Tách dòng gen mã hóa protein vỏ của virut gây bệnh vàng lùn ở lúa (rgsv) tại tỉnh ninh thuận

ĐẶT VẤN ĐỀ Lúa gạo lương thực phục vụ cho người Đây nguồn lương thực giàu dinh dưỡng chủ yếu giới, đứng thứ ba sau ngô lúa mì sản lượng, cung cấp 20% calories, 15% protein, chất khoáng - chất xơ cho người Chính gạo nguồn lương thực chủ yếu bữa ăn hàng tỷ người châu Á, châu Phi, châu Mỹ latin, khu vực Trung đông tương lai loại lương thực hàng đầu Từ năm 1999 đến nay, suất lúa Việt Nam hàng năm đạt mức 4000 kg/ha Từ năm 1990 đến Việt Nam đứng thứ năm giới sản lượng lúa (36 triệu thóc/năm 2005) sau Trung Quốc (180 triệu thóc/năm 2005), Ấn Độ (129 triệu thóc/năm 2005), Indonesia (54 triệu thóc/năm 2005) Bangladesh (40 triệu thóc/năm 2005) [6] Tuy nhiên thời gian từ năm 2006 – 2008, sản lượng lúa bị giảm sút nghiêm trọng bệnh virus rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal) lây truyền, đặc biệt bệnh vàng lùn xảy thời gian gần Bệnh vàng lùn virus thuộc họ Tenuivirus gây ra, có tên gọi virus vàng lùn (Rice Grassy Stunt Virus- RGSV) gây hại cho lúa qua môi giới truyền bệnh rầy nâu Đầu vụ hè thu 2007, dịch bệnh lại phát triển diện rộng tỉnh Đồng Sông Cửu Long tỉnh Nam Trung Bộ với mật độ rầy nâu cao Do ảnh hưởng dịch bệnh vàng lùn, sản lượng gạo suất năm 2007 giảm triệu so với năm 2006 [11], [4] Tính đến tháng 9/2008, diện tích lúa Thu Đơng tỉnh Đồng Sơng Cửu Long, tổng diện tích nhiễm rầy nâu 25,198 lúa bị nhiễm bệnh vàng lùn 3.546,8 [2] Rất nhiều thành tựu đạt nghiên cứu biện pháp phịng chống rầy nâu - mơi giới truyền bệnh vàng lùn gây hại lúa chủ yếu như: nghiên cứu đặc tính sinh học, sinh thái học rầy nâu, biện pháp phịng trừ thuốc hố học, sinh vật học, áp dụng biện pháp kỹ thuật canh tác mới, sử dụng giống kháng… Tuy nhiên, hiệu phương pháp chưa cao Hiện dịch bệnh vàng lùn gây hại nặng nề sản lượng lúa gạo cho tỉnh Nam Trung Bộ đặc biệt tỉnh Ninh Thuận Thông tin việc phân loại cấu trúc phân tử chủng virus gây bệnh vàng lùn thiếu Chính vậy, cơng tác thu thập mẫu lúa nhiễm bệnh vàng lùn lùn xoắn địa phương nằm danh sách công bố nghi có dịch để tách dịng giải mã trình tự gen RGSV cần thiết Nhằm đánh giá tính đa dạng di truyền virus gây bệnh địa phương khác nhau, từ xây dựng chiến lược cho việc phòng trừ loại virus Với lý trên, thời gian thực tập tốt nghiệp, hướng dẫn khoa học chuyên gia Viện Công nghệ Sinh học – Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, thực đề tài: “Tách dòng gen quy định protein vỏ virus gây bệnh vàng lùn lúa (RGSV) tỉnh Ninh Thuận” Chƣơng TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tình hình dịch bệnh vàng lùn gây hại lúa giới Việt Nam 1.1.1 Thế giới Từ thập kỷ 70 kỷ XX trở lại đây, rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal) lên vấn đề thời nghề trồng lúa châu Á Nhiều trận dịch xảy quy mô rộng lớn chưa thấy nhiều nước Ấn Độ, Indonesia, Triều Tiên, Nhật Bản, Philippin, Đài Loan… gây tổn thất nặng nề kinh tế Rầy nâu phá hoại làm giảm phần tồn sản lượng lúa Rầy nâu cịn môi giới truyền bệnh virus nguy hiểm cho lúa bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá, bệnh héo lùn lúa Quốc gia châu Á Theo thống kê Dyck Thomas (1979) thiệt hại rầy nâu bệnh vàng lùn châu Á năm 1966-1975 lên tới 300 triệu đôla Trong thực tế, tác hại lớn Tại hội nghị quốc tế rầy nâu họp Viện nghiên cứu lúa quốc tế (IRRI), Philippin tháng năm 1977 Việt Nam tháng năm 2006, rầy nâu coi là: “mối đe dọa thường xuyên sản xuất lúa châu Á” 1.1.2 Việt Nam Ở nước ta, dịch rầy nâu bệnh virus hại lúa (vàng lùn, lùn xoắn lá) gây thiệt hại nghiêm trọng hầu hết vùng lúa trọng điểm nước Hiện trạng không ảnh hưởng đến xuất lúa gạo mà cịn có nguy ảnh hưởng đến an ninh lương thực nước Quốc gia khác Theo báo cáo kết 01 năm thực cơng tác phịng chống bệnh dịch rầy nâu, bệnh vàng lùn lúa tỉnh, thành phố Nam Bộ tổng diện tích bị nhiễm rầy nâu tồn