Nghiên cứu biểu hiện peptit kháng nguyên tử protein vỏ của virus viêm não nhật bản làm tiền đề để sản xuất văcxin qua đường miệng

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN NGỌC GIANG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PEPTIT KHÁNG NGUYÊN TỪ PROTEIN VỎ CỦA VIRUT VIÊM NÃO NHẬT BẢN LÀM TIỀN ĐỀ ĐỂ SẢN XUẤT VĂCXIN DÙNG QUA ĐƯỜNG MIỆNG Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS Lê Quỳnh Liên THÁI NGUYÊN – 2009 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN NGỌC GIANG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PEPTIT KHÁNG NGUYÊN TỪ PROTEIN VỎ CỦA VIRUT VIÊM NÃO NHẬT BẢN LÀM TIỀN ĐỀ ĐỂ SẢN XUẤT VĂCXIN DÙNG QUA ĐƯỜNG MIỆNG LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN – 2009 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết thí nghiệm tơi làm thực tế chưa có cơng trình cơng bố báo, tạp chí, hay phương tiện thông tin đại chúng Tác giả Nguyễn Ngọc Giang Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Ngun http://www.Lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Quỳnh Liên tận tình hướng dẫn, động viên, giúp đỡ tơi suốt trình học tập nghiên cứu Trong trình thực hồn thành đề tài tơi nhận giúp đỡ kinh nghiệm quý báu từ GS.TS Lê Trần Bình, TS Chu Hồng Hà, TS Lê Văn Sơn, TS Nguyễn Hữu Cường tập thể cán phịng Cơng nghệ Tế bào Thực vật, Viện Cơng nghệ Sinh học Từ đáy lịng, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc với gúp đỡ để tơi hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới thầy cô môn Sinh, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên dạy dỗ, giúp đỡ suốt quãng thời gian học tập trường Nhân dịp này, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới gia đình, bạn bè người thân bên cạnh động viên khích lệ tạo điều kiện cho tơi hồn thành luận văn Thái Ngun, ngày tháng 10 năm 2009 Học viên Nguyễn Ngọc Giang Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Amp: Ampicillin AS: Acetosyringone A Tumefaciens: Agrobacterium Tumefaciens Bp : cặp baze Carbe: Carbenicillin CNSH: Công nghệ sinh học CNTBTV: Công nghệ tế bào Thực vật Da: Dalton Đoạn 27aa: Đoạn gen mã hố cho đoạn peptít 27 axit amin virut viêm não Nhật Bản Đoạn 27aa_LTB: Đoạn gen nối đoạn 27aa gen LTB DNA: Deoxyribonucleic acid E.coli: Escheria Coli EDTA: Ethylen dimine tetra- acetic acid HEPES: N-2-huydroxyethylpiperazine-N’-ethanesulfonic acid IPTG: Isopropylthio-beta-D-glactoside Kana: Kanamycin Kb: kilobaze LB: Luria Bertani LTB: Labile enterotoxin B OD: Mật độ quang học PBS: Phosphate buffer saline PCR: Polymerase chain reaction Rifa: Rifampicin SDS: Sodium dodecyl sulphat Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn SDS- PAGE: SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis Spec: Spectinomycin TE: Tris-EDTA VNNB: viêm não Nhật Bản X-gal: 5-bromo-4 chloro- indolyl-beta-D-glactoside Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỞ ĐẦU Error! Bookmark not defined Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU Error! Bookmark not defined 1.1 Bệnh viêm não Nhật Bản Error! Bookmark not defined 1.1.1 Nguồn gốc bệnh viêm não Nhật BảnError! Bookmark not defined 1.1.2 Nguồn lây truyền bệnh Error! Bookmark not defined 1.1.3 Đặc điểm biểu bệnh: Error! Bookmark not defined 1.2 Virut viêm não Nhật Bản (virut VNNB) Error! Bookmark