Nghiên cứu tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu kháng nguyên her2 trong escherichia coli

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LÊ THỊ MINH PHÚC NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG THỂ TÁI TỔ HỢP ĐẶC HIỆU KHÁNG NGUYÊN HER2 TRONG ESCHERICHIA COLI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2010 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LÊ THỊ MINH PHÚC NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG THỂ TÁI TỔ HỢP ĐẶC HIỆU KHÁNG NGUYÊN HER2 TRONG ESCHERICHIA COLI Ngành: Sinh học Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS TS LÊ QUANG HUẤN Hà Nội - 2010 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Trước hết tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới PGS TS Lê Quang Huấn người thầy hướng dẫn, bảo tận tình từ bước tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ, dạy bảo tận tình chú, anh chị bạn đồng nghiệp phịng Cơng nghệ tế bào động vật – Viện Công nghệ Sinh học Nhân dịp xin cảm ơn thầy, cô giáo Trường Đại học Thái Nguyên; Viện Sinh thái tài nguyên sinh vật Viện Công nghệ Sinh học dạy bảo giúp đỡ thời gian học tập, nghiên cứu Bên cạnh tơi xin cảm ơn gia đình bạn bè tơi tạo điều kiện động viên tơi suốt q trình học tập hoàn thành luận văn Hà Nội, ngày 30 tháng 08 năm 2010 Học viên Lê Thị Minh Phúc Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU Error! Bookmark not defined Chƣơng I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Error! Bookmark not defined BỆNH UNG THƯ VÚ Error! Bookmark not defined 1 Giới thiệu chung bệnh ung thư ung thư vúError! Bookmark not defined 1.2 Tình hình UTV giới Việt Nam……………………………….… 1.3 Triệu chứng bệnh sinh Error! Bookmark not defined 1.4 Phân loại UTV Error! Bookmark not defined 1.5 Điều trị Error! Bookmark not defined KHÁNG NGUYÊN HER2 ĐẶC HIỆU TẾ BÀO UTVError! Bookmark not defined 2.1 Khái quát gen HER2 kháng nguyên HER2Error! Bookmark not defined 2.2 Cấu trúc HER2 Error! Bookmark not defined 2.3 Mơ hình chế gây UTV HER2 Error! Bookmark not defined 2.4 Các nghiên cứu đột biến HER2 Error! Bookmark not defined 2.5 HER2 UTV Error! Bookmark not defined KHÁI QUÁT CHUNG VỀ KHÁNG THỂ - KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNGError! Bookm 3.1 Cấu tạo chung kháng thể (Immunoglobulin)Error! Bookmark not defined 3.2 Kháng thể đơn dòng Error! Bookmark not defined 3.3 Kháng thể đơn chuỗi – Mảnh kháng thể Error! Bookmark not defined KỸ THUẬT PHAGE DISPLAY Error! Bookmark not defined 4.1 Giới thiệu chung Error! Bookmark not defined 4.2 Thực khuẩn thể M13 Error! Bookmark not defined 4.3 Tạo thư viện phage display Error! Bookmark not defined 4.4 Sàng lọc với thư viện phage Error! Bookmark not defined Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn CÁC HẠT NANO VÀNG VÀ ỨNG DỤNG Error! Bookmark not defined 5.1 Tổng hợp hạt nano vàng Error! Bookmark not defined 5.2 Các ứng dụng hạt nano Error! Bookmark not defined Chƣơng II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUError! Bookmark not define VẬT LIỆU Error! Bookmark not defined 1.1 Sinh phẩm Error! Bookmark not defined 1.2 Mồi Error! Bookmark not defined 1.3 Hóa chất trang thiết bị Error! Bookmark not defined PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Error! Bookmark not defined 2.1 Các phương pháp thao tác với DNA Error! Bookmark not defined 2.2 Các phương pháp thao tác với protein tái tổ hợpError! Bookmark not defined 2.3 Các kỹ thuật phage display Error! Bookmark not defined Chƣơng III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined KẾT QUẢ TẠO KHÁNG NGUYÊN HER2 TÁI TỔ HỢPError! Bookmark not def 1.1 Kết tách dòng gen mã hóa kháng nguyên HER2Error! Bookmark not defined 1.2 Tách chiết DNA plasmid xác định trình tự