vùng năm 2006 vụ Đơng Xn năm 20062007 731.092 (chiếm 12,61% diện tích gieo sạ), diện tích nhiễm nặng 67.238 Tổng diện tích nhiễm bệnh vàng lùn năm 2006 vụ đơng xn 2007 tồn vùng 237.466 (chiếm 4,09% diện tích gieo sạ), có 118.021 nhiễm nặng Năm 2008, dịch rầy nâu bệnh virus hại lúa giảm so với năm trước mức báo động Lúa Hè Thu khu vực ĐBSCL, diện tích bị nhiễm rầy nâu: 76.795 ha, có 4.298 bị nhiễm nặng Diện tích bị nhiễm rầy nâu tập trung tỉnh Cần Thơ, Bạc Liêu, Tiền Giang, Vĩnh Long, Sóc Trăng, Đồng Tháp, Trà Vinh Lúa Thu Đơng diện tích bị nhiễm rầy nâu lên đến 774 ha, phần lớn diện tích bị nhiễm rầy nâu mức độ nhẹ Diện tích bị nhiễm vàng lùn xoắn vụ Hè Thu 206 ha, tập trung lúa hè thu giai đoạn địng trổ, diện tích nhiễm nhẹ 55 (tỷ lệ bệnh từ 5-10%), nhiễm trung bình 13 (tỷ lệ bệnh 10-20%), nhiễm nặng 138 (tỷ lệ bệnh 20-50%) Diện tích bị nhiễm bệnh vàng lùn xoắn vụ Thu Đơng 9.534,4 ha, diện tích tăng chủ yếu An Giang Vĩnh Long Diện tích bị nhiễm nặng 3.867,2 với tỷ lệ bệnh 20-80%, diện tích bị nhiễm trung bình 2.767,3 với tỷ lệ bệnh 10-20%, diện tích bị nhiễm bệnh nhẹ: 2.889,9 với tỷ lệ bệnh 3-10%, huyện Lấp Vò, tỉnh Đồng Tháp bị nhiễm 17 với tỷ lệ bệnh phổ biến từ 5-10%, nơi cao tới 50%.Tính đến tháng 9/2008, lúa Thu Đông tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long tổng diện tích nhiễm rầy nâu 25.198 lúa bị nhiễm bệnh vàng lùn 3.546,8 Hình 1.1 Lúa bị nhiễm bệnh vàng lùn tỉnh Ninh Thuận 1.2 Đặc điểm virus gây bệnh vàng lùn lúa 1.2.1 Đặc điểm hình thái cấu trúc Virus vàng lùn lúa cỏ (Rice grassy stunt virus-RGSV) gây hại cho lúa (Oryza sativa L.) vùng Nam Đông Nam châu Á [25] Virus phát tán vòng tròn từ sang khác thông qua trung gian rầy nâu Nilaparvata lugens Stal [25], không truyền qua trứng rầy RGSV xếp vào giống Tenuivirus Bên cạnh RGSV, giống Tenuivirus bao gồm RRSV, RTSV, RSV, RHBV, MStV, EHBV UHBV Tuy nhiên có khác biệt lớn cấu tạo genome RGSV so với virus khác giống Tenuivirus Đặc điểm chung RGSV với loài khác giống Tenuivirus: Virus có cấu tạo dạng sợi xoắn rộng 6-8 nm dài 200-2400 nm; genome sợi RNA âm, lưỡng tính (nghĩa tổng hợp protein khác từ sợi RNA âm lẫn sợi RNA dương, hai đầu 5’ RNA âm dương chứa đoạn ORF); Đầu 3’ 5’ sợi RNA bổ trợ cho nhau, nên có khả tạo cấu trúc dạng vịng Trình tự đoạn bổ trợ tương đối ổn định Hình1 RGSV nhuộm với uranul acetate (thanh đơn vị : 100nm) Đặc điểm riêng RGSV: RGSV lúa nhiễm bệnh Philippin phân lập công bố NCBI Độ lớn gen virus RGSV 25142 nucleotide Bộ gen RGSV chứa sợi RNA, RSV RHBV chứa sợi RNA, MStV chứa sợi RNA Mỗi sợi có 17 nucleotide đầu 3’ 5’ bổ sung với nhau, đoạn 17 nucleotide sợi RNA giống nhau, ngoại trừ vị trí thứ 15 RNA1 Sợi RNA1 dài 9760 nucleotid Sợi âm RNA1 mã hóa protein 18,9 kDa, sợi dương RNA1 mã hóa protein 339,1 kDa, protein 339,1 kDa có độ lớn tương tự RNA polymerase protein mã hóa RNA1 RSV (37,9%) phlebovirus (thuộc họ Bunyaviridea) (36%) Nếu có đột biến dịch chuyển khung đọc -1 sợi âm RNA1 mã hóa protein 18,2 kDa Sợi RNA2 dài 4056 nucleotide Sợi âm RNA2 mã hóa protein 23,3 kDa, sợi dương RNA2 mã hóa protein 93,9 kDa Sợi RNA3 dài 3123 nucleotide Sợi âm RNA3 mã hóa protein 22,9 kDa, sợi dương RNA3 mã hóa protein 30,9 kDa Sợi RNA4 dài 2915 nucleotide Sợi âm RNA4 mã hóa protein 19,4 kDa, sợi dương RNA4 mã hóa protein 60,4 kDa Sợi RNA5 dài 2704 nucleotide Sợi âm RNA5 mã hóa protein 21,6 kDa, sợi dương RNA5 mã hóa protein 35,9 kDa, protein vỏ Sợi RNA6 dài 2584 nucleotide Sợi âm RNA6 mã hóa protein 20,6 kDa, sợi dương RNA6 mã hóa protein 36,4 kDa Khi so sánh gen RGSV với loài virus khác họ Tenuivirus nhận thấy RNA5 RNA6 RGSV tương tự RNA3 RNA4 loài virus khác họ Tenuivirus RNA1 RNA2 RGSV tương tự RNA1 RNA2 loài virus khác họ Tenuivirus Hình1 Sơ đồ cấu tạo gen RGSV Có dịng RGSV Dịng 1: có dạng phân lập Đài Loan: “héo lùn” gây lùn cây, vàng thường chết cây; lùn lúa cỏ kiểu B: đẻ nhánh, hẹp, ngắn màu nhạt; lùn lúa cỏ kiểu Y: lùn đẻ nhánh hơn, chiều rộng bình thường, màu nhạt bình thường; Dịng 2: Xuất Philippin, bên cạnh triệu chứng virus thông thường gây vàng lúa chết dịng gây bệnh lúa có gen kháng có nguồn gốc từ lúa N nivara 1.2.2 Ký chủ truyền bệnh a) Dấu hiệu bệnh Triệu chứng ban đầu chưa thấy rõ bệnh lúa bình thường Bụi lúa bệnh ngả màu xanh nhạt, đơi có màu vàng đến cam Thời gian sau lúa bệnh phát triển (lúc dễ nhầm lẫn với tượng dinh dưỡng nên nơng dân thường bón thêm phân đạm) Nhìn tồn cảnh thấy lúa hồi xanh khơng sau cấy, hẹp dựng đứng, có màu vàng, mềm rũ có màu xanh đậm có nhiều đốm màu rỉ sắt Thời kỳ đẻ nhánh, bụi lúa bệnh đẻ nhiều nhánh, bụi lúa to hơn, có chiều cao tương đương với bụi khác, chưa khác biệt Càng sau nhìn tồn cảnh thấy lúa phát triển khơng bụi lúa bị bệnh không phát triển chiều cao, cuối bụi lúa bệnh khô lụi dần cháy rầy chịm ( có khác có cịn chen nhánh lúa cịn xanh bụi lúa bị nhiễm không ruộng mạ) Khi trỗ thường khơng có gié gié có hạt lép [12] b) Tác nhân Bệnh vàng lùn virus RGSV gây qua môi giới truyền bệnh rầy nâu Nilaparvata lugens Stal RGSV không truyền qua hạt lúa bệnh qua phấn hoa Virus không truyền qua cách tiếp xúc lúa khỏe mạnh với lúa bệnh, không lây qua nguồn nước hay khơng khí Virus truyền dạng bền vững qua tuổi rầy nhân mật số rầy ký chủ, không truyền qua trứng rầy Lúa nhiễm bệnh giảm suất giống mẫn cảm mật độ rầy ruộng cao [25] Rầy nâu truyền virus gây bệnh từ sang khác, từ ruộng sang ruộng khác Rầy nâu dùng vịi chích hút nhựa làm cho lúa bị khơ héo Khi rầy nâu chích vào thân, lúa để lại chỗ chích vệt nâu cứng, cản trở luân chuyển nước chất dinh dưỡng làm thân, bị khô héo Mật độ rầy cao gây tượng cháy rầy Rầy có khả truyền bệnh suốt trình sống sau tiếp nhận mầm bệnh khoảng Khả nhiễm bệnh tăng kéo dài thời gian rầy hút nhựa lúa mang bệnh [20] Khi lúa bị nhiễm virus có nhiều bó sợi quan sát nhân tế bào chất thể có màng bao bọc diện phần tế bào chất tế bào diệp lục Quần thể mật số cao rầy nâu rầy xanh làm vector truyền bệnh nhanh chóng gây thiệt hại kép (vừa thiệt hại rầy vừa thiệt hại bệnh) nghiêm trọng Đồng thời, thâm canh, canh tác nhiều vụ liên tục môi trường lây lan thuận lợi cho bệnh nguy hiểm Ngoài giống lúa nhiễm rầy điều kiện thuận lợi cho bệnh phát triển diện rộng [12] 1.3 Các biện pháp phòng trừ 1.3.1 Biện pháp truyền thống Sự phát triển lây truyền bệnh virus tùy thuộc vào số lượng mang nguồn bệnh, số lượng hoạt động côn trùng truyền bệnh, mẫn cảm giống lúa với virus, với côn trùng truyền bệnh thời tiết Trước hết phải thực canh tác lúa theo tinh thần G, T, khơng bón thừa N, giảm mật độ sạ cấy, giảm sử dụng thuốc hóa học nhằm tạo cân sinh học diện rộng, bón phân cân đối tạo sức đề kháng cho lúa, sạ cấy thưa tạo điều kiện cho ánh sáng xuyên qua tán, sương mù tan nhanh lá, nhiệt độ tăng, ẩm độ giảm tán tạo bất lợi cho sâu bệnh phát triển Nên thăm đồng thường xuyên để phát rầy thật sớm Ngăn chặn bệnh suốt thời kỳ đầu giai đoạn sinh trưởng (giai đoạn mạ đến đẻ nhánh), cách nhổ bỏ lúa bị bệnh, cỏ dại ruộng, bờ, xung quanh ruộng, rầy nâu tiếp tục chích hút lúa bị bệnh mang virus phát tán nơi khác, lúa bị bệnh tồn ruộng mầm mống chứa virus, cày ải phơi đất diệt mầm virus gốc rạ Ở vùng vừa có dịch bệnh virus xảy ra: cày lật gốc rạ sau thu hoạch Gieo sạ đồng loạt diện rộng, nhằm hạn chế di chuyển quần thể rầy, chuyển tiếp nguồn thức ăn rầy mang virus lây lan diện rộng, khơng nên gieo trồng rải rác có liên quan đến vụ 3, nên tập trung vụ (cách tối thiểu 30 ngày) Dịch bệnh vàng lùn có liên quan mật thiết đến thời vụ gieo sạ liên tục ruộng, không gian thời gian tối hảo để dịch bệnh phát tán.Tăng cường sức đề kháng lúa virus, sử dụng số chất kích kháng hạn chế phát triển virus lúa K2HPO4, CuCl2 cho xử lý hạt, Humid acid (Risopla V) 1-1,5 kg/ha, bón lót tốt Khi phát có rầy nâu cánh dài giai đoạn