LỤC Trang PHẦN A- TÓM TẮT CÁC KẾT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI Kết bật đề tài 1.1 Đóng góp đề tài 1.2 Kết cụ thể 2 Áp dụng vào thực tiễn sản xuất đời sống xã hội 3 Đánh giá thực đề tài đối chiếu với đề cương nghiên cứu phê duyệt 3.1 Tiến độ 3.2 Thực mục tiêu nghiên cúu .4 3.3 Các sản phẩm tạo so với dự kiến Bản đề cương 3.4 Đánh giá việc sử dụng kinh phí PHẦN B NỘI DUNG BÁO CÁO CHI TIẾT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Đặt vấn đề Chương Tổng quan tài liệu 1.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh DMD 1.2 Đặc điểm bệnh DMD 16 1.3 Cơ chế bệnh sinh dạng đột biến gen dystrophin 20 1.4 Các phương pháp phát đột biến gen dystrophin 30 1.5 Chẩn đoán trước sinh bệnh DMD 38 Chương 2: Đối tượng phương pháp nghiên cứu 40 2.1 Đối tượng nghiên cứu 40 2.2 Trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất 40 2.3 Phương pháp nghiên cứu .42 2.4 Vấn đề đạo đức nghiên cứu 49 Chương 3: Kết nghiên cứu 50 3.1 Kết tách chiết DNA 50 3.2 Kết tách chiết RNA tổng số tổng hợp cDNA 51 3.3 Kết xác định đột biến đoạn gen dystrophin mức độ RNA 52 3.4 Kết xác định người lành mang gen bệnh 58 3.5 Kết chẩn đoán trước sinh bệnh DMD 68 Chương Bàn luận 73 4.1 Qui trình tách chiết DNA, RNA tổng hợp cDNA 73 4.2 Xác định đột biến gen dystrophin 76 4.3 Xác định người lành mang gen bệnh 86 4.4 Chẩn đoán trước sinh bệnh DMD 95 Kết luận 101 Kiến nghị 102 Tài liệu tham khảo Phụ lục PHẦN A TÓM TẮT CÁC KẾT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI KẾT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI 1.1 Đóng góp đề tài - Bệnh loạn dưỡng Duchenne (Duchenne Muscular Dystrophy - DMD) bệnh lý di truyền có tần suất mắc bệnh cao (1/3500 trẻ trai), biểu lâm sàng với yếu nặng dần theo thời gian thường tử vong độ tuổi 20 DMD bệnh di truyền lặn liên kết nhiễm sắc thể X Dạng đột biến đoạn gen phổ biến nhất, chiếm 60-65% Các nghiên cứu cho thấy đột biến đoạn gen thường tập trung vào hai vùng trọng điểm (hotspot) vùng trung tâm gen (exon 43-60) vùng tận 5’ (exon 1-19) Tại Việt Nam, nghiên cứu công bố xác định đột biến đoạn gen mức độ DNA ưu tiên sử dụng 19-25 cặp mồi khuyếch đại 19-25 exon hai vùng trọng điểm, đột biến rải rác khắp 79 exon chiều dài gen dystrophin; vậy, nghiên cứu bỏ sót tổn thương Trên phân tử DNA, exon nằm xen kẽ với intron có kích thước lớn; để khuyếch đại 79 exon mức độ DNA, người ta phải thiết kế 79 cặp mồi bắt cặp đặc hiệu hai đầu exon Ngược lại, cấu trúc mRNA gen dystrophin, đoạn intron bị cắt bỏ 79 exon nằm liên tục Do đó, để khuyếch đại tồn chiều dài mRNA chứa 79 exon, người ta cần dùng 15 cặp mồi đặc hiệu Nghiên cứu thành cơng việc xác định đột biến xóa đoạn gen dystrophin mức độ mRNA tất vị trí gen (79 exon), khơng hai vùng hotspot nghiên cứu trước (gồm 19-25 exon) Song song, với việc cần sử dụng 15 cặp mồi đặc hiệu tác giả tiết kiệm nhiều thời gian, công sức tiền - Hiện nay, bệnh DMD chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu Các nhà khoa học giới cho việc nghiên cứu phát người lành mang gen bệnh (mẹ, chị em gái, dì) gia đình bệnh nhân, chẩn đoán trước sinh cho người mẹ có nguy cao để tư vấn di truyền biện