not defined 1.2.1 Đặc điểm hình thái tính chất lý hố virut VNNBError! Bookmark not d 1.2.2 Sự nhân virut Error! Bookmark not defined 1.2.3 Cấu trúc virut VNNB Error! Bookmark not defined 1.2.4 Khả gây đáp ứng miễn dịch đoạn peptit kháng nguyên 27 axit amin virut VNNB Error! Bookmark not defined 1.3 Các loại văcxin phòng bệnh VNNB Error! Bookmark not defined 1.3.1 Văcxin bất hoạt sản xuất từ não chuộtError! Bookmark not defined 1.3.2 Văcxin VNNB bất hoạt sản xuất từ tế bàoError! Bookmark not defined 1.3.3 Văcxin sống giảm độc lực Error! Bookmark not defined 1.3.4 Nghiên cứu phát triển văcxin mớiError! Bookmark not defined Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUError! Bookmark not defined 2.1 Vật liệu Error! Bookmark not defined 2.1.1 Vật liệu thực vật Error! Bookmark not defined 2.1.2 Vật liệu sinh học phân tử Error! Bookmark not defined 2.1.2.1 Mồi Error! Bookmark not defined 2.1.2.2 Plasmid Error! Bookmark not defined 2.1.2.3 Các chủng vi sinh vật nguyên liệu dùng thí nghiệm Error! Bookmark not defined 2.1.2.4 Các loại máy móc Error! Bookmark not defined 2.1.3 Hố chất Error! Bookmark not defined 2.1.4 Các môi trƣờng nuôi cấy dung dịchError! Bookmark not defined 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.2.1 Nhân đoạn 27 aa LTB PCRError! Bookmark not defined 2.2.2 Phƣơng pháp PCR từ khuẩn lạc (colony PCR)Error! Bookmark not defined 2.2.3 Thiết kế vector pET21_27aa_LTB biểu đoạn peptit kháng nguyên E.coli Error! Bookmark not defined 2.2.4 Biểu đoạn peptit kháng nguyên E.coliError! Bookmark not defined 2.2.5 Thiết kế vector pCB_27aa_LTB biểu đoạn peptit kháng nguyên tế bào thực vật Error! Bookmark not defined 2.2.6 Biểu đoạn peptit kháng nguyên tế bào thực vậtError! Bookmark no 2.2.7 Kiểm tra biểu protein tái tổ hợpError! Bookmark not defined Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined 3.1 Nhân đoạn gen 27 aa Error! Bookmark not defined 3.2 Nhân gen LTB nối với gen 27 aa Error! Bookmark not defined 3.3 Thiết kế vector biểu gen 27 aa_LTB E.coliError! Bookmark not defined Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn 3.4 Biểu protein tái tổ hợp E.coli BL21Error! Bookmark not defined 3.4.1 Biến nạp vector tái tổ hợp vào chủng vi khuẩn E.coli BL21Error! Bookmark n 3.4.2 Biểu gen 27aa_LTB E.coli BL21Error! Bookmark not defined 3.5 Biểu tạm thời gen 27aa_LTB thực vậtError! Bookmark not defined 3.5.1 Thiết kế vector biểu gen 27aa_LTB thực vậtError! Bookmark not d 3.5.2 Lai đoạn 27aa_LTB_cmyc_KDEL với vector chuyển gen pCB301 Error! Bookmark not defined 3.5.3 Biến nạp vào A tumefaciens Error! Bookmark not defined 3.5.4 Biểu tạm thời gen 27aa_LTB thuốc láError! Bookmark not defi KẾT LUẬN Error! Bookmark not defined KIẾN NGHỊ Error! Bookmark not defined TÀI LIỆU THAM KHẢO Error! Bookmark not defined PHỤ LỤC Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng Mồi nhân gen 27 aa gen LTB 17 Bảng Các loại plasmid dùng thí nghiệm 18 Bảng Máy móc dùng thí nghiệm 19 Bảng Hóa chất dùng thí nghiệm 19 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn M: Marker 1: E.Coli BL21 cảm ứng IPTG sau 2: E.Coli BL21(pET21_21aa_LTB) cảm ứng IPTG sau Đây băng protein biểu có kích thước ~16,5 KDa tương đương với kích thước đoạn 27aa_LTB tính lý thuyết so với băng đối chứng khơng có băng Tuy