mạ với mật độ từ 7-10 con/tép phải phun thuốc trừ rầy rầy di chuyển đến khả rầy mang mầm bệnh cao Có thể dùng loại thuốc trừ rầy nâu Actara, Applaud, Butyl… Tuy sử dụng thuốc hóa học làm giảm mật số rầy giải bệnh vàng lùn, truyền bệnh xảy rầy lúa khoảng thời gian ngắn Nên dùng giống kháng rầy, lúa giống có chất lượng tốt giống kháng biện pháp có hiệu kinh tế Tuy nhiên, giống kháng rầy nâu chưa kháng virus, bệnh vàng lùn phối hợp loại virus (RGSV, RRSV, RTSV), công tác lọc giống kháng phức tạp, cần có hổ trợ kinh phí để thực nghiên cứu Trong cấu giống lúa trồng phổ biến ĐBSCL (63 giống- kết điều tra Viện Lúa ĐBSCL 2005), số giống lúa tỏ chống chịu tốt rầy nâu bệnh vàng lùn, kể đến OM4498, OM4495, AS996, OM2395 Ngoài ra, số giống khác với diện tích nhỏ sản xuất OM576, IR50404, IR59606, MTL141, MTL392, MTL384 tỏ chống chịu tốt Một số giống lúa sản xuất thử tỏ chống chịu tốt với rầy nâu bệnh vàng lùn OM5930, MTL384, MTL392, MTL466, MTL499, MTL500 [11] 10 2.4.7 Phương pháp colony-PCR Sau nuôi khuẩn môi trường chọn lọc, khuẩn lạc trắng mẫu chọn lọc phản ứng colony-PCR với cặp mồi pUC 18F1 pUC 18-R1 nằm vector để xác định khuẩn lạc có plasmid mang gen mong muốn Thành phần phản ứng colony-PCR Bảng 2.4 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng Colony - PCR STT Thành phần Thể tích (µl) H20 11,7 Buffer 10X MgCl2 dNTPs RGSV – CP - F 0,8 RGSV - CP - R 0,8 Taq DNA polymerase 0,7 Khuẩn lạc Chu kỳ nhiệt độ tối ưu hóa Bảng 2.5: Bảng 2.5 Chu kỳ nhiệt phản ứng Colony - PCR STT Nhiệt độ (0C) Thời gian 95 phút 94 30 giây 53 30 phút 72 phút Từ 2-4 lặp lại 10 chu kỳ 94 30 giây 55 30 giây 72 phút Từ - lặp lại 30 chu kỳ 29 Điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR gel Agarose 0,8% để chọn khuẩn lạc mang gen có kích thước mong muốn Ni khuẩn lạc vào 3ml LB lỏng có bổ sung ampicillin 100mg/l để tách plasmid 2.4.8 Tách chiết plasmid Các dòng khuẩn lạc trắng có sản phẩm colony-PCR mong muốn chọn lọc nuôi ml LB lỏng có bổ sung ampicillin 100 mg/l để tiến hành tách plasmid theo hướng dẫn Kit Accuprep® Plasmid Extraction Kit (Bioneer) Phương pháp cụ thể sau: Lấy dịch khuẩn nuôi qua đêm cho vào ống eppendorf ml, ly tâm 8000 vòng/phút phút Bổ sung 250 µl đệm RS ly tâm nhanh Bổ sung 250 µl đệm BL hồ trộn nhẹ, để nhiệt độ phòng phút Bổ sung 350 µl đệm NE đảo nhẹ nhàng Ly tâm 13000 vòng/phút 10 phút Chuyển hỗn hợp dung dịch qua cột tách plasmid, ly tâm 13000 vòng/phút phút, loại bỏ dịch chảy qua cột Thêm 500 µl DE, chờ phút, ly tâm 13000 vòng/phút phút loại bỏ dịch Bổ sung 700 µl WP ly tâm 13000 vịng/phút phút, loại bỏ dịch, ly tâm tiếp phút Chuyển cột tách plasmid sang ống eppendorf mới, bổ sung 40 µl đệm EL cho vào cột, chờ 2-3 phút, ly tâm 13000 vòng/phút phút Để khẳng định lại plasmid có chứa đoạn gen dự tính, plasmid cắt kiểm tra enzym cắt hạn chế BamHi 30 2.4.9 Cắt plasmid enzym BamHI Bảng 2.6 Thành phần phản ứng STT Thành phần Thể tích H20 3.5 Fast Digest Buffer Plasmid Enzym BamHI 0.5 Sau đó:  Ủ 370 C phút  Ủ 800 C 10 phút  Điện di để kiểm tra 2.4.10 Xác định trình tự nucleotide Các gen RGSV xác định trình tự máy đọc trình tự tự động ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer cách sử dụng hoá chất sinh chuẩn BigDye® Terminor v3.1 Cycle Sequencing 2.4.11 Phân tích trình tự nucleotide gen thu So sánh trình tự thu với trình tự gen BLAST NCBI để xác nhận gen tách dòng đoạn gen quan tâm RGSV Sau so sánh trình tự RGSV tỉnh thành khác với để đánh giá mức độ tương đồng di truyền cá thể phân lập tỉnh khác 31 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết RT_PCR RNA tổng số sau tách chiết sử dụng cho phản ứng RT_PCR để nhân đoạn gen CP RGSV với cặp mồi đặc hiệu thiết kế Hiệu phản ứng RT-PCR giảm nguyên nhân như: lượng RNA virus quá nhiều, nồng độ mồi cao thấp, nhiệt độ bắt cặp mồi chưa phù hợp, số chu kỳ chạy cao thấp… Vì trình thực phản ứng