pháp nhằm phòng ngừa bệnh DMD hạn chế tỷ lệ sinh bị bệnh cộng đồng Từ kết xác định đột biến bệnh nhân sử dụng kỹ thuật multiplex PCR định lượng, nghiên cứu đề tài phát người nữ lành mang gen bệnh gia đình bệnh nhân Trên sở đó, tác giả bước đầu thực chẩn đoán trước sinh cho thai phụ có mang gen bệnh để phát thai nhi có đột biến đoạn gen dystrophin đưa lời khuyên di truyền: thai phụ giữ thai hay nên hủy thai Kết đề tài nghiên cứu không mang ý nghĩa khoa học thực tiễn cao, mà cịn có tính nhân văn rõ nét 1.2 Tóm tắt kết cụ thể đề tài - Các tác giả chuẩn hóa tốt qui trình kỹ thuật xác định đột biến đoạn gen dystrophin mức độ mRNA phát người lành mang gen (quy trình tách chiết DNA RNA tổng số từ máu ngoại vi, qui trình RT-PCR tổng hợp cDNA, nested-PCR xác định đột biến, nhân dịng gen giải trình tự gen, phản ứng multiplex PCR kết hợp phân tích phả hệ); qui trình chẩn đốn trước sinh bệnh DMD (chọc hút dịch ối, nuôi cấy tế bào dịch ối, kỹ thuật tách DNA tế bào ối xác định giới tính thai nhi) - Phát 20/40 bệnh nhân DMD có đột biến đoạn; 13 bệnh nhân có đột biến đoạn vùng trung tâm (exon 43-60) chiếm 65%; 03 bệnh nhân có đột biến đoạn vùng tận 5’, chiếm 15%; 02 bệnh nhân có đột biến kéo dài từ vùng tận 5’ đến vùng trung tâm, chiếm 10% 02 bệnh nhân có đột biến đoạn vùng hotspot, chiếm 10% Như vậy, nghiên cứu thành công việc xác định đột biến xóa đoạn gen dystrophin mức độ mRNA tất vị trí gen (79 exon), không hai vùng hotspot nghiên cứu trước (gồm 19-25 exon) Song song, với việc cần sử dụng 15 cặp mồi đặc hiệu tác giả tiết kiệm nhiều thời gian, công sức tiền - Từ kết xác định đột biến đoạn gen bệnh nhân, nghiên cứu tiếp tục thực để xác định người mang gen (thể dị hợp tử) người nữ có quan hệ huyết thống với bệnh nhân Sử dụng kỹ thuật multiplex PCR định lượng, phân tích gen dystrophin 48 thành viên nữ 30 gia đình bệnh nhân DMD có đột biến đoạn phát hiện: 21/48 thành viên nữ người lành mang gen bệnh, chiếm 43,8%; số người mẹ dị hợp tử 15/30, chiếm 50% vậy, 50% bệnh nhân DMD có đột biến phát sinh mà nhận gen bệnh từ người mẹ - Các tác giả tiến hành chẩn đoán trước sinh cho 02 người mẹ mang thai số 15 người mẹ có kiểu gen dị hợp tử: 01 thai nhi nam 01 thai nhi nữ, 02 thai nhi khơng có đột biến đoạn gen dystrophin Hai người mẹ khuyên giữ thai ÁP DỤNG VÀO THỰC TIỄN SẢN XUẤT VÀ ĐỜI SỐNG XÃ HỘI - Trên sở kết đề tài, nghiên cứu áp dụng chẩn đoán xác định đột biến đoạn gen cho bệnh nhân DMD với giá thành, thời gian công sức tiết kiệm nhiều; mặt khác, kết thu tiền đề cho nghiên cứu nhằm phát đột biến khác gen dystrophin gây bệnh DMD đột biến điểm, đột biến lặp đoạn Từ đó, chẩn đốn bệnh DMD xác đầy đủ - Kết đề tài sở cho việc phát người lành mang gen, người mẹ dị hợp tử chẩn đoán trước sinh để tư vấn di truyền nhằm hạn chế việc sinh bị bệnh Những công việc có ý nghĩa khoa học nhân văn lớn, giảm gánh nặng tinh thần vật chất cho gia đình người bệnh, cho xã hội góp phần nâng cao chất lượng sống cho người dân - Đây nghiên cứu tiến hành đầu tiện Việt Nam Bởi vậy, sau nghiệm thu kết đề tài chuyển giao kỹ thuật cho phòng nghiên cứu Sinh học phân tử bệnh viện Sản Nhi để áp dụng rộng rãi chẩn đoán bệnh