Nghiên cứu về hệ enzyme đã mở ra cánh cửa cho việc xác định các protein có khả năng ứng dụng trong điều trị bệnh. Một số protein đã được nghiên cứu và hiện đã được tạo thành thuốc chữa bệnh sử dụng trong y học. Khi đã được xác định, những protein này cần được nghiên cứu kỹ, bao gồm việc biểu hiện protein ở các sinh vật mẫu nhờ sử dụng các kỹ thuật DNA.Việc biểu hiện một gene để sản xuất lượng lớn protein gặp nhiều vấn đề rắc rối hơn so với việc sản xuất ở quy mô phòng thí nghiệm. Càng có nhiều bản sao của một gene trong một tế bào thì mức độ biểu hiện sản phẩm của gene càng cao. Do đó, việc đưa gene vào một plasmid có nhiều bản sao trong mỗi tế bào sẽ cho năng suất sản phẩm cao hơn. Tuy nhiên, plasmid có số bản sao lớn lại thường không ổn định và thường thất thoát, đặc biệt khi nuôi cấy ở quy mô công nghiệp có mật độ cao. Một phương pháp để ngăn chặn sự thất thoát plasmid là đưa gene ngoại lai chèn vào nhiễm sắc thể của tế bào chủ. Hiện nay, các nhà khoa học đã cố gắng để đưa nhiều bản sao của một gene ngoại sinh nằm liên tiếp nhau vào nhiễm sắc thể tế bào chủ. Tuy nhiên sự có mặt của nhiều bản sao một gene lại tạo ra sự không ổn định do sự tái tổ hợp giữa các trình tự DNA tương đồng.Việc biểu hiện protein tái tổ hợp ở thực vật hiện đang được quan tâm nghiên cứu vì những ưu điểm hơn so với các hệ thống biểu hiện khác như chúng có thể sinh trưởng trên môi trường tương đối đơn giản, protein được tiết ra môi trường nhiều hơn phần tích luỹ trong tế bào nên việc thu hồi và tinh sạch dễ thực hiện, đặc biệt protein tái tổ hợp có nguồn gốc thực vật an toàn cho con người hơn so với các protein có nguồn gốc từ các hệ thống nuôi cấy khác do các chất nhiễm bẩn và virus thực vật không phải là tác nhân gây bệnh ở người.
MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Nghiên cứu về hệ enzyme đã mở cánh cửa cho việc xác định các protein có khả năng ứng dụng điều trị bệnh Một số protein đã nghiên cứu hiện đã tạo thành thuốc chữa bệnh sử dụng y học Khi đã xác định, những protein cần nghiên cứu kỹ, bao gồm việc biểu hiện protein ở các sinh vật mẫu nhờ sử dụng các kỹ thuật DNA Việc biểu hiện một gene để sản xuất lượng lớn protein gặp nhiều vấn đề rắc rối hơn so với việc sản xuất ở quy mô phòng thí nghiệm Càng có nhiều bản của một gene một tế bào thì mức độ biểu hiện sản phẩm của gene cao Do đó, việc đưa gene vào một plasmid có nhiều bản mỗi tế bào se cho năng suất sản phẩm cao hơn Tuy nhiên, plasmid có số bản lớn lại thường không ổn định thường thất thoát, đặc biệt nuôi cấy ở quy mô công nghiệp có mật độ cao Một phương pháp để ngăn chặn sự thất thoát plasmid đưa gene ngoại lai chèn vào nhiễm sắc thể của tế bào chủ Hiện nay, các nhà khoa học đã cố gắng để đưa nhiều bản của một gene ngoại sinh nằm liên tiếp vào nhiễm sắc thể tế bào chủ Tuy nhiên sự có mặt của nhiều bản một gene lại tạo sự không ổn định sự tái tổ hợp giữa các trình tự DNA tương đồng Việc biểu hiện protein tái tổ hợp ở thực vật hiện quan tâm nghiên cứu vì những ưu điểm hơn so với các hệ thống biểu hiện khác chúng có thể sinh trưởng trên môi trường tương đối đơn giản, protein tiết môi trường nhiều hơn phần tích luỹ tế bào nên việc thu hồi tinh dễ thực hiện, đặc biệt protein tái tổ hợp có nguồn gốc thực vật an toàn cho người hơn so với các protein có nguồn gốc từ các hệ thống nuôi cấy khác các chất