tiến hành điều chỉnh lượng mẫu, nồng độ mồi, lượng Mg2+, nhiệt độ bắt cặp mồi, … để đảm bảo cho phản ứng RT-PCR xảy đặc hiệu thành phần hỗn hợp phản ứng chu kỳ nhiệt phản ứng tối ưu hoá (Như nêu 2.4.2) Nếu phản ứng xảy đặc hiệu theo lý thuyết thu băng DNA xuất điện di có kích thước khoảng 1000 bp Sản phẩm điện di gel Agarose 0,8% Hình 3.1 Kết RT-PCR, 1, 2, Ninh Thuận, (−) Đ/c âm M Thang DNA ~ kb 32 Kết RT_PCR điện di kiểm tra gel agarose 0,8% (Hình 3.1) cho thấy nhân đoạn DNA đặc hiệu có kích thước phù hợp với kích thước đoạn gen CP dự tính thiết kế mồi (khoảng 1000 bp) Như vậy, đoạn gen CP nhân lên với cặp mồi RGSV – CP – R RGSV CP – F nhiệt độ gắn mồi 53o C 55ºC Trong nghiên cứu chạy phản ứng RT – PCR với 35 chu kỳ Để xác định xác đoạn gen quan tâm hay khơng tiến hành tách dịng gen giải trình tự 3.2 Kết tách dòng Trước tách dòng, sản phẩm PCR điện di kiểm tra để tiến hành làm (thôi gel) để loại bỏ tạp chất giúp cho bước chọn dịng dễ dàng Sản phẩm thơi gel gắn vào vector tách dòng pBT nhân chủng E.coli DH5α Sản phẩm gel gắn vào vector tách dòng xúc tác T4 ligase lượng ATP dung dịch đệm Các đoạn DNA gắn vào vector pBT Phản ứng gắn dựa vào hình thành mối liên kết photphodieste nucleotide Adenin nhô đầu 3’ sản phẩm PCR nucleotide Thymine nhô đầu 5’ vector Hỗn hợp phản ứng ủ 220C để phản ứng xảy hoàn toàn Vector tái tổ hợp sau biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α cấy trải rên môi trường LB đặc có bổ sung ampicillin 100 mg/l, X-gal 40 mg/l IPTG 100µM Sau đó, ủ đĩa Petri 370C 16 Thành cơng thí nghiệm phụ thuộc vào yếu tố chính: Thứ nhất: Sản phẩm PCR phải có chất lượng tốt q trình gắn vào vector đạt hiệu cao Thứ hai: Tế bào khả biến phải chuẩn bị tốt, đảm bảo chất lượng tăng hiệu suất biến nạp Thứ ba: Vector tách dòng phải bảo quản tốt, xử lý tránh tự đóng vịng… Trên mơi trường có chứa kháng sinh ampicillin, X-gal IPTG, phát triển loại khuẩn lạc: khuẩn lạc xanh khuẩn lạc trắng Tất khuẩn lạc khuẩn lạc biến nạp plasmid chứa gen kháng kháng sinh ampicillin Những khuẩn lạc màu trắng dòng tế bào mang plasmid có 33 gen lac Z bị phá vỡ DNA lạ chèn vào đứt gãy đầu vector trước đóng vịng Những khuẩn lạc màu xanh khuẩn lạc vi khuẩn E.coli chứa plasmid pBT nguyên vẹn có gen lac Z hoàn chỉnh sản xuất enzyme β-galactosidase Enzym phân huỷ chất X-gal có mơi trường tạo nên dẫn xuất indol, dẫn xuất ngồi mơi trường bị oxy hố tạo thành màu xanh Hình 3.2 Kết biến nạp plasmid pBT mang đoạn gen CP vào E.coli DH5α Tiến hành chọn mười khuẩn lạc trắng để chạy phản ứng colonyPCR với cặp mồi pUC18-F1 pUC18-R1 để xác định khuẩn lạc có mang plasmid chứa đoạn gen quan tâm.Vì cặp mồi nằm vector cách khoảng 200 bp nên khuẩn lạc có chứa plasmid mang gen sản phẩm PCR cho băng kích thước lớn kích thước gen khoảng 200 bp Ở không chạy colony – PCR với cặp mồi RGSV – CP – R RGSV – CP – F đặc hiệu nằm đoạn gen CP lý do: Khi gắn đoạn gen CP vào vector pBT, cịn lượng lớn đoạn DNA không gắn vào vector tồn hỗn hợp phản ứng Nên cấy trải dịch hỗn hợp lên 34 đĩa thạch lượng sản phẩm PCR định xung quanh khuẩn lạc, dễ chọn nhầm khuẩn lạc dương tính Sản phẩm colony – PCR điện di kiểm tra gel Agarose 0,8%, đồng thời nuôi khuẩn lạc môi trường LB lỏng bổ sung kháng sinh Ampicilin để nhân dòng nhằm tạo lượng plasmid tái tổ hợp lớn phục vụ cho việc tách plasmid Kết điện di sản phẩm colony - PCR đoạn gen CP RGSV trình bày Hình 3.3 Hình 3.3 Kết colony-PCR dòng RGSV 1-14: Các dòng khuẩn lạc, (−) Đ/c âm, M Thang chuẩn ~ kb Từ kết điện di Hình 3.3 cho thấy đường chạy số 1, 2, 3, 7, 14 xuất băng DNA tương ứng với kích thước dự đốn (khoảng 1000 bp) Tại đường chạy số 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13 không xuất băng DNA quan tâm Như vậy, khuẩn lạc đường chạy số 1, 2, 3, 7, 14 cho kết dương tính plasmid pBT có chứa đoạn gen có kích thước mong muốn Để khẳng định khuẩn lạc E coli có chứa plasmid pBT mang đoạn gen CP quan tâm tiến hành tách plasmid 35 3.3 Kết tách plasmid Các dịng khuẩn lạc trắng có sản phẩm colony-PCR mong muốn chọn lọc ni mơi trường LB lỏng có chứa kháng sinh ampicillin để tiến hành tách plasmid Kit AccuPrep®Gel Gel Purification Kit Để khẳng định lại plasmid có chứa đoạn gen dự tính, plasmid cắt kiểm tra enzym cắt hạn chế BamHI (Hình 3.4) ←1Kb Hình 3.4 Kết cắt plasmid enzym giới hạn BamHI (-).