Nghiên cứu biểu hiện peptit kháng nguyên từ protein vỏ của virut viêm não nhật bản làm tiền đề để sản xuất văcxin dùng qua đường miệng

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN NGỌC GIANG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PEPTIT KHÁNG NGUYÊN TỪ PROTEIN VỎ CỦA VIRUT VIÊM NÃO NHẬT BẢN LÀM TIỀN ĐỀ ĐỂ SẢN XUẤT VĂCXIN DÙNG QUA ĐƯỜNG MIỆNG Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS Lê Quỳnh Liên THÁI NGUYÊN – 2009 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN NGỌC GIANG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PEPTIT KHÁNG NGUYÊN TỪ PROTEIN VỎ CỦA VIRUT VIÊM NÃO NHẬT BẢN LÀM TIỀN ĐỀ ĐỂ SẢN XUẤT VĂCXIN DÙNG QUA ĐƯỜNG MIỆNG LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN – 2009 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết thí nghiệm làm thực tế chưa có công trình công bố báo, tạp chí, hay phương tiện thông tin đại chúng Tác giả Nguyễn Ngọc Giang Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Quỳnh Liên tận tình hướng dẫn, động viên, giúp đỡ suốt trình học tập nghiên cứu Trong trình thực hoàn thành đề tài nhận giúp đỡ kinh nghiệm quý báu từ GS.TS Lê Trần Bình, TS Chu Hoàng Hà, TS Lê Văn Sơn, TS Nguyễn Hữu Cường tập thể cán phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học Từ đáy lòng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc với gúp đỡ để hoàn thành luận văn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới thầy cô môn Sinh, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên dạy dỗ, giúp đỡ suốt quãng thời gian học tập trường Nhân dịp này, xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè người thân bên cạnh động viên khích lệ tạo điều kiện cho hoàn thành luận văn Thái Nguyên, ngày tháng 10 năm 2009 Học viên Nguyễn Ngọc Giang Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Amp: Ampicillin AS: Acetosyringone A Tumefaciens: Agrobacterium Tumefaciens Bp : cặp baze Carbe: Carbenicillin CNSH: Công nghệ sinh học CNTBTV: Công nghệ tế bào Thực vật Da: Dalton Đoạn 27aa: Đoạn gen mã hoá cho đoạn peptít 27 axit amin virut viêm não Nhật Bản Đoạn 27aa_LTB: Đoạn gen nối đoạn 27aa gen LTB DNA: Deoxyribonucleic acid E.coli: Escheria Coli EDTA: Ethylen dimine tetra- acetic acid HEPES: N-2-huydroxyethylpiperazine-N’-ethanesulfonic acid IPTG: Isopropylthio-beta-D-glactoside Kana: Kanamycin Kb: kilobaze LB: Luria Bertani LTB: Labile enterotoxin B OD: Mật độ quang học PBS: Phosphate buffer saline PCR: Polymerase chain reaction Rifa: Rifampicin SDS: Sodium dodecyl sulphat Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn SDS- PAGE: SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis Spec: Spectinomycin TE: Tris-EDTA VNNB: viêm não Nhật Bản X-gal: 5-bromo-4 chloro- indolyl-beta-D-glactoside Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỞ ĐẦU Error! Bookmark not defined Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU Error! Bookmark not defined 1.1 Bệnh viêm não Nhật Bản Error! Bookmark not defined 1.1.1 Nguồn gốc bệnh viêm não Nhật BảnError! Bookmark not defined 1.1.2 Nguồn lây truyền bệnh Error! Bookmark not defined 1.1.3 Đặc điểm biểu bệnh: Error! Bookmark not defined 1.2 Virut viêm não Nhật Bản (virut VNNB) Error! Bookmark not defined 1.2.1 Đặc điểm hình thái tính chất lý hoá virut VNNBError! Bookmark not d 1.2.2 Sự nhân virut Error! Bookmark not defined 1.2.3 Cấu trúc virut VNNB Error! Bookmark not defined 1.2.4 Khả gây đáp ứng miễn dịch đoạn peptit kháng nguyên 27 axit amin virut VNNB Error! Bookmark not defined 1.3 Các loại văcxin phòng bệnh VNNB Error! Bookmark not defined 1.3.1 Văcxin bất hoạt sản xuất từ não chuộtError! Bookmark not defined 1.3.2 Văcxin VNNB bất hoạt sản xuất từ tế bàoError! Bookmark not defined 1.3.3 Văcxin sống giảm độc lực Error! Bookmark not defined 1.3.4 Nghiên cứu phát triển văcxin mớiError! Bookmark not defined Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUError! Bookmark not defined 2.1 Vật liệu Error! Bookmark not defined 2.1.1 Vật liệu thực vật Error! Bookmark not defined 2.1.2 Vật liệu sinh học phân tử Error! Bookmark not defined 2.1.2.1 Mồi Error! Bookmark not defined 2.1.2.2 Plasmid Error! Bookmark not defined 2.1.2.3 Các chủng vi sinh vật nguyên liệu dùng thí nghiệm Error! Bookmark not defined 2.1.2.4 Các loại máy móc Error! Bookmark not defined 2.1.3 Hoá chất Error! Bookmark not defined 2.1.4 Các môi trƣờng nuôi cấy dung dịchError! Bookmark not defined 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.2.1 Nhân đoạn 27 aa LTB PCRError! Bookmark not defined 2.2.2 Phƣơng pháp PCR từ khuẩn lạc (colony PCR)Error! Bookmark not defined 2.2.3 Thiết kế vector pET21_27aa_LTB biểu đoạn peptit kháng nguyên E.coli Error! Bookmark not defined 2.2.4 Biểu đoạn peptit kháng nguyên E.coliError! Bookmark not defined 2.2.5 Thiết kế vector pCB_27aa_LTB biểu đoạn peptit kháng nguyên tế bào thực vật Error! Bookmark not defined 2.2.6 Biểu đoạn peptit kháng nguyên tế bào thực vậtError! Bookmark no 2.2.7 Kiểm tra biểu protein tái tổ hợpError! Bookmark not defined Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined 3.1 Nhân đoạn gen 27 aa Error! Bookmark not defined 3.2 Nhân gen LTB nối với gen 27 aa Error! Bookmark not defined 3.3 Thiết kế vector biểu gen 27 aa_LTB E.coliError! Bookmark not defined Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn 3.4 Biểu protein tái tổ hợp E.coli BL21Error! Bookmark not defined 3.4.1 Biến nạp vector tái tổ hợp vào chủng vi khuẩn E.coli BL21Error! Bookmark n 3.4.2 Biểu gen 27aa_LTB E.coli BL21Error! Bookmark not defined 3.5 Biểu tạm thời gen 27aa_LTB thực vậtError! Bookmark not defined 3.5.1 Thiết kế vector biểu gen 27aa_LTB thực vậtError! Bookmark not d 3.5.2 Lai đoạn 27aa_LTB_cmyc_KDEL với vector chuyển gen pCB301 Error! Bookmark not defined 3.5.3 Biến nạp vào A tumefaciens Error! Bookmark not defined 3.5.4 Biểu tạm thời gen 27aa_LTB thuốc láError! Bookmark not defi KẾT LUẬN Error! Bookmark not defined KIẾN NGHỊ Error! Bookmark not defined TÀI LIỆU THAM KHẢO Error! Bookmark not defined PHỤ LỤC Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng Mồi nhân gen 27 aa gen LTB 17 Bảng Các loại plasmid dùng thí nghiệm 18 Bảng Máy móc dùng thí nghiệm 19 Bảng Hóa chất dùng thí