nhiễm bẩn virus thực vật không phải tác nhân gây bệnh ở người Mục tiêu chuyên đề Chuyên đề nhằm mục tiêu tổng hợp, làm rõ hơn khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp ở một số hệ thống nuôi cấy, đặc biệt các hệ thống nuôi cấy ở thực vật, những thuận lợi khó khăn sản xuất protein tái tổ hợp của phương pháp, hệ thống biểu hiện Nội dung chuyên đề Chuyên đề trình bày theo nội dung sau Chương Sơ lược một số hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp Chương Hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp ở thực vật CHƯƠNG SƠ LƯỢC MỘT SỐ HỆ THỐNG BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP Sản xuất protein tái tổ hợp tế bào vi khuẩn E coli 1.1 Đặc điểm E coli sản xuất protein tái tổ hợp Escherichia coli vi khuẩn gram âm, hiếu khí tùy ý, hình que, có kích thước khoảng 0,3-1,0 x 1,0-6,0μm, di động, tìm thấy khắp nơi tự nhiên Do chúng có khả năng phát triển rất mạnh (thời gian thế hệ khoảng 20 phút) nhu cầu dinh dưỡng đơn giản nên sử dụng công nghiệp các mục đích về y học Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu của E coli 37 oC, pH 6,0 7,0 Thành phần môi trường tối thiểu để E coli phát triển glucose 0,5%, Na2HPO4 0,6%, KH2PO4 0,3%, NH4Cl 0,1%, NaCl 0,05%, MgSO4 0,012%, CaCl2 0,001% Ngoài ra, tùy theo loài E coli khác mà có những môi trường chọn lọc khác [75] Hình 1.1 Hình thái tế bào E coli (a) Dưới kính hiển vi quang học, (b) Dưới kính hiển vi điện tử E coli tế bào chủ đầu tiên sử dụng để tạo DNA tái tổ hợp sản xuất các protein tái tổ hợp dùng làm thuốc phục vụ cho y học Từ đầu thập niên 1990 đến nay, hầu hết người ta sử dụng E coli làm chủng chủ để sản xuất các protein tái tổ hợp phục vụ các lĩnh vực khác của đời sống người Tuy vậy, việc sử dụng E coli có một số ưu-nhược điểm nhất định so với các hệ thống khác [25] Nói chung, hệ thống E coli có những ưu điểm sau: thao tác gen đơn giản, hiệu suất biểu hiện cao, có thể đạt 50% tổng protein tế bào; có thể lên men mật độ cao bằng môi trường nuôi cấy rẻ tiền hệ thống thiết bị đơn giản Tuy nhiên, hệ thống có một số nhược điểm như: đối với gen có nguồn gốc từ eukaryote thì cần tạo dòng bằng cách dùng cDNA thay đổi codon hiếm ở gen ban đầu bằng codon phổ biến ở E coli; cần phải tái gấp cuộn để thu nhận protein có cấu hình tự nhiên vì đa số trường hợp protein tái tổ hợp tạo dưới dạng thể vùi E coli; không có hệ thống glycosyl hóa; có sự hiện diện của nhiều enzyme protease Nhược điểm có thể khắc phục bằng cách dùng chủng chủ E coli đột biến không có protease 1.2 Các chủng E coli thường dùng sản xuất protein tái tổ hợp Nhiều chủng E coli khác đã nghiên cứu thiết lập để biểu hiện protein tái tổ hợp bằng các vector biểu hiện khác Khi lập phương án sản xuất protein tái tổ hợp E coli cần lựa chọn hệ thống vector biểu hiện chủng chủ thích hợp cho protein mục tiêu Sau một số chủng E coli tiêu biểu sử dụng dụng cho mục đích biểu hiện [75] a E coli BL21 Chủng chủ E coli BL21[F-, ompT, hsdS (rB-, mB-), gal] dạng đột biến khuyết protease OmpT Lon chủng chủ tốt nhất dùng để biểu hiện protein tái tổ hợp dung hợp với GST bằng hệ thống vector biểu hiện pGEX Tuy nhiên, có đặc tính biến nạp không tốt nên chủng không dùng cho mục đích dòng hóa Chủng E coli DH5α chủng mang alen recA1 giúp cho quá trình biến nạp lưu trữ plasmid pGEX nên dùng cho mục đích tạo dòng thay cho E