Đối chứng âm Ninh Thuận, M Thang DNA ~ kb 3.4 Kết xác định trình tự nucleotide Plasmid dịng khuẩn lạc có kết PCR cắt BamHI cho sản phẩm mong muốn đọc trình tự máy xác định trình tự tên máy ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer Các trình tự thu được xử lý phần mềm DNA star, BioEdit Kết xác định trình tự cho thấy phân đoạn DNA tách dịng có kích thước giống kích thước dự kiến thiết kế mồi (khoảng 1000 bp) Mặt khác kết xác định trình tự cịn cho biết đoạn gen tách dòng gen quy định protein vỏ (CP) Gen CP Ninh Thuận có kích thước 978 nucleotide tương ứng với 326 amino acid trình bầy Hình 3.5 36 ATGGGTAAAGTGCAGTTTGGAGATGGTCACTGGGCAAATAACAAGGAATGGTCTGAGTTGTTATCAGAAA TATTTTCAAAAATCAGAGCATCTATAGATGGATTTGCCAATGCTACAGCTGATTTGGCTGCAGGATTGGA GTATCAGGCTTTCAATCCTGAAAAGATTTTGAGGAAGTTGATTGCATCCTCAACTTCATTGGATGACTTT GTTAAGGATATGCGTGACCTCTTGGTGGCCAGGTACACCAGAGGAACTAGCTTCTTGTTCAATGCTAAAA ACTCAATTGAGAAAGCAAAGGATAAGAAGAAGGCTGAAGCTATTCAGGTACTGATAAATAGGTACGGAGT AAAAAAGAATGCTGGTGACAATGCTGTTGATCAAGCCACTTTGGGAAGGATAAGTCAAGTGTTGGCATAT ATGGCCTTGAGAGTTGCTTTACAAATCACAGACTATCATAAGCCAATCATACCATTGAGACCCATTAGTA CCGTTGATATAAAGAATGCTATCATTGATGTTGTTCCACAATTCTTATATCTTAAAGCAGATCAACTTGA TTCAAAGACCAACTCAGAGGCAGCCCTGTATGTAATCCATTTGTGTTACCAAGTCTGTGTGTCTGAAAGA ATCATGACTAAAGCTCAGAAAGATAAGCACGGTGTTCACACTAAGTCAGCAATGATAACACACTGCATGG GTTTTGTCAATCTGGCTATGGATAATTCTTCAGTAGTGTCTGATGATAAGATAGCTGGTAGAAGGATGAT CTCAGGTCCATGGGGACTACAGGAAACTGCTCTAGATGCCACAGGCTGCGCATGTATCATTGATGTTGTT GATTTCTGCTGCAGGGGACACAAAGTAACAGATGCTGTGGCGCCAGTTCGGCTGTTCAGATTAGCTATTG AGTGCATAAAAGACACAGCTGATCTGAAGGATGCTGGAGTCAAATTGAAGACTCTGGTTGATAAGTGA Hình 3.5 Trình tự gen CP RGSV dòng Ninh Thuận ( FM882252) 3.5 So sánh trình tự nucleotide đoạn gen CP với trình tự công bố So sánh độ tương đồng (ở mức độ nucleotide) trình tự đoạn gen CP RGSV Việt Nam (ST1 – Sóc Trăng 1, TG2 – Tiền Giang 2, VL1 – Vĩnh Long , BL2 – Bạc Liêu 2, BT – Bình Thuận, NT – Ninh Thuận, DT – Đồng Tháp) với trình tự chủng công bố giới từ GenBank (AB023779 – Nhật Bản, AF290947 – Trung Quốc, AB000403 – Nhật Bản) Bảng 3.1 Từ dịng phân lập Việt Nam có độ tương đồng cao, giao động từ 97,5% - 99,8% cao 99,8% ( Ninh Thuận – Bình Thuận) thấp 97,5% ( Tiền Giang – Đồng Tháp) Còn so sánh với dòng giới độ tương đồng dao động từ 96,7% - 98.8%, cao 98,8% thấp 96,7% 37 Hệ số khác Hệ Số giống Bảng 3.1 Hệ số tương đồng sai khác trình tự nucleotide gen CP Cụ thể tiến hành so sánh trình tự nucleotide đoạn gen CP dòng Ninh Thuận - Việt Nam (FM882252) với dịng Tokyo - Nhật Bản (AB000403) (Hình 11) phát thấy 18 điểm không tương đồng (do thay đổi bazơ loại purin (A T) pyrimidine (G C) cho nhau) Hình 3.6 NT NB 2535 NT 61 NB 2475 NT 121 NB 2415 NT 181 NB 2355 NT 241 NB 2295 NT 301 NB 2235 NT 361 NB 2175 NT 421 NB 2115 ATGGGTAAAGTGCAGTTTGGAGATGGTCACTGGGCAAATAACAAGGAATGGTCTGAGTTG |||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| A - 60 TTATCAGAAATATTTTCAAAAATCAGAGCATCTATAGATGGATTTGCCAATGCTACAGCT || ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| G - 120 GATTTGGCTGCAGGATTGGAGTATCAGGCTTTCAATCCTGAAAAGATTTTGAGGAAGTTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 180 ATTGCATCCTCAACTTCATTGGATGACTTTGTTAAGGATATGCGTGACCTCTTGGTGGCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 240 AGGTACACCAGAGGAACTAGCTTCTTGTTCAATGCTAAAAACTCAATTGAGAAAGCAAAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||| T - 300 GATAAGAAGAAGGCTGAAGCTATTCAGGTACTGATAAATAGGTACGGAGTAAAAAAGAAT |||||||||||||| ||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||| A -A - 360 GCTGGTGACAATGCTGTTGATCAAGCCACTTTGGGAAGGATAAGTCAAGTGTTGGCATAT ||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| -A 420 ATGGCCTTGAGAGTTGCTTTACAAATCACAGACTATCATAAGCCAATCATACCATTGAGA ||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| -A 480 38 2476 2416 2356 2296 2236 2176 2116 2056 NT 481 NB 2055 NT 541 NB 1995 NT 601 NB 1935 NT 661 NB 1875 NT 721 NB 1815 NT 781 NB 1755 NT 841 NB 1695 NT 901 NB 1635 NT 961 NB 1575 CCCATTAGTACCGTTGATATAAAGAATGCTATCATTGATGTTGTTCCACAATTCTTATAT |||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||| |||||| T T 540 CTTAAAGCAGATCAACTTGATTCAAAGACCAACTCAGAGGCAGCCCTGTATGTAATCCAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||| T - 600 TTGTGTTACCAAGTCTGTGTGTCTGAAAGAATCATGACTAAAGCTCAGAAAGATAAGCAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||| G - 660 GGTGTTCACACTAAGTCAGCAATGATAACACACTGCATGGGTTTTGTCAATCTGGCTATG |||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||| A C C - 720 GATAATTCTTCAGTAGTGTCTGATGATAAGATAGCTGGTAGAAGGATGATCTCAGGTCCA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 780 TGGGGACTACAGGAAACTGCTCTAGATGCCACAGGCTGCGCATGTATCATTGATGTTGTT ||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||| -G 840 GATTTCTGCTGCAGGGGACACAAAGTAACAGATGCTGTGGCGCCAGTTCGGCTGTTCAGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||| A - 900 TTAGCTATTGAGTGCATAAAAGACACAGCTGATCTGAAGGATGCTGGAGTCAAATTGAAG ||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||| ||||||||| -T T - 960 ACTCTGGTTGATAAGTGA |||||||||||||||||| 1996 1936 1876 1816 1756 1696 1636 1576 978 1558 Hình 3.6 So sánh trình tự nucleotide gen CP Ninh Thuận (Việt Nam) Tokyo (Nhật Bản) Khi so sánh trình tự nucleotide đoạn gen CP dịng Ninh Thuận (FM882252) Bình Thuận (FM882251) - Việt Nam với dịng Tokyo (AB000403) - Nhật Bản (Hình 3.7) nhận thấy dịng Ninh Thuận Bình Thuận có điểm khơng tương đồng (do thay đổi loại bazơ loại purin cho nhau), dịng Bình Thuận – Việt Nam với dòng Tokyo - Nhật Bản 20 điểm không tương đồng (do thay đổi bazơ loại purin cho pyrimidine cho nhau) 39 NT 60 NB ATGGGTAAAGTGCAGTTTGGAGATGGTCACTGGGCAAATAACAAGGAATGGTCTGAGTTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| -|||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 2535 A - NT 61 120 NB TTATCAGAAATATTTTCAAAAATCAGAGCATCTATAGATGGATTTGCCAATGCTACAGCT |||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||| 61 C || ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 2475 G - NT 121 180 NB GATTTGGCTGCAGGATTGGAGTATCAGGCTTTCAATCCTGAAAAGATTTTGAGGAAGTTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 121 -|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 2415 NT 181 240 NB ATTGCATCCTCAACTTCATTGGATGACTTTGTTAAGGATATGCGTGACCTCTTGGTGGCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 181 -|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 2355 NT 241 300 NB AGGTACACCAGAGGAACTAGCTTCTTGTTCAATGCTAAAAACTCAATTGAGAAAGCAAAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 241 -|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||| 2295 T - NT 301 360 NB GATAAGAAGAAGGCTGAAGCTATTCAGGTACTGATAAATAGGTACGGAGTAAAAAAGAAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 301 -|||||||||||||| ||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||| 2235 A -A - NT 361 420 NB GCTGGTGACAATGCTGTTGATCAAGCCACTTTGGGAAGGATAAGTCAAGTGTTGGCATAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 361 -||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 2175 -A NT 421 480 NB ATGGCCTTGAGAGTTGCTTTACAAATCACAGACTATCATAAGCCAATCATACCATTGAGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 421 -||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 2115 -A NT 481 540 NB CCCATTAGTACCGTTGATATAAAGAATGCTATCATTGATGTTGTTCCACAATTCTTATAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 