nghiệm 19 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Tên hình Trang Hình 1.1: Sơ đồ cấu trúc protein đƣợc mã hoá hệ gen virut VNNB Hình 1.2: Sơ đồ vị trí đoạn 27 axit amin protein E 10 Hình 1.3: Khả sinh tế bào lympho từ peptid khác 11 Hình 1.4 Khả sản sinh IFN-γ IL-4 11 Hình 1.5: Khả gây đáp ứng miễn dịch văcxin thực vật 15 Hình 2.1: Sơ đồ trình gắn nối đoạn 27 axit amin với gen LTB 20 Hình 2.2: Sơ đồ thí nghiệm thiết kế vector pET21_27aa_LTB biểu đoạn peptide kháng nguyên E.coli 22 Hình 2.3: Sơ đồ thí nghiệm biểu tạm thời gen 27aa_LTB thuốc 24 Hình 3.1: Điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen 27aa 27 Hình 3.2: Điện di sản phẩm PCR nhân đoạn LTB ghép nối 27aa_LTB 28 Hình 3.3: Điện di sản phẩm cắt plasmid pBT_27aa_LTB 29 Hình 3.4: Kết so sánh trình tự đoạn 27 aa_LTB với trình tự gốc lần 30 Hình 3.5: Điện di sản phẩm cắt plasmid pET21_27aa_LTB 32 Hình 3.6: Điện di sản phẩm cắt plasmid pET21_27aa_LTB tách từ E.coli BL21 33 Hình 3.7: Điện di sản phẩm biểu protein E.coli BL21 34 Hình 3.8: Điện di sản phẩm cắt plasmid pTRA_27aa_LTB HindIII 36 Hình 3.9: Điện di sản phẩm cắt plasmid pCB_27aa_LTB HindIII 37 Hình 3.10: Kết điện di sản phẩm PCR colony 38 Hình 3.11: Kết PCR từ plasmid dòng A tumefaciens 39 Hình 3.12: Sơ đồ ảnh bƣớc Agro- infiltration 40 Hình 3.13: Mẫu tiêm gen Gus đƣợc nhuộm X-Gluc 41 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn PHỤ LỤC * Các dung dịch: - Dung dịch Lameli buffer Stock 1X 2X 50mM Tris pH 6,8 1M 0,5ml 1ml 2%SDS 20% 1ml 2ml 10% Glycerin 87% 1-1,5ml 2,3ml 0,01% DTT 1M 50μl 50μl 0,2% Bromphenol blue 1% 50μl 50μl 6,8ml 3,7ml H2O - Các dung dịch sử dụng tách chiết plasmid từ vi khuẩn: + SolI: Tris- HCL 25mM, pH=8; EDTA 10mM, pH=8; glucose 50mM + SolII: NaOH 0,2M; SDS 1% + SolIII: kali axetat 3M; axit axetic 11,5%; natri axetat 3M - Dung dịch đệm TE: Tris-HCL 10mM, pH=8; EDTA 1mM, pH=8 - Dung dịch chloroform: isoamylalcohol (24:1): 24ml chloroform: 1ml isoamylalcohol - Dung dịch đệm TAE đặc 50 lần: Tris- HCL 24,2%, axit axetic 5,71 ml, 10ml EDTA 0,5M pH=8 - Dung dịch nhộm gel ethidium bromide: 0,5μg/ml - Các dung dịch điện di gel polyacrylamid(SDS- PAGE) + Bis- Acrylamid 30%; APS 10%; Glycerol 50%; TEMED + Đệm Tris- HCL 1,5M(pH=6,8) * Các loại môi trƣờng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn - Môi trường LB lỏng: 0,5% dịch chiết nấm men; 1% bacto-pepton; 1% NaCl - Môi trường LB đặc: môi trường LB lỏng thêm 1,5% Bacto-aga - Môi trường chứa chất cảm ứng IPTG: môi trường LB có bổ xung IPTG tới nồng độ cuối 1mM Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Virut nguyên nhân gây bệnh nguy hiểm cho người có virut viêm não Nhật Bản (Japanese Encephalitis Virus- JEV) Virut viêm não Nhật Bản xâm nhập vào thể làm tổn hại hệ thần kinh gây tổn thương nghiêm trọng dẫn đến tử vong để lại di chứng nặng sau hồi phục Ðến nay, bệnh viêm não Nhật Bản nhiều bệnh siêu vi gây khác chưa có thuốc đặc trị Ðiều trị chủ yếu làm bớt phần triệu chứng, cứu người bệnh qua khỏi nguy kịch suy hô hấp, trụy tim mạch, nhiễm trùng Sau điều trị di chứng phục hồi vận động, tâm thần kinh kết