nucleotide gen HER2Error! Bookmark 1.3 Kết thiết kế vector biểu kháng nguyên HER2Error! Bookmark not defined 1.4 Kết biểu tinh kháng nguyên HER2Error! Bookmark not defined KẾT QUẢ GÂY MIỄN DỊCH GÀ BẰNG HER2Error! Bookmark not defined KẾT QUẢ TẠO THƢ VIỆN scFv VÀ CHỌN DÒNG scFv ĐẶC HIỆU HER2 Error! Bookmark not defined 3.1 Kết thu nhận gen mã hóa scFv từ gà đặc hiệu HER2………………… 56 3.2 Kết tạo kháng thể phage đặc hiệu HER2 61 KẾT QUẢ GẮN KHÁNG THỂ VỚI HẠT VÀNG ĐỂ TẠO KIT CHẨN ĐOÁN Error! Bookmark not defined Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 4.1 Chức hóa mặt sinh học hạt nano vàng protein BSA……63 4.2 Kết xác định phổ hấp thụ phức hệ kháng thểvàng…………………65 KẾT LUẬN Error! Bookmark not defined KIẾN NGHỊ Error! Bookmark not defined PHỤ LỤC Error! Bookmark not defined THUẬT NGỮ VIẾT TẮT STT Ký hiệu Tên đầy đủ aa Amino acid Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Amp Ampicillin AuNPs Gold Nanoparticles (Các hạt nano vàng) bp Base pair (Cặp bazơnitơ) ddNTP Dideoxynucleotide dNTP Deoxynucleotide DNA Acid deoxyribonucleic EDTA Ethylen Diamine Tetra acetic Acid ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay (Thí nghiệm hấp phụ miễn dịch gắn enzyme) EtBr Ethidium Bromide 10 HRP Horseradish peroxidase 11 IPTG Isopropyl--D-Thiogalactopyranoside 12 Ka Kanamycin 13 Kb Kilo base pair 14 kDa Kilo Dalton 15 KTĐD Kháng thể đơn dịng 16 LB Mơi trường Lauria Betani 17 NIR Near Infrared Region 18 NPs Nanoparticles 19 OD Optical Density (mật độ quang học) 20 PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) 21 PEG Polyethylen Glycol 22 SDS Sodium Dodecyl Sulphate 23 TAE Tris - Acetate - EDTA 24 TE Tris - EDTA 25 UTV ung thư vú 26 v/p Vịng/phút Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI MỞ ĐẦU HER2 loại thụ thể thuộc họ yếu tố phát triển biểu mô (Human Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR), có hoạt tính tyrosine kinase, đóng vai trị quan trọng q trình sinh trưởng biệt hoá tế bào Cho đến nay, chưa tìm thấy ligand đặc hiệu HER2 nhiên tạo dimer với thân với thụ thể khác họ để hình thành đồng thụ thể (coreceptor) thúc đẩy đường truyền tín hiệu Sự khuếch đại gen HER2 nhiễm sắc thể 17 dẫn đến tăng biểu thụ thể HER2 bề mặt tế bào ung thư vú Biểu mức HER2 biến đổi tế bào thành dạng ác tính làm tăng q trình hình thành khối u Theo nhiều nghiên cứu gần đây, khoảng 25-30% bệnh nhân ung thư vú cho thấy có khuếch đại gen HER2 biểu mức gen tế bào ung thư Đặc điểm làm cho HER2 trở thành marker hữu hiệu để chẩn đốn sớm ung thư đích cơng liệu pháp điều trị miễn dịch Ung thư vú hai loại ung thư chiếm tỷ lệ cao bệnh ung thư nữ giới Điều trị ung thư vú nhiều loại ung thư khác theo liệu pháp truyền thống hoá trị liệu xạ trị liệu hiệu tiêu diệt khối u cao lại có nhược điểm lớn, tác dụng lên quan bình thường xung quanh (non-targeted effect) Mặt khác, phương pháp đa phần áp dụng trường hợp khối u phát triển giai đoạn muộn nên có hiệu điều trị thấp Những nghiên cứu gần thị sinh học ung thư vú mở hướng điều trị mới, thông minh đầy triển vọng, liệu pháp điều trị cơng đích (targeted therapy), loại bỏ gần hồn tồn nhược điểm liệu pháp truyền thống Một số thuốc có chất kháng thể đặc hiệu HER2 FDA chấp thuận để điều trị cho bệnh nhân ung thư vú dương tính với HER2 giai đoạn cuối Herceptin Để góp phần nghiên cứu nhằm tạo kít chẩn đốn loại thuốc có hiệu điều trị cao dạng ung thư vú dương tính với HER2 chúng tơi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu kháng nguyên HER2 Escherichia coli” Đề tài thực phịng Cơng nghệ tế bào động vật – cụm phịng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ gen – Viện Công nghệ sinh học – Viện khoa học cơng nghệ Việt Nam Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Chƣơng