nhiên để khẳng định đoạn protein có biểu hay không tiến tới tinh protein thời gian tới chúng tơi tiến hành lai miễn dịch với kháng thể đơn dòng đặc hiệu với histidine phương pháp western blot 3.5 Biểu tạm thời gen 27aa_LTB thực vật 3.5.1 Thiết kế vector biểu gen 27aa_LTB thực vật Nhằm tăng cường biểu tế bào thực vật, đoạn peptit kháng nguyên gắn thêm trình tự KDEL, có chức dẫn truyền mã tái tổ hợp vào hệ lưới nội chất Bên cạnh đó, tiến hành gắn bổ sung cmyc vào peptide kháng nguyên Mục đích tạo đoạn tag thuận tiện cho việc phát protein tái tổ hợp phương pháp lai miễn dịch sau Vector pTRA mang đoạn KDEL cmyc cắt mở vòng BamHI/NotI lai với đoạn 27aa_LTB cắt từ vector pBT enzyme Để kiểm tra plasmid tái tổ hợp dịng pTRA_27aa_LTB_cmyc_KDEL mong muốn, plasmid tách từ khuẩn lạc sống sót mơi trường LB có bổ sung kháng sinh chọn lọc cắt enzyme giới hạn HindIII Theo tính tốn lý thuyết, HindIII cắt plasmid tái tổ hợp thành hai đoạn sau: đoạn dài 1100bp gồm đoạn 27aa_LTB_cmyc_KDEL, đoạn dài 2600bp phần lại vector pTRA Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 http://www.Lrc-tnu.edu.vn ~2600 bp ~1100 bp C Hình 3.8 Điện di sản phẩm cắt plasmid pTRA_27aa_LTB HindIII Đối chứng âm vector pTRA M: Marker 1kb 2, 3: Sản phẩm cắt dòng plasmid tái tổ hợp Độ lớn hai đoạn cmyc KDEL gắn với đoạn gen 27aa_LTB có kích thước 1100bp Trên hình 3.10 dịng plasmid giếng số 2, có hai băng, băng 2600 băng 1100bp, dịng plasmid tái tổ hợp có chứa đoạn gen 27aa_LTB Điều cho thấy gắn đoạn 27aa_LTB vào vector pTRA Đồng nghĩa với việc đoạn 27aa_LTB gắn thêm đoạn cmyc_KDEL cấu trúc vector biểu thiết kế Plasmid dòng số mang gen biểu 27aa_LTB nuôi lượng lớn để phục vụ cho thí nghiệm 3.5.2 Lai đoạn 27aa_LTB_cmyc_KDEL với vector chuyển gen pCB301 Trong vector pCB301 có chứa promoter 35S CaMV, loại promoter mạnh, thích hợp để biểu gen ngoại lai thực vật Vì chúng tơi chọn promoter để phục vụ cho biểu gen thuốc Sơ đồ cấu trúc vector biểu đầy đủ thể hình 3.11A Để tạo vector nhị thể có khả biểu tế bào thực vật, đoạn 27aa_LTB_cmyc_KDEL cắt từ vector pTRA HindIII lai với vector pCB301 cắt HindIII có khử photphatase hai đầu cắt Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 http://www.Lrc-tnu.edu.vn nhằm hạn chế khả gắn trở lại vector sau cắt Sau nhân lên E.coli DH5α, plasmid dịng khuẩn lạc sống sót mơi trường chọn lọc cắt HindIII Theo tính tốn lý thuyết vector tái tổ hợp pCB_27aa_LTB mang cấu trúc biểu cmyc KDEL sau cắt HindIII tạo hai băng có kích thước 5400bp 1100bp tương ứng với kích thước vector pCB đoạn gen gắn vào vector gắn với cmyc KDEL Trên hình 3.11B kết điện di sản phẩm cắt vector pCB_27aa_LTB HindIII Nhận thấy giếng số số có hai băng với kích thước 5400bp 1100bp, điều thể với tính tốn lý thuyết HindIII BamHI 35S 27aa BamHI LTB NotI cmyc 390bp HindIII M ~5400 bp KDEL 700bp ~1100 bp pCB_35S_27aa_LTB_cmyc_KDEL AA BA Hình 3.9 Điện di sản phẩm cắt plasmid pCB_27aa_LTB HindIII A: Sơ đồ cấu trúc biểu đoạn 27aa_LTB tế bào thực vật B: Điện di sản phẩm cắt plasmid pCB_27aa_LTB HindIII (1),(2): dòng plasmid tái tổ hợp (M): Marker 1kb (3): Đối chứng âm vector pCB301 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 http://www.Lrc-tnu.edu.vn Từ cấu trúc biểu vector gắn thêm promoter 35S hình thành vector mang cấu trúc biểu đầy đủ Từ kết cho thấy