coli BL21 [13, 56] b E coli BL21 (DE3) pLysS Chủng E coli BL21(DE3)[F-, ompT, hsdSB (rB-, mB-), gal, dcm(DE3)] thường dùng biểu hiện protein dung hợp với 6xHis bằng vector biểu hiện pET Hệ thống cho phép biểu hiện vượt mức protein đồng thời hạn chế tối đa hiện tượng phiên mã rò rỉ không có chất cảm ứng DNA bộ gen của chủng chủ chứa gen T7 mã hóa T7 RNA polymerase có nguồn gốc từ bacteriophage DE3 dạng tiềm tan Gen T7 chịu sự điều khiển của promotor lac Gen lacI có khả năng tạo một lượng lớn repressor của lac operon (lacO) tham gia kiểm soát âm sự phiên mã của T7 Hình 1.2 Cơ chế biểu gen hệ thống vector pET tế bào E coli (DE3)pLysS Sự ức chế phiên mã se hóa giải nhờ IPTG làm bất hoạt lacO [68, 75] Ngoài ra, chủng chủ có thể thiết kế chứa thêm plasmid pLysS gọi E.coli BL21(DE3)pLysS giúp tế bào chủ tổng hợp một lượng nhỏ T7 lysozyme có vai trò làm bất hoạt T7 RNA polymerase Vector pET có chứa T7 promotor nên các gen nằm ở phía sau promotor se phiên mã nhờ hoạt tính của T7 RNA polymerase của tế bào chủ Như vậy chủng chủ có đặc điểm hạn chế tối đa sự tổng hợp protein từ hệ thống vector biểu hiện pET không cảm ứng Cũng một số chủng chủ BL21 khác, chủng chủ E coli BL21 (DE3)pLysS (hoặc -pLysE) bị đột biến khuyết sản phẩm protease OmpT Lon nên hạn chế tối đa sự thủy phân không mong muốn của protein tổng hợp c E coli M15 (pREP4) E coli M15 (pREP4) cho phép biểu hiện protein tái tổ hợp vượt mức bằng hệ thống vector biểu hiện pQE Chủng chủ có mang plasmid pREP4 mang gen lac I mã hóa cho repressor LacI có vai trò ức chế sự phiên mã của gen nằm sau promotor T5 theo cơ chế kiểm soát âm không có chất cảm ứng Chủng chủ E.coli M15 (pREP4) có kiểu gen [Nals, Strs, Rifs, Thi-, Lac-, Ara+, Gal+, Mtl-, F-, RecA+, Uvr+, Lon+] Một chủng chủ khác có đặc điểm tương tự M15(pREP4) SG13009 (pREP4) Ngoài ra, có thể dùng một số chủng chủ khác để biểu hiện bằng hệ thống pQE E coli XL1 Blue, E coli JM109, E coli TG1 Tuy nhiên, các chủng chủ có mang pREP4 cho hiệu quả biểu hiện cao tránh hiện tượng rò rỉ phiên mã [97] d Chủng chủ Tuner Các chủng chủ TunerTM dạng đột biến làm mất gen lacY mã hóa cho lac permease chủng khuyết protease BL21, sử dụng cho các vector pGEX, pET Việc đột biến gen lac permease có tác dụng làm cho đồng bộ sự tiếp nhận chất cảm ứng IPTG tất cả các tế bào quần thể Khi thay đổi nồng độ của IPTG, sự biểu hiện có thể kiểm soát từ mức rất thấp đến mức tối đa Khi biểu hiện ở mức thấp, có thể làm tăng cường tính tan hoạt tính của các protein mục tiêu phức tạp [75] e Chủng chủ Rosetta Các chủng chủ RosettaTM dẫn xuất của các chủng Tuner nên chúng có đầy đủ các đặc tính ưu việt của chủng đột biến lacY của BL21 [75] Tuy nhiên chủng Rosetta còn có thêm đặc điểm khác mang plamid pRARE, mã hóa tRNAs cho các codon động vật, những codon rất hiếm gặp E coli, vậy có thể làm tăng cường tối đa sự biểu hiện Plasmid pRARE chọn lọc trên chloramphenicol có thể tương hợp với toàn bộ các vector thuộc họ pET f Chủng chủ Origami Chủng chủ Origami dẫn xuất từ K-12 đột biến cả hai gen mã hóa thioredoxin reductase (trxB) glutathione reductase (gor) Do vậy, chúng có khả năng tăng cường sự hình thành các cầu nối disulfide tế bào chất Những nghiên cứu gần cho thấy rằng Origami (DE3) làm tăng cường hoạt tính của protein mục tiêu lên gấp 10 lần so với các chủng chủ thông thường mặc dù tổng lượng