I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU BỆNH UNG THƢ VÚ 1 Giới thiệu chung bệnh ung thƣ ung thƣ vú Ung thư tên chung dùng để gọi nhóm bệnh gồm 200 loại khác nguồn gốc tế bào, nguyên nhân gây bệnh cách thức điều trị có đặc điểm chung phân chia khơng kiểm sốt tế bào, khả tồn phát triển quan tổ chức lạ [1,2,26] Ung thư xảy kết đột biến hay thay đổi bất thường gen chịu trách nhiệm cho việc điều hòa phát triển tế bào giữ cho tế bào khỏe mạnh Ung thư nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ sau bệnh tim mạch đột quỵ nước phát triển nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ sau bệnh tim mạch Mỹ (http://www.cdc.gov) Những nghiên cứu thống kê có khoảng 10 triệu ca mắc mới, triệu ca tử vong 22 triệu người chung sống với ung thư khắp giới năm 2000 Những số tương ứng với việc tăng tỷ lệ mắc tử vong lên khoảng 22% so với tỷ lệ năm 1990 Người ta ước lượng số ca mắc ung thư khắp giới 12.3 15.4 triệu người vào năm 2010 2020 theo thứ tự Năm 2008, ước tính Mỹ có tổng số 1.437.180 ca ung thư 565.650 ca tử vong Ung thƣ vú Là khối u ác tính phát triển từ tế bào vú Thơng thường UTV khởi phát tế bào có khả sản sinh sữa tiểu thùy tuyến vú, ống dẫn sữa từ tiểu thùy núm vú Ít phổ biến hơn, UTV khởi phát mơ đỡ nơi chứa mô liên kết dạng sợi mô mỡ vú 1.2 Tình hình UTV giới Việt Nam UTV giới UTV ung thư thường thấy nữ giới nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ hai sau ung thư phổi Ở nước, tỷ lệ phụ nữ mắc UTV gia tăng đặn năm, tính chung toàn giới UTV phái nữ xếp vào hạng nguy hàng đầu Theo thống kê, tỉ lệ tử vong UTV phụ nữ Nhật Bản, Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 10 20 30 40 50 60 GTGTGCACCGGCACAGACATGAAGCTGCGGCTCCCTGCCAGTCCCGAGACCCACCTGGAC V C T G T D M K L R L P A S P E T H L D 70 80 90 100 110 120 ATGCTCCGCCACCTCTACCAGGGCTGCCAGGTGGTGCAGGGAAACCTGGAACTCACCTAC M L R H L Y Q G C Q V V Q G N L E L T Y 130 140 150 160 170 180 CTGCCCACCAATGCCAGCCTGTCCTTCCTGCAGGATATCCAGGAGGTGCAGGGCTACGTG L P T N A S L S F L Q D I Q E V Q G Y V 190 200 210 220 230 240 CTCATCGCTCACAACCAAGTGAGGCAGGTCCCACTGCAGAGGCTGCGGATTGTGCGAGGC L I A H N Q V R Q V P L Q R L R I V R G 250 260 270 280 290 300 ACCCAGCTCTTTGAGGACAACTATGCCCTGGCCGTGCTAGACAATGGAGACCCGCTGAAC T Q L F E D N Y A L A V L D N G D P L N 310 320 330 340 350 360 AATACCACCCCTGTCACAGGGGCCTCCCCAGGAGGCCTGCGGGAGCTGCAGCTTCGAAGC N T T P V T G A S P G G L R E L Q L R S 370 380 390 400 410 420 CTCACAGAGATCTTGAAAGGAGGGGTCTTGATCCAGCGGAACCCCCAGCTCTGCTACCAG L T E I L K G G V L I Q R N P Q L C Y Q 430 440 450 460 470 480 GACACGATTTTGTGGAAGGACATCTTCCACAAGAACAACCAGCTGGCTCTCACACTGATA D T I L W K D I F H K N N Q L A L T L I 490 500 510 520 530 540 GACACCAACCGCTCTCGGGCCTGCCACCCCTGTTCTCCGATGTGTAAGGGCTCCCGCTGC D T N R S R A C H P C S P M C K G S R C Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 74 http://www.lrc-tnu.edu.vn 550 560 570 580 590 600 TGGGGAGAGAGTTCTGAGGATTGTCAGAGCCTGACGCGCACTGTCTGTGCCGGTGGCTGT W G E S S E D C Q S L T R T V C A G G C 610 620 630 640 650 660 GCCCGCTGCAAGGGGCCACTGCCCACTGACTGCTGCCATGAGCAGTGTGCTGCCGGCTGC A R C K G P L P T D C C H E Q C A A G C 670 680 690 700 710 720 ACGGGCCCCAAGCACTCTGACTGCCTGGCCTGCCTCCACTTCAACCACAGTGGCATCTGT T G P K H S D C L A C L H F N H S G I C 730 740 750 760 770 780 GAGCTGCACTGCCCAGCCCTGGTCACCTACAACACAGACACGTTTGAGTCCATGCCCAAT E L H C P A L V T Y N T D T F E S M P N 790 800 810 820 830 840 CCCGAGGGCCGGTATACATTCGGCGCCAGCTGTGTGACTGCCTGTCCCTACAACTACCTT P E G R Y T F G A S C V T A C P Y N Y L 850 860 870 880 890 900 TCTACGGACGTGGGATCCTGCACCCTCGTCTGCCCCCTGCACAACCAAGAGGTGACAGCA S T D V G S C T L V C P L H N Q E V T A 910 920 930 940 950 960 GAGGATGGAACACAGCGGTGTGAGAAGTGCAGCAAGCCCTGTGCCCGAGTGTGCTATGGT E D G T Q R C E K C S K P C A R V C Y G 970 980 990 1000 1010 1020 