thiết kế vector pCB301 mang cấu trúc biểu 35S_27aa_LTB_cmyc_KDEL (pCB301_35S_27aa_LTB_cmyc_KDEL) 3.5.3 Biến nạp vào A tumefaciens Vector pCB301 mang cấu trúc biểu 35S_27aa_LTB_cmyc_KDEL biến nạp vào tế bào khả biến chủng A tumefaciens phương pháp xung điện Các khuẩn lạc sống sót mơi trường kháng sinh chọn lọc cho vi khuẩn vector tái tổ hợp (Rifa Kana) chọn ngẫu nhiên để thực phản ứng PCR colony Kết PCR với cặp mồi đặc hiệu thể với dòng khuẩn thể hình 3.10 M ~390bp Hình 3.10 Kết điện di sản phẩm PCR colony M : Marker 1kb : Đối chứng (+) đoạn 27aa_LTB 2, 3, : Sản phẩm PCR dòng khuẩn chọn đĩa Kết điện di cho thấy dòng số nhân đoạn gen khoảng 390bp tương đương với băng đối chứng (+), điều cho thấy có đoạn 27aa_LTB phản ứng Nhưng sản phẩm biến nạp lưu lại lượng nhỏ plasmid chứa đoạn gen 27aa_LTB Do để có thêm sở khẳng định dịng PCR dương tính chứa vector biểu Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Ngun 38 http://www.Lrc-tnu.edu.vn từ dịng tiến hành tách plasmid PCR plasmid với cặp mồi đặc hiệu để kiểm tra thêm lần Hình 3.11 cho thấy mẫu plasmid số PCR xuất băng có kích thước ~390bp tương đương với đối chứng (+) giếng số 3, điều chứng tỏ có mặt đoạn 27aa_LTB plasmid tách M M ~390bp Hình 3.11 Kết PCR từ plasmid dòng A tumefaciens M: Marker 1, : Sản phẩm PCR từ plasmid tách từ A tumefaciens 3: Đối chứng (+)27aa_LTB Từ kết vector mang cấu trúc biểu vào A tumefaciens Chủng A tumefaciens mang vector biểu pCB_35S_27aa_LTB_cmyc_KDEL chuyển vào để tiến hành biểu gen 3.5.4 Biểu tạm thời gen 27aa_LTB thuốc Từ dòng A tumefaciens mang vector tái tổ hợp, tiến hành biểu tạm thời gen 27aa_LTB thuốc SNN theo sơ đồ sau: Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 http://www.Lrc-tnu.edu.vn Cấy vạch chủng A.tumefaciens mang vector tái tổ hợp Nuôi khuẩn lượng nhỏ(5ml) Nuôi khuẩn lượng lớn (50ml) Dịch khuẩn dịch huyền phù OD~1 Cây thuốc SNN Tiêm dịch huyền phù vào thuốc Hình 3.12 Sơ đồ ảnh bước Agro- infiltration Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40 http://www.Lrc-tnu.edu.vn Để nhận biết hiệu phương pháp Agro-infiltration biểu gen Gus vector pPNT289_Gus biểu song song với gen 27aa_LTB Gen Gus mã hố enzyme β-glucuronidase có khả phân huỷ chất glucuronidase thành sản phẩm tạo màu xanh lam dễ nhận biết Sau hai ngày, thu mẫu tiêm A tumefaciens mang gen Gus nhuộm XGluc xuất đốm màu xanh lam đặc trưng, chứng tỏ có mặt gen Gus thuốc (hình 3.13) Hình 3.13 Mẫu tiêm gen Gus nhuộm X-Gluc Kết biểu tạm thời gen Gus thể phương pháp Agro-inflitration lại hiệu tốt việc biểu tạm thời gen Do biểu tạm thời đoạn 27aa_LTB tiến hành phương pháp hiệu định Trong thời gian tới tiếp tục kiểm tra biểu tạm thời peptit kháng nguyên 27aa LTB thuốc Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 41 http://www.Lrc-tnu.edu.vn KẾT LUẬN Từ kết thu trình nghiên cứu chúng tơi rút kết luận sau: Nhân đoạn 27aa từ virut VNNB, đoạn LTB từ plasmid chứa LTB ghép nối đoạn Thiết kế vector pET21_27aa_LTB biểu đoạn peptit kháng nguyên 27 aa LTB E.coli Thiết kế vector pCB_27aa_LTB biểu đoạn peptit kháng nguyên 27 aa LTB thực vật Biểu protein tái tổ hợp E.coli Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 42 http://www.Lrc-tnu.edu.vn KIẾN NGHỊ Tiếp tục biểu protein tái tổ hợp tế bào thực vật Tinh protein tái tổ hợp biểu E.coli thực vật