protein biểu hiện cả quá trình Các chủng chủ Origami có thể tương thích với các plasmid kháng ampicillin thích hợp cho việc sử dụng với các vector pET-43.1, pET-44 pET-32 [75] g Chủng chủ Origami B Chủng chủ Origami B kết hợp tính năng gấp cuộn protein của E coli Origami sự kiểm soát biểu hiện chính xác của các chủng Tuner Các chủng mang bộ gen khuyết các protease của BL21 tương thích với các plasmid kháng ampicillin [75] h Chủng chủ Rosetta-gami Chủng chủ Rosetta-gami dẫn xuất từ chủng Origami mang plasmid pRARE mã hóa cho các tRNAs hiếm chủng K-12 đột biến trxB/gor để tăng cường sự hình thành các cầu nối disulfide tế bào chất Các chủng có thể tương hợp với các vector kháng ampicillin pET-43.1, pET-44 pET-32 i Chủng chủ AD494 Chủng chủ AD494 có dẫn xuất từ chủng đột biến trxB K-12, làm tăng cường sự hình thành các cầu nối disulfide tế bào chất Chủng đột biến trxB chọn lọc bằng karamycin vậy nên có thể dùng với các marker bla kháng ampicillin [75] 1.3 Các hệ thống vector biểu E coli 1.3.1 Hệ thống pGEX biểu protein dung hợp với GST Tất cả các vector pGEX đều có đặc điểm chung có chứa tac promotor (Ptac) điều khiển sự biểu hiện vượt mức của gen theo cơ chế kiểm soát âm cảm ứng bằng IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactoside) hoặc các chất tương đồng về cấu trúc Họ vector pGEX có gồm tất cả 13 vector tương tự vector pGEX- 2TK Hình 1.3 Sơ đồ hệ thống vector biểu pGEX 2TK Trong họ vector pGEX, có vector có vùng MCS rộng, chứa đến vị trí cắt giới hạn của các enzyme, giúp dễ dàng việc dòng hóa Vector pGEX2TK có vị trí MCS rất khác biệt so với các vector khác họ vector pGEX, thiết kế cho phép phát hiện các protein đã biểu hiện bằng cách đánh dấu trực tiếp in vitro Vùng MCS nằm về phía sau của trình tự nhận biết của kinase ly trích từ cơ tim [4] GST (Glutathione S-Transferase) họ enzyme có thể chuyển nhóm S của glutathione vào những cơ chất nitro các hợp chất của halogen, làm cho chúng bị khử độc tính [74] Hệ thống pGEX biểu hiện protein tái tổ hợp dung hợp với GST Trung tâm cơ chất của GST có ái lực cao đối với glutathione Đặc tính giúp việc thu nhận dễ dàng protein tái tổ hợp ở dạng dung hợp với GST GST còn có vai trò sự phát hiện protein dung hợp với GST bằng phương pháp so màu dựa vào hoạt tính của GST trên cơ chất tạo sản phẩm có màu CDNB (1-chloro-2-dinitrobenzene) hoặc bằng phương pháp miễn dịch dựa trên kháng thể đặc hiệu của GST Hệ thống gen dung hợp GST đã ứng dụng thành công nhiều lĩnh vực miễn dịch học phân tử [5], sản xuất vắc xin (đối với các protein có kích thước phân tử nhỏ dung hợp với GST thành kích thước lớn hơn làm tăng tính kháng nguyên), nghiên cứu tương tác protein-protein, hoặc tương tác protein-DNA [27, 44] 1.3.2 Hệ thống pET biểu protein dung hợp với 6xHis Hệ thống vector biểu hiện pET cho phép dòng hóa biểu hiện protein tái tổ hợp ở dạng dung hợp với một homooligohistidine (6xHis) tế bào E.coli Sự biểu hiện của gen mục tiêu kiểm soát bởi promotor T7 nhờ hoạt tính của T7 RNA polymerase của tế bào chủ biến đổi bởi phage T7 Vector biểu hiện chứa đoạn DNA mã hóa oligo-histidine gọi thẻ His (His-tag), đoạn có thể chứa hoặc hoặc 10 amino acid Tùy theo plasmid mà His-tag có thể dung hợp ở đầu N hay đầu C hay nằm ở giữa protein dung hợp với vai trò hỗ trợ việc tinh chế protein mục tiêu còn giúp cho sự phát hiện protein