CTGGGCATGGAGCACTTGCGAGAGGTGAGGGCAGTTACCAGTGCCAATATCCAGGAGTTT L G M E H L R E V R A V T S A N I Q E F 1030 1040 1050 1060 1070 1080 GCTGGCTGCAAGAAGATCTTTGGGAGCCTGGCATTTCTGCCGGAGAGCTTTGATGGGGAC A G C K K I F G S L A F L P E S F D G D 1090 1100 1110 1120 1130 1140 CCAGCCTCCAACACTGCCCCGCTCCAGCCAGAGCAGCTCCAAGTGTTTGAGACTCTGGAA P A S N T A P L Q P E Q L Q V F E T L E 1150 1160 1170 1180 1190 1200 GAGATCACAGGTTACCTATACATCTCAGCATGGCCGGACAGCCTGCCTGACCTCAGCGTC E I T G Y L Y I S A W P D S L P D L S V 1210 1220 1230 1240 1250 1260 TTCCAGAACCTGCAAGTAATCCGGGGACGAATTCTGCACAATGGCGCCTACTCGCTGACC F Q N L Q V I R G R I L H N G A Y S L T 1270 1280 1290 1300 1310 1320 CTGCAAGGGCTGGGCATCAGCTGGCTGGGGCTGCGCTCACTGAGGGAACTGGGCAGTGGA L Q G L G I S W L G L R S L R E L G S G 1330 1340 1350 1360 1370 1380 CTGGCCCTCATCCACCATAACACCCACCTCTGCTTCGTGCACACGGTGCCCTGGGACCAG L A L I H H N T H L C F V H T V P W D Q 1390 1400 1410 1420 1430 1440 CTCTTTCGGAACCCGCACCAAGCTCTGCTCCACACTGCCAACCGGCCAGAGGACGAGTGT L F R N P H Q A L L H T A N R P E D E C 1450 1460 1470 1480 1490 1500 GTGGGCGAGGGCCTGGCCTGCCACCAGCTGTGCGCCCGAGGGCACTGCTGGGGTCCAGGG Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 75 http://www.lrc-tnu.edu.vn V G E G L A C H Q L C A R G H C W G P G 1510 1520 1530 1540 1550 1560 CCCACCCAGTGTGTCAACTGCAGCCAGTTCCTTCGGGGCCAGGAGTGCGTGGAGGAATGC P T Q C V N C S Q F L R G Q E C V E E C 1570 1580 1590 1600 1610 1620 CGAGTACTGCAGGGGCTCCCCAGGGAGTATGTGAATGCCAGGCACTGTTTGCCGTGCCAC R V L Q G L P R E Y V N A R H C L P C H 1630 1640 1650 1660 1670 1680 CCTGAGTGTCAGCCCCAGAATGGCTCAGTGACCTGTTTTGGACCGGAGGCTGACCAGTGT P E C Q P Q N G S V T C F G P E A D Q C 1690 1700 1710 1720 1730 1740 GTGGCCTGTGCCCACTATAAGGACCCTCCCTTCTGCGTGGCCCGCTGCCCCAGCGGTGTG V A C A H Y K D P P F C V A R C P S G V 1750 1760 1770 1780 1790 1800 AAACCTGACCTCTCCTACATGCCCATCTGGAAGTTTCCAGATGAGGAGGGCGCATGCCAG K P D L S Y M P I W K F P D E E G A C Q 1810 1820 1830 1840 1850 1860 CCTTGCCCCATCAACTGCACCCACTCCTGTGTGGACCTGGATGACAAGGGCTGCCCCGCC P C P I N C T H S C V D L D D K G C P A 1870 1880 1890 1900 1910 GAGCAGAGAGCCAGCCCTCTGACGTCCATCATCTCTGCGGTGGTT E Q R A S P L T S I I S A V V 1.2 Kết so sánh trình tự gen mã hóa vùng ngoại bào HER2 tách dịng với trình tự cơng bố Ngân hàng gen quốc tế So sánh trình tự nucleotide đoạn gen HER2 tách dòng với đoạn gen đăng ký Ngân hàng gen quốc tế phần mềm FASTA, nhận thấy đoạn gen HER2 mà chúng tơi nhận có độ tương đồng cao với trình tự ngân hàng gen đăng ký Kết 19 trình tự có độ tương đồng 100%, chứng tỏ đoạn gen HER2 đặc trưng có trình tự bảo thủ cao Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 76 http://www.lrc-tnu.edu.vn Phụ lục 2.1 Kết xác định trình tự nucleotide gen mã hóa kháng thể scFv đƣợc tách từ gà gây miễn dịch kháng ngun HER2 (dịng phage số 7) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 77 http://www.lrc-tnu.edu.vn Trình tự nucleotide trình tự amino acid suy diễn cụ thể nhƣ sau: 10 20 30 40 50 60 GGTGTCAGCGAACCCGGGAGAACCGTCGAGATCACCTGCTCCGGGGGTGGTAGCAGCAAC G V S E P G R T V E I T C S G G G S S N 70 80 90 100 110 120 TACTATGGCTGGTACCAGCAGAAGGCACCTGGCAGTGCCCCTGTCAGTCTGATCTATGCT Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 78 http://www.lrc-tnu.edu.vn Y Y G W Y Q Q K A P G S A P V S L I Y A 130 140 150 160 170 180 AACACCAACAGACCCTCAAACATCCCTTCACGATTCTCCGGTTCTGGATCCGGCTCCACA N T N R P S N I P S R F S G S G S G S T 190 200 210 220 230 240 AACACATTAACCATCACTGGGGTCCAAGCCGACGACGAGGCTGTCTATTTCTGTGGGAGT N T L T I T G V Q A D D E A V Y F C G S 250 260 270 280 290 300 GGAGACGGCAGTTATTCTGGTATATTTGGGGCCGGGACAACCCCGACCGTCCTAGGTCAG G D G S Y S G I F G A G T T P T V L G Q 310 320 330 340 350 360 TCCTCTAGATCTTCCGCCGTGACGTTGGACGAGTCCGGGGGCGGCCTCCAGACGCCCAGA S S R S S A V T L D E S G G G L Q T P R 370 380 