DMD chẩn đoán trước sinh, tư vấn di truyền bệnh DMD ĐÁNH GIÁ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI ĐỐI CHIẾU VỚI ĐỀ CƯƠNG NGHIEN CỨU ĐÃ ĐƯỢC PHÊ DUYỆT 3.1 Tiến độ: Thực đề tài nghiệm thu thời gian qui định 3.2 Thực mục tiêu nghiên cứu: Thực đầy đủ mục tiêu nghiên cứu Bản đề cương Bộ phê duyệt 3.3 Các sản phẩm tạo so với dự kiến Bản đề cương: - Các qui trình để thu RNA tinh khiết từ máu ngoại vi, DNA từ tế bào nước ối; kỹ thuật RT-PCR, nested PCR, nhân dịng giải trình tự gen, multiplex PCR chuẩn hóa, có tính ổn định cao với mức độ tin cậy tốt - Đào tạo 01 cao học, 01 Bác sỹ Nội trú bệnh viện 01 nghiên cứu sinh: + Đỗ Ngọc Hải, Luận văn Thạc sỹ 2007, “Nghiên cứu đột biến đoạn gen dystrophin mức độ mRNA bệnh nhân loạn dưỡng Duchenne” Đạt loại xuất sắc + Nguyễn Thị Băng Sương, Luận án Tiến sỹ Y học 2007-2010, “Xác định đột biến đoạn gen dystrophin gây bệnh loạn dưỡng Duchenne mức độ mRNA phát người lành mang gen bệnh” Đã bảo vệ luận án cấp sở chờ định Bộ GD-ĐT cho bảo vệ luận án cấp nhà nước + Nguyễn Thị Thanh Hải, Luận văn tốt nghiệp Bác sỹ Nội trú Khóa 31 (20072010),“Nghiên cứu qui trình chẩn đốn trước sinh bệnh loạn dưỡng Duchenne“ Đang triển khai - Kết nghiên cứu đề tài công bố 05 báo tạp chí khoa học ngành Y dự kiến đăng 01 báo tạp chí quốc tế (đang hồn thiện) + Nguyễn Thị Băng Sương, Trần Vân Khánh, Nguyễn Thị Hoàn, Nguyễn Thị Hà, Tạ Thành Văn, (2008), Phát người lành mang gen bệnh loạn dưỡng Duchenne PCR định lượng, Tạp chí Nghiên cứu Y học, 59 (6), 1-10 + Trần Vân Khánh, Tạ Thành Văn, (2008), Phát đột biến làm thay đổi q trình hồn thiện mRNA gen dystrophin, Tạp chí Nghiên cứu Y học, 54 (2), 19-23 + Nguyễn Thị Băng Sương, Trần Vân Khánh, Nguyễn Thị Hà, Tạ Thành Văn, (2009), Xác định đột biến đoạn gen dystrophin mức độ mRNA, Tạp chí Y học thành phố Hồ Chí Minh, Tập 13, Phụ số 2, 98-104 + Trần Vân Khánh, Nguyễn Thị Băng Sương, Lê Thị Hương Lan, Nguyễn Thị Hà, Tạ Thành Văn, (2009), Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử chẩn đoán phát người lành mang gen bệnh loạn dưỡng Duchenne, Tạp chí Y học thành phố Hồ Chí Minh, Tập 13, Phụ số 2, 66-72 + Đỗ Ngọc Hải, Trần Vân Khánh, Nguyễn Thị Băng Sương, Nguyễn Hoàng Việt, Nguyễn Thị Phương Thúy, Tạ Thành Văn, (2009), Nghiên cứu đột biến đoạn gen dystrophin mức độ mRNA bệnh nhân loạn dưỡng Duchenne, Tạp chí Nghiên cứu Y học, 61 (2), 16-23 3.4 Đánh giá việc sử dụng kinh phí: - Tổng kinh phí đề tài: 470.000.000 đ - Kinh phí chi hồn ứng: 450.000.000 đ - Kinh phí cịn lại: 20.000.000 đ (để nghiệm thu cấp) Bệnh nhân Hồng T.X., tuổi Giả phì đại bắp chân Bệnh nhân Nguyễn Đ.T., 12 tuổi Mất khả lại lúc 12 tuổi Việc sử dụng hình ảnh đồng ý gia đình trẻ KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ GEN DYSTROPHIN Bệnh nhân mã số 20 Bệnh nhân mã số 28 Bệnh nhân mã số 30 Bệnh nhân mã số 33 Bệnh nhân mã số 35 Bệnh nhân mã số 39 Bệnh nhân mã số 43 Bệnh nhân mã số 48 Bệnh nhân mã số 51 Bệnh nhân mã số 55 KẾT QUẢ PHÁT HIỆN NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH Gia đình bệnh nhân mã số (đột biến đoạn từ exon – 34) Đối chứng nữ Đối chứng nam E41 E51 E13 1500 E41 15 1500 15 E51 E13 E9 E9 Bệnh nhân