mục tiêu ở dạng dung hợp nhờ kháng thể chuyên biệt với His-tag Protein tái tổ hợp chứa 6xHis có thể thu hồi với độ tinh trên 90% bằng cách hấp phụ lên cột sắc ký Ni2+-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA), nhờ tương tác giữa 6xHis Ni 2+ sau đó ly giải ở pH thấp hoặc dùng chất kìm hãm cạnh tranh imidazone[68, 75] Hình 1.4 Cấu trúc vector biểu pET 43-1a(+) Hình 1.5 Tương tác protein dung hợp chứa 6xHis giá thể gắn Nikel 1.3.3 Hệ thống biểu dung hợp với MBP - Hệ thống pMAL Trong hệ thống này, gen mã hóa protein mục tiêu chèn vào vector pMAL từ gen malE, mã hóa cho protein kết gắn maltose, MBP (Maltose Binding Protein) Hệ thống sử dụng promotor mạnh Ptac để biểu hiện một lượng lớn protein dung hợp, sau đó thu nhận bằng sắc ký ái lực dựa vào ái lực đặc trưng của MBP với amylose [73] Hệ thống pMAL có khả năng biểu hiện cả ở tế bào chất chu chất với mức độ biểu hiện cao (100 mg / L) E coli làm tăng tính tan của protein dung hợp [74] Hình 1.6 Sơ đồ biểu thu nhận protein có gắn thẻ MBP 1.3.4 Hệ thống IMPACT biểu protein dung hợp với CBP Đặc điểm nổi bật của hệ thống IMPACT (Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding) tính năng tự cắt các đoạn protein dung hợp (intein) thu nhận tinh chế protein tái tổ hợp (phân tử intein từ Sac.cerevisiae VM1) [72] Phân tử intein biến đổi để có thể thực hiện phản ứng tự cắt liên kết peptide cảm ứng ở oC với các tác nhân thiol DTT (1,4-Dithiothreitol), β-Mercaptoethanol hoặc cysteine Trong hệ thống 10 dược phẩm sinh học tái tổ hợp Hơn nữa, rễ tơ có thể nuôi cấy tạo sinh khối liên tục, điều có ý nghĩa dây chuyền sản xuất các chất thứ cấp các dược phẩm sinh học tái tổ hợp Thêm vào đó, rễ biến nạp có mức phân hóa cao có thể nguồn sản xuất ổn định các hợp chất thứ cấp, các hệ thống nuôi cấy tế bào thực vật khác có tiềm năng di truyền hóa sinh không ổn định thường tổng hợp mức độ rất thấp các hợp chất thứ cấp [49] Quan trọng nhất A rhizogenes có thể chuyển T-DNA từ vector nhị thể cho phép các gen ngoại lai biểu hiện ở rễ tơ chuyển gen từ rễ tơ chuyển gen có thể tái sinh thành chuyển gen [18] Khi so sánh với thực vật chuyển gen, nuôi cấy rễ tơ thực vật có ưu điểm lớn công tác sản xuất các dược phẩm sinh học tái tổ hợp không đòi hỏi diện tích canh tác, không chịu ảnh hưởng vào khí hậu, mùa vụ, sản phẩm thu không mang các yếu tố độc hại từ thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ rút ngắn rất nhiều thời gian trồng trọt Đặc biệt hơn, việc biểu hiện dược phẩm sinh học tái tổ hợp môi trường nuôi cấy giúp làm đơn giản hơn rất nhiều quá trình tinh các dược phẩm sinh học A B C Hình 2.2 Rễ tơ thực vật A Trong môi trường đặc B Trong môi trường lỏng C Trong hệ thống nuôi cấy sinh khối lớn Biorector Hiện nay, nuôi cấy rễ tơ thực vật đã sử dụng cho quá trình sản xuất protein tái tổ hợp [100] các dược phẩm sinh học tái tổ hợp SEAP (human secreted alkaline phosphatase) [33], protein huỳnh quang kết hợp với protein 36 ricin B (GFP-ricin B) [62] đặc biệt hơn cả các kháng thể các chuỗi nặng, chuỗi nhẹ của kháng thể [24] Tương tự hệ thống biểu hiện BY2, việc sử dụng rễ tơ thực vật để biểu hiện protein tái tổ một hướng nghiên cứu triển vọng giúp sản xuất các sản phẩm tái tổ hợp ở quy mô phòng thí nghiệm 2.3.3 Cây chuyển gen Trên thế giới cho đến rất nhiều loài trồng đã chuyển gen thành công để sản xuất