390 400 410 420 GGAGCGCTCAGCCTCGTCTGCAAGGCCTCCGGGTTCACCTTCAGTGACCGTGGCATGTTC G A L S L V C K A S G F T F S D R G M F 430 440 450 460 470 480 TGGGTGCGACAGGCGCCCGGCAAGGGGCTGGAGTTCGTCGCTGAAATTACCAAGGATGGT W V R Q A P G K G L E F V A E I T K D G 490 500 510 520 530 540 GGTGGCACATGGTACGGGTCGGCGGTGAAGGGCCGTGCCACCATCTCGAGGGACAACGGG G G T W Y G S A V K G R A T I S R D N G 550 560 570 580 590 600 CAGAGCACAGTGAGGCTGCAGCTGAACAACCTCAGGGCTGAGGACACCGGCATCTACTGC Q S T V R L Q L N N L R A E D T G I Y C 610 620 630 640 650 660 TGCGCCAAACCTGCTGGTTATTGTTGGTATGGTGATTGTGGTGGTTGGATCGACGCATGG C A K P A G Y C W Y G D C G G W I D A W 670 680 690 700 710 720 GGCCACGGGACCGAAGTCATCGTCTCCTCCACTAGTGGCCAGGCCAGACCAGATCCTCAT G H G T E V I V S S T S G Q A R P D P H 2.2 Kết so sánh trình tự amino acid suy diễn với trình tự amino acid công bố Ngân hàng liệu Uni-ProtKB/Swiss-Prot Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 79 http://www.lrc-tnu.edu.vn SW:LV1_CHICK P04210 Ig lambda chain V-1 region OS=Gall (113 aa) initn: 440 init1: 387 opt: 440 Z-score: 523.7 bits: 103.2 E(): 1.1e-21 Smith-Waterman score: 440; 81.7% identity (91.5% similar) in 82 aa overlap (384:31-110) 10 20 30 GVSEPGRTVEITCSGGGSSNYYGWYQQKAPGS ::.::.::::: : :::::::::::: SW:LV1 MAWAPLLLAVLAHTSGSLVQAALTQPSSVSANPGETVKITCSGDRS YYGWYQQKAPGS 10 20 30 40 50 Sequen 40 50 60 70 80 90 Sequen APVSLIYANTNRPSNIPSRFSGSGSGSTNTLTITGVQADDEAVYFCGSGDGSYSGIFGAG :::.::: ::::::::::::::: :::: :::::::::::::::.:::.:.: SW:LV1 APVTLIYDNTNRPSNIPSRFSGSKSGSTATLTITGVQADDEAVYYCGSADSSSTA 60 70 80 90 100 110 100 110 120 130 140 150 Sequen TTPTVLGQSSRSSAVTLDESGGGLQTPRGALSLVCKASGFTFSDRGMFWVRQAPGKGLEF Kết nhận cho thấy trình tự nhận có tương đồng cao (91.5%) với trình tự amino acid kháng thể gà có mã số P041210 Phụ lục 3.1 Thành phần môi trƣờng tăng sinh Môi trƣờng Thành phần Nồng độ LB lỏng Bacto-tryptone 10 g/l NaCl 10 g/l Yeast extract g/l Bacto-tryptone 10 g/l NaCl 10 g/l Yeast extract g/l LB đặc Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 80 http://www.lrc-tnu.edu.vn 2xTY TYE Agar 15g/l Bacto tryptone 16 g/l Bacto yeast extract 10 g/l NaCl g/l Bacto-agar 15 g/l NaCl g/l tryptone 10 g/l Yeast extract g/l 3.2 Thành phần dung dịch đệm PBS (10X) NaCl KCl Na2HPO4.7H2O KH2PO4 80.0 g/l 2.0 g/l 27.2 g/l 2.4 g/l Sol I Tris-HCl pH 8,0 EDTA pH 8,0 Glucose 25mM 10mM 50mM Sol II NaOH SDS 0,2N 1% Sol III CH3COOK CH3COOH đậm đặc Nước cất 60ml 5M 115ml 28.5 ml Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 81 http://www.lrc-tnu.edu.vn TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Bộ môn ung thư, Trường đại học Y Hà Nội (1997), Bài giảng ung thư học, NXB Y học, Hà Nội Lê Quang Huấn, Lã Thị Huyền (2009), Kháng thể tái tổ hợp ứng dụng, NXB Khoa học tự nhiên Công nghệ, Hà Nội Nguyễn Bá Đức, (2001), Bài giảng ung thư học lâm sàng, NXB Y học, Hà Nội Nguyễn Chấn Hùng, (2004), Ung thư học nội khoa, NXB Y Học TP.HCM Nguyễn Thị Thanh Dịu, Lã Thị Huyền, Phạm Như Trọng, Lê Quang Huấn, (2007), Tách dịng xác định trình tự gen HER2/neu đặc hiệu ung thư vú, Hội nghị Khoa học sống, Đại Học Quy Nhơn, 10/8/2007, Tr 668-671 Nguyễn Thị Thuỷ, Vũ Thị Bích Hường, Lê Quang Huấn, (2007), Nghiên cứu tạo kháng thể kháng tế bào ung thư vú kỹ thuật phage display, Hội nghị Khoa học sống, Đại Học Quy Nhơn, 10/8/2007 Tr 846-849 TÀI LIỆU TIẾNG ANH Andrechek, E R., Hardy, W R., Siegel, P M., Rudnicki, M A., Cardiff, R D., Muller, W J, (2000), “Amplification of the neu/erbB-2 oncogene in a mouse model of mammary tumorigenesis”, Proc Natl Acad Sci U S A 97, 3444-9 Baselga J, Norton L, Albanell J et al, (1998) Recombinant humanized antiHER2 antibody (HerceptinTM) enhances the antitumor activity of paclitaxel and doxorubicin against HER2/neu overex-pressing human breast cancer