điều trị phục hồi hạn chế Do vậy, việc phòng tránh cần thiết Đã từ lâu văcxin phương thuốc phòng ngừa bệnh hiệu cho người Và để phòng bệnh viêm não Nhật Bản có nhiều loại văcxin sản xuất Tuy nhiên, đại đa số loại văcxin thường có quy trình sản xuất phức tạp, trải qua trình làm lạnh khắt khe Gần đây, văcxin thực vật quan tâm nhiều có nhiều ưu điểm dễ dàng thu sinh khối, dễ tăng quy mô sản xuất, có tính ổn định cao trình bảo quản sử dụng, an toàn Bên cạnh đó, nghiên cứu protein vỏ virut viêm não Nhật Bản cho thấy đoạn 27 axit amin nằm protein vỏ virut viêm não Nhật Bản có khả tạo kháng thể chống lại virut Ngoài ra, nghiên cứu tiểu đơn vị liên kết nội độc tố không bền nhiệt E.coli (heat- labile enterotoxin: LT) cho thấy tiểu đơn vị B (LTB) có khả sinh miễn dịch niêm mạc ruột LTB tái tổ hợp kích thích đáp ứng miễn dịch niêm mạc để chống lại LT Do vậy, LTB sử dụng tăng cường hiệu miễn dịch văcxin thực vật Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Dựa theo trên, chọn đề tài: “Nghiên cứu biểu peptit kháng nguyên từ protein vỏ virut viêm não Nhật Bản làm tiền đề để sản xuất văcxin dùng qua đường miệng ” Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh viêm não Nhật Bản 1.1.1 Nguồn gốc bệnh viêm não Nhật Bản Bệnh viêm não Nhật Bản (VNNB) phát vào năm 1871 Năm 1924, Nhật Bản xảy vụ dịch có tới 6000 người mắc có đến 60% số tử vong [20] Năm 1959, Buecher Scherer khẳng định chim lợn vật chủ bị nhiễm virut nhờ có muỗi vectơ hút máu động vật nhiễm truyền virut sang cho người [5] Các nước khu vực châu Á bao gồm: Nhật Bản, Trung Quốc, Đài Loan, Triều Tiên, Philippine, vùng viễn đông Nga, tất nước Đông Nam Á Ấn Độ nằm vùng lưu hành virut VNNB Dần dần lây lan đến vùng khác không thuộc châu Á vùng Torres Australia [13] [36] Hàng năm, khu vực có khoảng 50.000 trường hợp mắc có khoảng 10.000 tử vong, số sống sót mang nhiều di chứng thần kinh nặng nề [42] Bệnh VNNB thường xảy quanh năm, dịch thường bắt đầu mùa mưa quần thể muỗi phát triển tối đa nhiệt độ khu vực thích nghi cho nguồn bệnh [52] Thường vào khoảng tháng đến tháng nước bán nhiệt đới nhiệt đới phụ thuộc vào mật độ muỗi động vật khuếch đại, lượng mưa, chim di cư canh tác nông nghiệp yếu tố quan trọng Tỷ lệ mắc giảm dần Trung Quốc, Hàn Quốc Nhật Bản lại tăng lên Bangladest, Myanmar, Ấn Độ, Nepal, Bắc Thái Lan Việt Nam [52] 1.1.2 Nguồn lây truyền bệnh Hầu hết trường hợp lây truyền bệnh muỗi côn trùng đốt loài chim, chim ký chủ mang mầm bệnh, thân chim thường Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn không biểu bệnh Ngoài có vật chủ khác mang mầm bệnh động vật có vú, lợn [3] Muỗi Culex vector truyền bệnh, chủ yếu loài: Culex tritaeniorhyncus: muỗi thường gặp châu Á Culex gelidus: thường gặp Malaysia Singapore Culex vishnui: Ấn Độ Culex pseudovishnui: Ấn Độ Culex annulirostris: Guam Culex pipiens: phía đông Liên Xô cũ Muỗi truyền bệnh từ đời mẹ sang đời con, muỗi Culex tritaeniorhyncus sinh sản phát triển nhiều đồng ruộng, đốt chim, gia súc người Muỗi Culex đốt truyền vào ban đêm Tỷ lệ nhiễm muỗi vào khoảng 1-3% [21] Loài muỗi sống chủ yếu đồng ruộng lúa nước di chuyển vào