protein tái tổ hợp cà chua, đậu tương, lúa, ngô, bông, khoai tây, cải, hướng dương, dưa hấu, khoai lang… sử dụng những phương pháp phổ biến chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens, xung điện, bắn gen Gần đây, các nghiên cứu tập trung nhiều vào sản xuất hợp chất flavonoid (chất có nhiều tác dụng tích cực phòng chống ung thư) cà chua Đã có nhiều gen liên quan đến đường sinh tổng hợp flavonoid quan tâm nghiên cứu chuyển vào cà chua nhằm tăng sự tích lũy flavonoid [70] Cùng với khoai tây, chuối các loại trồng khác, cà chua thử nghiệm vào việc sản xuất cung cấp vaccine ăn [3] Năm 2001, Mor et al đã tiến hành biểu hiện acetylcholin esterase tái tổ hợp của người cà chua chuyển gen Enzym ứng dụng trị liệu Enzym thu từ các dòng cà chua chuyển gen có độ ổn định giữ hoạt tính giống enzym cơ thể người, có hoạt độ riêng cao, lên đến 25 nmol/phút/mg protein ở lá đạt tới 250 nmol/phút/mg protein ở quả [69] Các thử nghiệm lâm sàng đã tiến hành trên chuột bằng cách sử dụng kháng thể hoặc các protein kích thích sản xuất kháng thể kháng lại một số virus viêm gan B, virus dại, HIV, bệnh than virus hợp bào hô hấp [52] Một số nhà khoa học Hàn Quốc nghiên cứu việc sử dụng cà chua để biểu hiện một loại vaccine tái tổ hợp chống lại virus SAR [79] Năm 2013, Kantor đã tiến hành biểu hiện gen kháng nguyên PfCP của ký sinh trùng sốt rét (Plasmodium falciparum), nghiên cứu đã thu các dòng cà chua biểu hiện protein PfCP-2.9 (kháng nguyên lai của MSP1 AMA1 của ký sinh trùng sốt rét) Năm 2014, Chung et al đã biểu hiện 37 gen của protein khảm (HAV VP1-Fc) chứa gen VP1 của virus viêm gan A ở người (HAV) mảnh kháng thể Fc trên cà chua, protein tái tổ hợp VP1-Fc thu có khối lượng phân tử khoảng 68 kDa tinh sạch, sử dụng protein tái tổ hợp đã tinh để đánh giá đặc tính miễn dịch thông qua tiêm kháng nguyên lên màng bụng của chuột, nhóm nghiên cứu đã thu kháng thể đặc hiệu IgG huyết của chuột [19] Năm 2015, Jha et al đã tiến hành biểu hiện tinh chất ức chế α1-proteinase của người (α1-PI), một chất có tiềm năng y học Mức độ tích lũy của α1-PI tái tổ hợp chiếm từ 1,5-3,2% protein tan tổng số, enzym biểu hiện có hoạt tính sinh học cao Phân tích khối phổ của α1-PI cho thấy cấu trúc của α1-PI có độ tương đồng với α1-PI tự nhiên Kết quả mở hướng nghiên cứu sử dụng thực vật các bioreactor để sản xuất các protein dược phẩm có hoạt tính sinh học ổn định [43] Năm 2012, Phan Tường Lộc cộng sự đã chuyển thành công gen HIV-1 p24 gen aadA vào lục lạp thuốc lá Virginia (V2), giống thuốc lá nhập nội thuần hóa ở Việt Nam cho năng suất cao Gen HIV-1 p24 mã hóa cho protein p24 kháng nguyên vỏ của HIV Protein tái tổ hợp p24 ứng dụng nhiều nghiên cứu điều chế vaccine đa thành phần kit chẩn đoán HIV Gen aadA quy định tính kháng hai loại kháng sinh spectinomycin streptomycin, dùng làm marker chọn lọc chuyển gen 38 KẾT LUẬN Hiện nay, có rất nhiều hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp khác Mỗi hệ thống đều có những ưu điểm nhược điểm riêng so sánh các tiêu chí chi phí, tốc độ, khả năng đường hóa, khả năng cuộn gấp sau dịch mã hay khả năng kiểm soát việc biểu hiện Cho đến nay, các tế bào vi khuẩn phương tiện rẻ nhất nhanh nhất để biểu hiện protein tái tổ hợp, chúng không thể đường hóa protein hoặc khó giúp các protein từ động vật có vú cuộn gấp Tế bào động vật có vú giúp protein