xenografts Cancer Res; 58: 2825-31 Benz CC, Scott GK, Sarup JC et al, (1992) Estrogen-dependent, tamox-ifenresistant tumorigenic growth ofMCF-7 cells transfected with HER2/neu Breast Cancer Res Treat; 24: 85-95 10 Bianco AR, (2004), “Targeting c-erb2 and other receptors of the c-erB family: rationale and clinical applications”, J Chemother; 16:52-54 11 Biscardi, J.S., Ishizawar, R.C., Silva, C.M and Parsons, S.J (2000), “Tyrosine kinase signalling in breast cancer: epidermal growth factor receptor and c-Src interactions in breast cancer”, Breast Cancer Res 2, 203-10 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 12 Borg, J.-P., Marchetto, S., Le, Bivic, A., Ollendorff, V., Jaulin-Bastard, F., Saito, H., Fournier, E., Adélaïde, J., Margolis, B., and Birnbaum, D, (2000), “ERBIN: a basolateral PDZ protein that interacts with the mammalian ERBB2/HER2 receptor”, Nat Cell Biol 2, 407-14 13 Carter P, Presta L, Gorman CM et al, (1992) Humanization of an antip185HER2 antibody for human cancer therapy Proc Natl Acad Sci USA; 89: 4285-9 14 Chazin VR, Kaleko M, Miller AD, Slamon DJ, (1992) Transformation mediated by the human HER-2 gene independent of epidermal growth factor receptor Oncogene 7: 1859-66 15 Chen P C, Mwakwari S C and Oyelere A K 2008 Nanotechnol Sci Appl 45 16 Chen Y-M, Yu C-J, Cheng T-L and Tseng W-L 2008 Langmuir 243654 17 Cho, H-S, Leahy DJ, (2002), “Structure of the extracellular region of HER3 reveals an interdomain tether”, Science 297, 1330-3 18 Cho, H S, Mason, K., Ramyar, K X., Stanley, A M., Gabelli, S B., Denney, D W., Jr., & Leahy, D J, (2003), “Structure of the extracellular region of HER2 alone and in complex with the Herceptin Fab”, Nature 421, 756-60 19 D Faratian & J Bartlett, (2008), “Predictive markers in breast cancer – the future”, Endocrine Cancer Group, Edinburgh Cancer Research Centre, Edinburgh, UK, Histopathology 52, 91–98 20 Daniel Harari1 and Yosef Yarden, (2000), “Molecular mechanisms underlying ErbB2/HER2 action in breast cancer”, Oncogene 19, 6102 ± 6113 21 Drebin JA, Link VC, Stern DF et al, (1985) Down-modulation of an oncogene protein product and reversion of the transformed phenotype by monoclonal antibodies Cell; 41: 695-706 22 Duffy, M J, (2005), “Predictive Markers in Breast and Other Cancers: A Review”, Clinical Chemistry, 51:494-503 23 Feldman, A.M., Koch, W J & Force, T L (2007), “Developing strategies to link basic cardiovascular sciences with clinical drug development: another opportunity for translational sciences”, Clin Pharmacol Ther 81, 887-92 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 24 Gao, C., Mao, S., Kaufmann, G., Wirsching, P., Lerner, R A., Janda, K D (2002) “A method for the generation of combinatorial antibody libraries using pIX phage display”, Proc Natl Acad Sci USA, 99, PP 12612-12616 132 25 Hanahan D, Weinberg RA (2000), “The hallmarks of cancer”, Cell 100, 57-70 26 Hendriks, B S, Opresko, L K., Wiley, H S., Lauffenburger, D, (2003), “Quantitative analysis of HER2-mediated effects on HER2 and epidermal growth factor receptor endocytosis: distribution of homo- and heterodimers depends on relative HER2 levels”, J Biol Chem 278, 23343-51 27 Horan, T P., Wen, J., Arakawa, T., Liu, N., Brankow, D., Hu, S., Ratzkin, B., and Philo, J S, (1995), “Binding of Neu differentiation factor with the extracellular domain of Her2 and Her3”, J Biol Chem 270, 24604-8 28 Jeffrey S Ross and Jonathan A Fletcher, (1998), “The HER-2/neu Oncogene in Breast Cancer: Prognostic Factor, Predictive Factor, and Target for Therapy”, Stem Cells; 16; pp.413-428 29 Kehoe, J W., Kay, B K (2005), “Filamentous phage display in the new millennium”, Chem Rev., 105, PP 4056-4072 121 30 Lacenere, C J & Sternberg, P