481 -|||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||| |||||| 2055 T T NT 541 600 BT BT BT BT BT BT BT BT BT BT NB CTTAAAGCAGATCAACTTGATTCAAAGACCAACTCAGAGGCAGCCCTGTATGTAATCCAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||| 541 T |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||| 1995 T - 40 60 2476 120 2416 180 2356 240 2296 300 2236 360 2176 420 2116 480 2056 540 1996 600 1936 NT 660 NB TTGTGTTACCAAGTCTGTGTGTCTGAAAGAATCATGACTAAAGCTCAGAAAGATAAGCAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 601 -|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||| 1935 G - NT 661 720 NB GGTGTTCACACTAAGTCAGCAATGATAACACACTGCATGGGTTTTGTCAATCTGGCTATG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 661 -|||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||| 1875 A C C - NT 721 780 NB GATAATTCTTCAGTAGTGTCTGATGATAAGATAGCTGGTAGAAGGATGATCTCAGGTCCA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 721 -|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 1815 NT 781 840 NB TGGGGACTACAGGAAACTGCTCTAGATGCCACAGGCTGCGCATGTATCATTGATGTTGTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 781 -||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||| 1755 -G NT 841 900 NB GATTTCTGCTGCAGGGGACACAAAGTAACAGATGCTGTGGCGCCAGTTCGGCTGTTCAGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 841 -|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||| 1695 A - NT 901 960 BT BT BT BT BT 601 NB TTAGCTATTGAGTGCATAAAAGACACAGCTGATCTGAAGGATGCTGGAGTCAAATTGAAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 901 -||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||| ||||||||| 1635 -T T - NT 961 BT BT NB ACTCTGGTTGATAAGTGA |||||||||||||||||| 961 -|||||||||||||||||| 1575 660 1876 720 1816 780 1756 840 1696 900 1636 960 1576 978 978 1558 Hình 3.7 So sánh trình tự nucleotide gen CP RGSV Ninh Thuận, Bình Thuận Nhật Bản Như vậy, độ tương đồng trình tự nucleotide đoạn gen CP Ninh Thuận Bình Thuận lớn 978 nucleotide có nucleotide sai khác Cịn so sánh với trình tự nucleotide gen CP dịng Tokyo – Nhật Bản 978 nucleotide có 18 nucleotide sai khác đoạn gen CP dòng Ninh Thuận – Việt Nam 20 nucleotide sai khác đoạn gen CP dịng Bình Thuận – Việt Nam Điều cho thấy độ tương đồng trình tự 41 nucleotide gen CP Ninh Thuận, Bình Thuận – Việt Nam Tokyo – Nhật Bản cao 3.6 Đánh giá đa dạng di truyền Cây phát sinh chủng loại xây dựng theo phương pháp tối đa Maximum Parsimony (MP) phương pháp Neighbor Joining (NJ), sử dụng kết so sánh ClustalX trình tự gen NCP tỉnh Ninh Thuận với số trình tự gen NCP đại diện cho dòng RGSV khác Việt Nam giới VL 1.s e q BL 2.s e q BT(FM8 822 51).s eq NT(FM8 822 52).s eq TG2.s e q ST1.s e q DT2.s e q AB 0237 79.s eq AF2909 47.s eq AB 0004 03.s eq 1.3 Nu cleo tide S ubs tituti ons ( x100 ) Hình 3.8 Cây phát sinh chủng loại dựa trình tự gen CP (ST1 – Sóc Trăng 1, TG2 – Tiền Giang 2, VL1 – Vĩnh Long , BL2 – Bạc Liêu 2, BT – Bình Thuận, NT – Ninh Thuận, DT – Đồng Tháp) – Việt Nam (AB023779 – Nhật Bản, AF290947 – Trung Quốc, AB000403 – Nhật Bản) – Thế giới Nhìn vào phân loại dựa so sánh trình tự gen CP, ta chia dịng RGSV thành nhóm lớn nhóm lớn gồm phân nhóm nhỏ Các dịng Việt Nam thuộc nhóm, chủng Thế giới thuộc nhóm Trong đó, dịng Ninh Thuận thuộc phân nhóm với Bình Thuận tức chúng có độ tương đồng lớn 42 KẾT LUẬN, ĐỀ NGHỊ Kết luận  Việc sử dụng kỹ thuật RT-PCR cặp mồi RGSV-F/RGSV-R thích hợp đặc hiệu cho đoạn gen CP RGSV áp dụng quy trình cho việc chẩn đốn lúa bị nhiễm RGSV  Chúng tơi tách dịng xác định trình tự đoạn gen CP RGSV mẫu lúa thu tỉnh Ninh Thuận  So sánh mức độ tương đồng nucleotide, đánh giá đa dạng di truyền gen CP tỉnh Ninh Thuận với số tỉnh thành khác với giới cho thấy chủng RGSV có độ tương đồng di truyền cao Đề nghị  Tiếp tục hoàn thành việc giải mã gen lại gen RGSV tỉnh Ninh Thuận tỉnh thành khác Việt Nam 43