vùng dân cư sinh sống gần Các ca bệnh thường vùng ngoại ô thành phố [21], [45], [52] Ở Việt Nam có hai nhóm chim có khả truyền bệnh: - Nhóm chim sống làng mạc, lũy tre, loài ăn như: chim lau, chim rẻ quạt, chim sẻ nhà, chim liếu điếu, chim chích chòe - Nhóm chim ăn đồng: cò, sáo, quạ, cu gáy, chèo bẻo Có số loài súc vật khác bị nhiễm trùng tiềm tàng gà, dê, bò, ngựa, lợn loài bò sát (rắn, rùa) Ở nước ta loài muỗi có nhiều miền Bắc vào tháng nóng Ban ngày sống bụi vườn, ban đêm bay vào nhà cắn hút máu gia súc người, chúng thích đẻ trứng ruộng lúa mương máng Lợn tham gia dây truyền bệnh thường dạng nhiễm trùng thể ẩn [3] 1.1.3 Đặc điểm biểu bệnh: Triệu chứng bệnh thường sốt, đau người, mệt mỏi, đặc biệt viêm não người lớn Ở trẻ em gây đau dày, ruột rối loạn tinh thần, ngủ gà giai đoạn đầu, lên co giật Bệnh nặng dẫn đến hôn mê không hồi phục lại Một số trường hợp tiến triển bệnh Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn viêm màng não nhanh, phút chốc Hầu hết trường hợp để lại di chứng nặng nề Hầu hết di chứng để lại trẻ 10 tuổi Thời kỳ ủ bệnh 5-16 ngày Sau đó, khởi bệnh ạt triệu chứng sốt cao đột ngột, đau đầu, đau cơ, buồn nôn, nôn Tiếp đến rối loạn ý thức xuất dấu hiệu lú lẫn, mê sảng, hôn mê Rối loạn vận động trương lực tăng, chân tay co cứng, cứng gáy, cử động bất thường, có co giật Nặng liệt nửa người liệt toàn thân Bệnh để lại di chứng liệt vận động rối loạn tinh thần [2] 1.2 Virut viêm não Nhật Bản (virut VNNB) 1.2.1 Đặc điểm hình thái tính chất lý hoá virut VNNB Virut VNNB nằm nhóm virut Arbo (arthropod borne viruses) Hệ gen virut Arbo thường ARN, hầu hết chúng có vỏ lipit bị bất hoạt ether sodium deoxycholate [4] [7] Nhóm virut Arbo có 350 loài, Arbo gây bệnh cho người có 75 loài Nhiều virut Arbo xếp vào họ Togaviridae, Bunyaviridae, Reoviridae, Rhabdoviridae Họ Togaviridae chia thành chi Alphavirus thuộc nhóm A họ Flaviviridae thuộc nhóm B virut VNNB thuộc họ Flaviviridae [2] Virut VNNB có đường kính trung bình 40-50nm, dạng hình cầu Màng lipid kép virut gắn vào lớp vỏ glycoprotein E protein màng M Sợi ARN làm vật liệu di truyền bao bọc nucleocapsid Hệ gen virut VNNB mã hóa cho 10 protein gồm protein cấu trúc protein không cấu trúc khung đọc mở liên tục trật tự từ đầu 5’ đến đầu 3’ vùng không mã hóa [31] Hạt virut VNNB tinh khiết cho thấy sợi ARN chiếm 6%, protein 66%, lipid 17% carbonhydrate chiếm 9%, cấu trúc lớp lipid kép phụ thuộc vào tế bào chủ, nơi virut nhân lên [41] [48] Virut VNNB có hệ số lắng 200S Trọng lượng phân tử 60-70 x 106 dalton Độ bền vững thích hợp pH Virut dễ bị bất hoạt nhiệt độ Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn cao: 50oC 50 phút, 37oC vài Nhiệt độ thấp -80oC, -20oC virut tồn nhiều năm nitơ lỏng (-196oC) virut tồn vĩnh cửu Virut VNNB nhạy với dung môi hòa tan ether, sodium deoxycholate, dễ dàng bị bất hoạt tia cực tím, formaldehyt [1] 1.2.2 Sự nhân virut Trên màng tế bào thường có thụ thể, virut xuất nhận biết tiến đến bám vào thụ thể Màng tế bào bao bọc hạt virut đưa virut vào nội bào Màng tế bào bị tác động tạo khe hở cho virut thâm nhập vào bên tế bào gây cảm ứng