Mẹ bệnh nhân E41 E41 15 E51 1500 1500 15 E51 E13 E9 Mũi tên vị trí exon bị đột biến đoạn Gia đình bệnh nhân mã số 9, đột biến đoạn exon 40-43 Chứng nam Chứng nữ E37 E37 15 41 1500 41 13 15 13 1500 43 43 Bệnh nhân Mẹ bệnh nhân Chị gái bệnh nhân E37 E37 15 1500 E37 15 13 41 1500 1500 15 13 41 13 43 43 Bệnh nhân mã số 14, đột biến đoạn exon 3-13 Chứng nữ Chứng nam 41 E4 41 E4 15 1500 51 13 1500 15 51 13 Bệnh nhân Mẹ bệnh nhân 41 41 15 E4 1500 15 51 1500 13 51 Bệnh nhân mã số 18, đột biến đoạn exon 2-8 Đối chứng nam Đối chứng nữ 41 1500 1500 15 41 E9 11 15 13 E9 11 13 Bệnh nhân Em gái bệnh nhân Mẹ bệnh nhân 41 1500 15 41 13 41 15 1500 1500 15 13 E9 11 E9 11 13 Gia đình bệnh nhân mã số 28, đột biến đoạn exon 45-50 Đối chứng nam Đối chứng nữ 1500 15 1500 15 41 49 41 E46 49 E46 Mẹ bệnh nhân Bệnh nhân 1500 1500 15 15 41 41 49 E46 Gia đình bệnh nhân mã số 30, đột biến đoạn exon 50-52 Đối chứng nam Đối chứng nữ 15 15 51 1500 1500 49 41 E52 51 49 E52 15 41 Bệnh nhân Mẹ bệnh nhân 15 1500 1500 49 41 49 41 51 E52 Gia đình bệnh nhân mã số 37, đột biến đoạn exon 10-17 Chứng nam Chứng nữ 1500 1500 15 41 13 15 E46 13 E46 41 Bệnh nhân Mẹ bệnh nhân 1500 15 15 1500 41 E46 41 13 E46 Gia đình bệnh nhân mã số 42, đột biến exon 49-52 Đối chứng nam Đối chứng nữ 41 51 15 41 51 E46 15 E46 1500 49 1500 49 Bệnh nhân Mẹ bệnh nhân 41 15 41 E46 15 1500 E46 1500 51 49 Gia đình bệnh nhân mã số 43, đột biến exon 48, 49 50 Chứng nam Chứng nữ 1500 1500 15 15 E50 51 51 E50 49 41 49 41 Bệnh nhân Dì bệnh nhân Mẹ bệnh nhân 1500 15 15 1500 1500 15 E50 51 51 51 41 E50 49 41 49 41 Gia đình bệnh nhân mã số 48, đột biến đoạn từ exon 33 đến 43 Đối chứng nữ Đối chứng nam E37 41 E37 41 15 51 49 49 51 1500 1500 15 Bệnh nhân Mẹ bệnh nhân 41 E37 49 51 15 51 49 1500 15 1500 PHỤ LỤC MẪU BỆNH ÁN ĐỂ THẬP SỐ LIỆU VÀ DANH SÁCH ĐỐI TƯỢNG THAM GIA NGHIÊN CỨU BỆNH ÁN Mã số: THÔNG TIN VỀ BỆNH NHÂN Họ tên: Tuổi: .Nam/Nữ: Địa chỉ: Số điện thoại liên lạc: Chẩn đoán lâm sàng DMD vào tháng năm Khám lâm sàng: Giai đoạn I Giai đoạn II Giai đoạn III Xét nghiệm: - CK: - Điện đồ: - Kết sinh thiết (nếu có): - Các Xét nghiệm khác (nếu có): TIỀN SỬ GIA ĐÌNH - Tiền sử gia đình: - Sơ đồ phả hệ: THƠNG TIN VỀ CÁC THÀNH VIÊN NỮ GIA ĐÌNH BỆNH NHÂN - Mẹ bệnh nhân: tuổi: CK máu: - Chị em gái bệnh nhân: Họ tên Tuổi CK Họ tên Tuổi CK - Chị em gái mẹ bệnh nhân: Họ tên Tuổi CK Họ tên Tuổi CK - Con gái chị em gái mẹ bệnh nhân (dì bệnh nhân): Họ tên Tuổi CK Họ tên Tuổi CK ... BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI NCKH CẤP BỘ NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN NGƯỜI MANG GEN GÂY BỆNH, CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH ỨNG DỤNG TRONG SÀNG LỌC BỆNH LOẠN DƯỠNG CƠ DUCHENNE/ BECKER Ở CỘNG ĐỒNG CHỦ NHIỆM... vấn di truyền Xuất phát từ thực tiễn đó, đề tài nghiên cứu ? ?Nghiên cứu phát người mang gen gây bệnh, chẩn đoán trước sinh ứng dụng sàng lọc bệnh loạn dưỡng Duchenne/ Becker cộng đồng? ?? tiến hành với... lượng, nghiên cứu đề tài phát người nữ lành mang gen bệnh gia đình bệnh nhân Trên sở đó, tác giả bước đầu thực chẩn đoán trước sinh cho thai phụ có mang gen bệnh để phát thai nhi có đột biến đoạn gen