W, (2000), “Regulation of EGF receptor signaling in the fruitfly D melanogaster and the nematode C elegans”, Breast Dis 11, 19-30 31 Lee KF, Simon H, Chen H, Bates B, Hung MC, Hauser C, (1995), “Requirement for neuregulin receptor erbB2 in neural and cardiac development”, Nature 378, 394-8 32 Lewis GD, Figari I, Fendly B, (1993), “Differential responses of human tumor cell lines to anti-p185HER2 monoclonal antibodies”, Cancer Immunol Immunother; 37:255-263 33 Linggi B, Carpenter G, (2006), “ErbB receptors: new insights on mechanisms and biology”, Trends Cell Biol; 16:649-656 34 Lvy R, Nguyen T K T, Doty R C, Hussain I, Nichols R J, Schiffrin D J, Brust M and Fernig D G (2004) J Am Chem Soc 126 10076 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 35 MM Moasser, (2007), “The oncogene HER2: its signaling and tranSforming functions and its role in human cancer pathogenesis”, review, Oncogene 26, 6469–6487 36 Meric-Bernstam and Mien-Chie Hung, (2006), “Advances in Targeting Human Epidermal Growth Factor Receptor-2 Signaling for Cancer Therapy”, Clin Cancer Res; 12(21) 37 Mimura K, Kono K, Hanawa M, Mitsui F, Sugai H, Miyagawa N, Ooi A, Fujii H (2005), “Frequencies of HER-2/neu expression and gene amplification in patients with oesophageal squamous cell carcinoma”, Br J Cancer 92, 1253-60 38 Muthuswamy SK, Gilman M, Brugge JS (1999), “Controlled dimerization of ErbB receptors provides evidence for differential signaling by homo- and heterodimers”, Mol Cell Biol 19, 6845-57 39 Muyldermans, S (2001), “Single domain camel antibodies: current status”, J Biotechnol 74, 277 40 Nakamura, M., Tsumoto, K., Kumagai, I., Ishimura, K (2003), “A morphologic study of filamentous phage infection of Escherichia coli using biotinylated phages”, FEBS Lett., 536, PP 167-172 126 41 Nissim, A., Hoogenboom, H R., Tomlinson, I M., Flynn, G., Midgley, C., Lane, D., Winter, G (1994), “Antibody fragments from a “single pot” phage display library as immunochemical reagents”, EMBO Journal, 13, PP 692698 136 42 Norton L, Slamon D, Leyland-Jones B et al, (1999) Overall survival (OS) advantage to simultaneous chemotherapy (CRx) plus the humanized antiHER2 monoclonal antibody Herceptin (H) in HER2-overexpressing (HER2+) metastatic breast cancer (MBC) Proc Am Soc Clin Oncol; 18: 127a (Abstr 483) 43 Patrick J Brennan1, Toru Kumogai1, Alan Berezov1, Ramachandran Murali and Mark I Greene, (2000), “HER2/Neu: mechanisms of dimerization/oligomerization”, Oncogene, 19, 6093 ± 6101 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 44 Park, K., Han, S., Kim, H.J., Kim, J & Shin, E, (2006), “HER2 status in pure ductal carcinoma in situ and in the intraductal and invasive components of invasive ductal carcinoma determined by fluorescence in situ hybridization and immunohistochemistry”, Histopathology 48, 702-7 45 Parsons K, Crocker L, Leipold D, et al, (2007), “Trastuzumab directed cytotoxic therapy: efficacy against HER2-positive trastuzumab-insensitive breast cancer models and enhanced response in trastuzumab-sensitive models”, American Association for Cancer Research (AACR) Annual Meeting, Los Angeles, CA Abstract 649 46 Pegram MD, Konecny GE, O'Callaghan C, Beryt M, Pietras R, Slamon DJ, (2004), “Rational combinations of trastuzumab with chemotherapeutic drugs used in the treatment of breast cancer”, J Nat Cancer Inst; 96:739-749 47 Philipp Holliger & Peter Hudson, (2005), “Engineered antibody fragment and the rise of single domains”, natural biotechnology, www.nature.com/naturebiotechnology 48 Piccart M, Lohrisch C, (2001), “HER2/neu as a predictive factor in breast cancer”, Clin Breast Cancer 2, 129-35; discussion 136-7 49 Prenzel N; Fischer O M; Streit S; Hart S; Ullrich A, (2001), “The