tổng hợp ARN [9] [33] [38] Bước vào trình cởi áo, sợi ARN bộc lộ sợi ARN đơn để tạo thành ARN phân cực (-) bổ sung thành chuỗi ARN kép nhờ phiên mã sớm thông tin trung gian chép sợi ARN kép làm khuôn để tổng hợp sợi ARN theo cách bán bảo tồn không đối xứng Protein tổng hợp liên tiếp thành đoạn protein cấu trúc không cấu trúc [44] ARN protein virut tổng hợp lưới nội chất có hạt, vùng quanh nhân nguyên sinh chất tế bào chủ Sản phẩm tổng hợp lắp ráp màng tế bào chất tạo hạt virion Các hạt virion giải phóng qua máy Golgi ngoại bào xuất tiết virut tiếp tục xâm nhập vào tế bào khác [14] [15] [16] Virut VNNB nhân lên nhiều loại tế bào tế bào tiên phát tế bào thường trực có nguồn gốc từ người, khỉ, gặm nhấm, lợn, chim, gia cầm muỗi [6] [7] [12] Virut nhân lên gây hủy hoại tế bào (CPE) có số loại tế bào quan sát kính hiển vi quang học, không thấy tượng CPE [33] Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn 1.2.3 Cấu trúc virut VNNB NS2A 5’ C preM E NS1 NS2B NS4A NS2 Protein cấu trúc NS3 NS4 NS4B NS5 3’ Protein không cấu trúc Hình 1.1: Sơ đồ cấu trúc protein mã hoá hệ gen virut VNNB Hệ gen virut VNNB mã hoá cho protein khác nhau, protein chia thành hai nhóm protein cấu trúc protein phi cấu trúc Nhóm protein cấu trúc chiếm ¼ chiều dài hệ gen bao gồm: protein lõi C, protein tiền màng (preM) protein màng Các protein không cấu trúc phần lại hệ gen Đầu 3’ sợi ARN virut VNNB không chứa đuôi polyA coi làm khuôn mẫu cho cấu trúc Từ đầu 5’ gen mã hóa cho protein C ARN [39] [49] Nhóm protein cấu trúc bao gồm: a) Protein C Protein C vững chắc, chứa khoảng 127 axit amin, thành phần bao gồm số lớn axit amin Lys Arg Protein C có axit amin liên kết với chặt chẽ, loại trừ khả trung hòa phân tử ARN virut với tác nhân liên quan [31] [38] b) Protein M Phía tế bào virut trưởng thành có chứa protein M Protein M có chứa dạng protein preM chưa trưởng thành tế bào chủ preM có tới 165 axit amin không trùng lặp với protein E Từ có số nghiên cứu sản xuất văcxin VNNB tái tổ hợp sử dụng protein E để tổng hợp preM Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn [...]... miễn dịch niêm mạc để chống lại LT Do vậy, LTB có thể được sử dụng tăng cường hiệu quả miễn dịch của văcxin thực vật Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 http://www.Lrc-tnu.edu.vn Dựa theo những căn cứ trên, do đó chúng tôi đã chọn đề tài: Nghiên cứu biểu hiện peptit kháng nguyên từ protein vỏ của virut viêm não Nhật Bản làm tiền đề để sản xuất văcxin dùng qua đường miệng ” Số hóa bởi... ổn định cao trong quá trình bảo quản và sử dụng, an toàn Bên cạnh đó, những nghiên cứu trên protein vỏ của virut viêm não Nhật Bản cho thấy đoạn 27 axit amin nằm trên protein vỏ của virut viêm não Nhật Bản có khả năng tạo ra kháng thể chống lại virut này Ngoài ra, nghiên cứu trên tiểu đơn vị liên kết nội độc tố không bền nhiệt của E.coli (heat- labile enterotoxin: LT) cho thấy tiểu đơn vị B (LTB) có... có virut viêm não Nhật Bản (Japanese Encephalitis Virus- JEV) Virut viêm não Nhật Bản xâm nhập vào cơ thể làm tổn hại hệ thần kinh gây ra những tổn thương nghiêm trọng dẫn đến tử vong hoặc để