Thử khả gây miễn dịch protein tái tổ hợp Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 43 http://www.Lrc-tnu.edu.vn TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Đặng Thị Hương (2007), Biểu kháng nguyên tái tổ hợp PREM E virut viêm não Nhật Bản (Japanese encephalitis virus) E.Coli thực vật Luận văn thạc sĩ Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội Huỳnh Phương Liên cộng (2006), Nghiên cứu thay chủng Nakayama Beijing-1 sản xuất văcxin viêm não Nhật Bản, Đề tài cấp nhà nước Viện vệ sinh dịch tễ trung ương Lê Đức Hinh, Nguyễn Chương (2001), Viêm não Nhật Bản, Thần kinh học trẻ em, Nhà xuất Y học, trang 177-190 TÀI LIỆU TIẾNG ANH Buxchen-Osmond C (2003), “Flaviviridae In: ICTVdB - The Universal Virus Database, version ICTVdB Management, The Earth Institute, Biosphere Center, Columbia University, Oracle, AZ, USA” Buescher EL, Scherer WF (1959), “Ecologic studies of Japanese encephalitis virus in Japan IX Epidemiologic correlations and conclusions”, Am J Trop pp.19-22 Burke DS, Leake CJ (1998), “Japanese Encephalitis ” Boca Raton, FL: CRC Press, pp.126 Burke DS, Monath TP (2001), “Flaviviruses” In: Knipe DM, Howley PM, eds Fields'virology 4th ed Vol Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins, pp.1043-1126 Chambers TJ, Hahn CS, Galler R, Rice CM (1990), Flavivirus genome organisation, expression and replication Annu Rev Microbiol 44,pp.649–688 Chen Y, Maguire T, Hileman RE, Fromm JR, Esko JD, Linhardt RJ, Marks RM (1997), “Dengue virus infectivity depends on envelope protein binding to target cell heparan sulphate” Nat Med 3, pp 866–871 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 44 http://www.Lrc-tnu.edu.vn 10 F.-F.Ge, Y.-F.Qiu, Y.- W.Yang, and P.-Y.Chen(2006), “An hsp70 fusion protein vaccine potentiat es the immune res onse against Japanese encephalitis virus”, Virology, pp 125-135 11 Field trial of innactivate JE Beijing vaccine in Japan WHO working group on Japanese encephalitis vaccines Osaka 12 Gorman BM, Leer JR, Filippich C, et al “Plaquing and neutralization of arboviruses in the PS-EK line of cells” Aust J Med Technol 1975; 6: 65-71 13 Hanna JN, Ritchie SA, Phillips DA, et al (1996) “An outbreak of JE in the Torres Strait”, Australia 1995 Med J Aust, pp 256–260 14 Hase T, Dubois DR, Summers PL (1990) “Comparative study of mouse brains infected with Japanese encephalitis virus by intracerebral or intraperitoneal inoculation” Int J Exp Path, pp, 857-869 15 Hase T, Summers PL, Cohen WH (1989) “A comparative study of entry modes into C6/36 cells by Semliki Forest and Japanese encephalitis viruses” Arch Virol pp 101-104 16 Hase T, Summers PL, Dubois DR (1990) “Ultra structure changes of mouse brain neurons infected with Japanese encephalitis virus” Int J Exp Pathol pp 493–505 17 Hayashi M “Encephalitis epidemica Japonica” Allg Z Psychiat 95:55–58 18 Heinz FX, Allison SL (2001) “The machinery for flavivirus fusion with host cell membranes” Curr Opin Microbiol 4.pp 450–455 19 Hennessy S, Liu Z, Tsai TF, Liu HL, Wu TX., Yu HJ, Liu QM, et al(1996) “Effectiveness of live-attenuated Japanese encephalitis vaccine (SA14-14-2): a casecontrol study” Lancet 347.pp 1583-1586 20 Hiroyama T “Epidemiology of Japanese encephalitis 1962” (in Japanese) Sai Ching Iga Ku pp.1272-1280 