epidermal growth factor receptor family as a central element for cellular signal transduction and diversification”, Endocr Relat Cancer 8, 11-31 50 Ram TG, Schelling ME, Hosick HL (2000), “Blocking HER-2/HER-3 function with a dominant negative form of HER-3 in cells stimulated by heregulin and in breast cancer cells with HER-2 gene amplification”, Cell Growth Differ, 11:173183 51 Roh, H., Pippin, J and Drebin, J.A, (2000), “Down-regulation of HER2/neu expression induces apoptosis in human cancer cells that overexpress HER2/neu”, Cancer Res 60, 560-5 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 52 Slamon DJ, Godolphin W, Jones LA, Holt JA, Wong SG, Keith DE, Levin WJ , Stuart SG, Udove J, Ullrich A, et al, (1989), “Studies of the HER-2/neu protooncogene in human breast and ovarian cancer”, Science 244, 707-12 53 Slamon D, Leyland-Jones B, Shak S et al, (1998) Addition of HerceptinTM (humanized anti-HER2 antibody) to first line chemotherapy for HER2 overexpressing metastatic breast cancer (HER2+/MBC) markedly increases anticancer activity: A randomized, multinational controlled phase III trial Proc Am Soc Clin Oncol; 17: 98a (Abstr 377) 54 Soller T, Ringler M, Wunderlich M, Klar T A, Josel J F H-P, Markert Y, Nichtl A and Krzinger K (2007) Nano Lett 1941 55 Spivak-Kroizman T, Rotin D, Pinchasi D, et al, (1992), “Heterodimerization of cerbB2 with different epidermal growth factor receptor mutants elicits stimulatory or inhibitory responses”, J Biol Chem; 267:8056-8063 56 Sundaresan S, Penuel E, Sliwkowski MX, (1999), “The biology of human epidermal growth factor receptor 2”, Curr Oncol Rep;1:16-22 57 TokudaY, Ohnishi Y, Shimamura K et al, (1996) In vitro and in vivo antitumor ejects of a humanised monoclonal antibody against c-erbB-2 product Br J Cancer; 72: 1362-5 58 Tsuda H; Akiyama F; Terasaki H; Hasegawa T; Kurosumi M; Shimadzu M; Yamamori S; Sakamoto G (2001), “Detection of HER-2/neu (c-erb B-2) DNA amplification in primary breast carcinoma Interobserver reproducibility and correlation with immunohistochemical HER-2 overexpression”, Cancer 92, 2965-74 59 Venter DJ, Tuzi NL, Kumar S, Gullick WJ, (1987), “Overexpression of the cerbB-2 oncoprotein in human breast carcinomas: immunohistological assessment correlates with gene amplification”, Lancet 2, 69-72 60 Yarden, Y, (2001), “Biology of HER2 and Its Importance in Breast Cancer”, Oncology, 61:1-13 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 61 Wallasch C, Weiss FU, Niederfellner G, Jallal B, Issing W, Ullrich A, (1995), “Heregulin-dependent regulation of HER2/neu oncogenic signaling by heterodimerization with HER3”, Embo J 14, 4267-75 62 Wangoo N, Bhasin K K, Meht S K and Suri C R (2008) J Colloid Interface Sci 323 247 63 Weinstein EJ, Kitsberg DI, Leder P (2000), “A mouse model for breast cancer induced by amplification and overexpression of the neu promoter and transgene”, Mol Med 6, 4-16 64 Willats, W G T (2002), “Phage display: practicalities and prospects”, Plant Mol Biol., 50, PP 837-854 122 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ... kháng thể đơn dòng đặc hiệu HER2 sử dụng điều trị UTV di có biểu mạnh HER2 Hiện nay, sử dụng công nghệ DNA tái tổ hợp nhà khoa học nghiên cứu để tạo kháng thể đơn dòng tái tổ hợp đặc hiệu với HER2. .. CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LÊ THỊ MINH PHÚC NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG THỂ TÁI TỔ HỢP ĐẶC HIỆU KHÁNG NGUYÊN HER2 TRONG ESCHERICHIA COLI Ngành: Sinh học Chuyên ngành: Sinh... hiệu điều trị cao dạng ung thư vú dương tính với HER2 tiến hành đề tài: ? ?Nghiên cứu tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu kháng nguyên HER2 Escherichia coli? ?? Đề tài thực phòng Cơng nghệ tế bào động