lại các di chứng nặng sau khi hồi phục Ðến nay, bệnh viêm não Nhật Bản cũng như nhiều bệnh do siêu vi gây ra khác chưa có thuốc đặc trị Ðiều trị chủ yếu là làm bớt đi phần nào các triệu chứng, cứu người bệnh qua. .. thiết Đã từ lâu văcxin là phương thuốc phòng ngừa bệnh hiệu quả cho con người Và để phòng bệnh viêm não Nhật Bản thì cũng đã có rất nhiều loại văcxin được sản xuất Tuy nhiên, đại đa số các loại văcxin này thường có quy trình sản xuất phức tạp, trải qua các quá trình làm lạnh khắt khe Gần đây, văcxin thực vật được quan tâm nhiều vì nó có nhiều ưu điểm như dễ dàng thu sinh khối, dễ tăng quy mô sản xuất, ... Đại học Thái Nguyên 2 http://www.Lrc-tnu.edu.vn Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh viêm não Nhật Bản 1.1.1 Nguồn gốc bệnh viêm não Nhật Bản Bệnh viêm não Nhật Bản (VNNB) được phát hiện vào năm 1871 Năm 1924, tại Nhật Bản xảy ra một vụ dịch có tới 6000 người mắc và có đến 60% trong số này tử vong [20] Năm 1959, Buecher và Scherer đã khẳng định chim và lợn là những vật chủ chính bị nhiễm virut và nhờ... Arg Protein C có các axit amin liên kết với nhau rất chặt chẽ, có thể loại trừ khả năng trung hòa của phân tử ARN của virut với các tác nhân liên quan [31] [38] b) Protein M Phía ngoài tế bào của virut trưởng thành có chứa protein M Protein M có chứa dạng protein preM chưa trưởng thành trong tế bào chủ và preM có tới 165 axit amin không trùng lặp với protein E Từ đó đã có một số nghiên cứu sản xuất văcxin. .. hoặc liệt toàn thân Bệnh để lại di chứng liệt vận động hoặc rối loạn tinh thần [2] 1.2 Virut viêm não Nhật Bản (virut VNNB) 1.2.1 Đặc điểm hình thái và tính chất lý hoá của virut VNNB Virut VNNB nằm trong nhóm virut Arbo (arthropod borne viruses) Hệ gen của virut Arbo thường là ARN, hầu hết chúng đều có vỏ lipit và bị bất hoạt bởi ether hoặc sodium deoxycholate [4] [7] Nhóm virut Arbo có trên 350 loài,... trúc chiếm ¼ chiều dài hệ gen bao gồm: protein lõi C, protein tiền màng (preM) và protein màng Các protein không cấu trúc là phần còn lại của hệ gen Đầu 3’ sợi ARN của virut VNNB không chứa đuôi polyA nhưng được coi là làm khuôn mẫu cho các cấu trúc tiếp theo Từ đầu 5’ các gen được mã hóa cho protein C của ARN [39] [49] Nhóm protein cấu trúc bao gồm: a) Protein C Protein C rất vững chắc, chứa khoảng... học Thái Nguyên 6 http://www.Lrc-tnu.edu.vn 1.2.3 Cấu trúc của virut VNNB NS2A 5’ C preM E NS1 NS2B NS4A NS2 Protein cấu trúc NS3 NS4 NS4B NS5 3’ Protein không cấu trúc Hình 1.1: Sơ đồ cấu trúc các protein được mã hoá bởi hệ gen của virut VNNB Hệ gen của virut VNNB mã hoá cho các protein khác nhau, các protein này được chia thành hai nhóm chính là protein cấu trúc và protein phi cấu trúc Nhóm protein. .. được làm khuôn để tổng hợp các sợi ARN mới theo cách bán bảo tồn và không đối xứng Protein cũng được tổng hợp liên tiếp thành các đoạn protein cấu trúc và không cấu trúc [44] ARN và protein của virut được tổng hợp trên lưới nội chất có hạt, vùng quanh nhân trong nguyên sinh chất của tế bào chủ Sản phẩm tổng hợp được lắp ráp ở màng tế bào chất tạo ra các hạt virion Các hạt virion được giải phóng qua