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 45 http://www.Lrc-tnu.edu.vn 21 Morb Mortal.Wkly (1993), “Inactivated Japanese encephalitis virus vaccine Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices”, pp.1–14 22 Kang TJ, Han SC, Jang MO, Kang KH, Jang YS, Yang MS (2004) “Enhanced expression of B subunit of Escherichia coli heat-labile enterotoxin in tobacco by optimization of coding sequence” Appl Biochem Biotechnol pp.175-187 23 Kang TJ, Loc NH, Jang MO, Jang YS, Kim YS, Seo JE, Yang MS (2003) “Expression of the B subunit of E coli heat-labile enterotoxin in the chloroplasts of plants and its characterization” Transgenic Res, pp 683-691 24 Kim TG, Kim MY, Kim BG, Kang TJ, Kim YS, Jang YS (2007), “Synthesis and assembly of Escherichia coli heat-labile enterotoxin B subunit in transgenic lettuce (Lactuca sativa L.)” Protein Expr Purif , pp 22-27 25 Kitano T, Suzuki K, and Yamaguchi T (1974), Morphological, Chemical, and Biological Characterization of Japanese Encephalitis Virus Virion and Its Hemagglutinin J Virol, pp 631-639 26 Konishi E, Pincus S, Fonseca BA, Shope RE, Paoletti E, and Mason PW (1991), “Comparison of protective immunity elicited by recombinant vaccinia viruses that synthesize E or NS1 of Japanese encephalitis virus” Virol, pp 401-410 27 Konishi E, Pincus S, Paoletti E, Shope RE, Burrage T and Mason PW (1992), “Mice immunized with a subviral particle containing Japanese encephalitis virus prM/M and E proteins are protected from lethal JEV infection” Virol, pp.714-720 28 Lin CW and Wu SC (2003), “A functional epitope determinant on Domain III of the Japanese encephalitis virus envelope protein interacted with neutralizing-antibody combining sites” J Virol, pp 2600-2606 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 46 http://www.Lrc-tnu.edu.vn 29 Mandl CW, Heinz FX, Kunz C (1988), “Sequence of the structural proteins of tickborne encephalitis virus (Western subtype) and comparative analysis with other flaviviruses” Virol, pp.197-205 30 McAda PC, Manson PW, Schmaljohm CS, et al (1987), “Partial sequence of the Japanese encephalitis virus genome” Virol, pp 348-360 31 McMinn PC (1997) “The molecular basic of virulence of the encephalitogenic flaviviruses” J Gen Virol, pp 2711-2722 32 Miyake M (1964), “The pathology of Japanese encephalitis” WHO Bull 30, pp 153–160 33 Monath TP, Tsai TF(2002) “Flaviviruses” In: Richman DD, Whitley RJ, Hayden FG, eds Clinical virology 2nd ed Washington, D.C: ASM Press, 2002, pp.1097-1151 34 Murphy FA (1980), “Togavirus morphology and morphogenesis” In: Schlesinger RW,eds The Togaviruses: Biology, Structure, Replication New York, pp 241–316 35 Porterfield, J S (1980), “Antigenic characteristics and classification of Togaviridae”, See Ref, pp.13-46 36 Pyke AT, Williams DT, Nisbet DJ, van den Hurk AF, Taylor CT, et al (2001), ”The appearance of a second genotype of Japanese encephalitis virus in the Australasian region” Am J TropMed Hyg, pp 747–753 37 Rey FA, Heinz FX, Mandl C, Kunz C, Harrison C, (1995), “The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2A resolution” Nature 375, pp.291–298 38 Rice CM, Lindenbach BD, (2001), “Flaviviridae: the viruses and their replication”, pp.991-1042 In D M Knipe and P M Howley (ed.), Fields virology, 4th ed., vol I.Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 47 http://www.Lrc-tnu.edu.vn 39 Rice CM, Strauss EG and Strauss JH (1986), “Structure of the Flavivirus genome” In The Togaviridae and Flaviviridae, pp 279-326 40 Russell PK, Brandt WA, Dalrymple JM (1980), “Chemical and antigenic structure of flaviviruses” In: Schlesinger RW, ed The togaviruses New York: Academic Press, pp 503–29 41 Russell PK, Brandt WE, Dalrymple JM, (1980), “Chemical and antigenic structure of flaviviruses” In: Schlesinger RW, eds The Togaviruses: Biology, Structure Replication, pp.503–52 42 Solomon T, Dung NM, Kneen R, Gainsborough M, Vaughn DW, Khanh VT (2000), “Japanese encephalitis”, J Neurol Neurosurg Psychiatry 68, pp 405–415 43 Stadler K, Allison SL, Schalich J, Heinz FX, (1997), “Proteolytic activation of tickborne encephalitis virus by furin” J Virol 71, pp 8475– 8481 44 Sumiyoshi H, Mori C, Fuke I, Morita K, Kuhara S, Kondou J, Kikuchi Y,Nagamatu H and Igarashi A, (1987), “Complete nucleotide sequence of the Japanese encephalitis virus genome RNA” Virol 161, pp.497-510 45 Thisyakora U, Thisyakora C, Wilda H, (1995), “Japanese encephalitis and international travel” J Travel Med 2, pp.37-40 46 Thongcharoen P, (1989), ”Japanese encephalitis-virus encephalitis: an overview” Southeast Asian J Trop Med Public Health 20, pp 59–73 47 Tiroumourougane SV, Raghava P, Srinivasan S (2002), “Japanese viral encephalitis” Postgrad Med J 78, pp 205–215 48 Trent DW, Naeve CW (1980), “Biochemistry and replication" In: Monath T, ed St.Louis Encephalitis Washington, DC: American Public Health Association, pp.159–199 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 48 http://www.Lrc-tnu.edu.vn 49 Trent DW, Naeve CW, (1980), “Biochemistry and replication” See Ref 108a, pp.159-199 50 Tsai TF, Chang GW, Yu YX (1999), “Japanese encephalitis vaccines” In Plotkin SA and Orenstein WA, eds., Vaccines - 3rd edition, WB Saunders, Inc., Philadelphia, PA, pp 672-710 51 Tsai TF, Yu YX, Jia LL, Putvatana R, Zhang R, Wang S, Halstead SB (1998), “Immunogenicity of live attenuated SA 14-14-2 Japanese encephalitis vaccine a comparison of 1- and 3- months immunization schedules” J Infect Dis,117(1), pp.221-224 52 Vaughn DW, Hoke CH (1992), “The epidemiology of Japanese encephalitis: prospects for prevention” Epidemiol Rev 14,pp 197–221 53 Wengler G, Wengler G (1989), “Cellassociated West Nile flavivirus is covered with E+pre-M protein heterodimers which are destroyed and reorganized by proteolytic cleavage during virus release” J Virol 63,pp.2126 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 49 http://www.Lrc-tnu.edu.vn ... HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN NGỌC GIANG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PEPTIT KHÁNG NGUYÊN TỪ PROTEIN VỎ CỦA VIRUT VIÊM NÃO NHẬT BẢN LÀM TIỀN ĐỀ ĐỂ SẢN XUẤT VĂCXIN DÙNG QUA ĐƯỜNG MIỆNG LUẬN... chọn đề tài: ? ?Nghiên cứu biểu peptit kháng nguyên từ protein vỏ virut viêm não Nhật Bản làm tiền đề để sản xuất văcxin dùng qua đường miệng ” Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn... Bên cạnh đó, nghiên cứu protein vỏ virut viêm não Nhật Bản cho thấy đoạn 27 axit amin nằm protein vỏ virut viêm não Nhật Bản có khả tạo kháng thể chống lại virut Ngoài ra, nghiên cứu tiểu đơn