tái tổ hợp đó cuộn gấp đường hóa tốt việc trì chúng lại đắt đỏ Hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp ở thực vật, cho thấy có nhiều ưu điểm hơn cả chi phí thấp, khả năng mở rộng nhanh chóng đơn giản Đặc biệt, các protein tái tổ hợp có nguồn gốc từ thực vật không chứa các mầm bệnh cho người, đồng thời chúng có khả năng gấp nếp lắp ráp các protein phức tạp một cách chính xác Chính vì những lý đó, hiện thực vật sử dụng khá rộng rãi công nghệ protein tái tổ hợp nhằm sản xuất các hormone, vaccine cần thiết an toàn cho người 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đỗ Thị Hồng (2005), “Nghiên cứu biểu vùng gen preM-env của virus Dengue typ nấm men Pichia pastoris”, Luận văn thạc sĩ khoa học sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Nguyễn Thị Trung (2002), “Phân lập biểu gen mã hóa β - Amylase của đậu tương nấm men Pichia pastoris”, Luận văn thạc sĩ khoa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Alvarez M, Pinyerd H, Crisantes J, Rigano M, Pinkhasov J, Walmsley A,Mason H, Cardineau G (2006), “Plant-made subunit vaccine against pneumonic and bubonic plague is orally immunogenic in mice”, Vaccine 24(14):2477-2490 Amersham pharmacia biotech, “pGEX vectors (GST Gene Fusion System)”, Third Edition, Rev 2, 18-1123-20 Amersham, “GST Gene Fusion System Handbook”, Edition AA, 18-115758 Aviezer D, Almon-Brill E, Shaaltiel Y, Galili G, Chertkoff R, Hashmueli S, Galun E, Zimran A (2008), “Novel enzyme replacement therapy for Gaucher disease: On-going phase III clinical trial with recombinant human glucocerebrosidase expressed in plant cells” Barnes, L M., C M Bentley, and A J Dickson (2000), “Advances in animal cell recombinant protein production: GS-NSO expression system”, Cytotechnology 32: 109-123 Barta, A et al (1986), “The expression of a nopaline synthase human growth hormone chimaeric gene in transformed tobacco and sunflower callus tissue”, Plant Mol Biol 6, 347–357 Borisjuk, N V et al (1999), “Production of recombinant proteins in plant root exudates”, Nature Biotechnol 17, 466–469 40 10 Bowman, K K., J Clark, L Yu, K Mortara, K Radika, J Wang, and H Zhan (2000), “Expression purification and characterization of deglycosylated human pro-prostate-specific antigen”, Protein Expr Purif, 20: 405-413 11 Catalog no, K1710-01 “Manual Pichia Expression Kit” 12 Cereghino, J.L., and Cregg, J.M (2000b), “Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris”, FEMS Microbiol Rev, 24, pp 45–66 13 Chen X F., Chen C., Wu D H., Huai H., Chi X C (1997), “A new baculovirus of cultured shrimp”, Sei China Ser C40, pp 630-635 14 Chilton M, Tepfer D, Petit A, David C, Casse-Delbart F, Tempe J (1982), “Agrobacterium rhizogenes inserts T-DNA into the genomes of the host plant root cells”, Nature 295:432-434 15 Choi, J.H., and Lee, S.Y (2004), “Secretory and extracellular production of recombinant proteins using Escherichia coli, Appl Microbiol”, Biotechnol, 64, pp 625–635 16 Chong, D K X et al (1997), “Expression of the human milk protein βcasein in transgenic potato plants”, Transgenic Res 6, pp.289–296 17 Chong, D K X & Langridge, W H R (2000), “Expression of fulllength bioactive antimicrobial human lactoferrin in potato plants”, Transgenic Res 9, pp 71–78 18 Christey M, Sinclair B (1992), “Regeneration of transgenic kale (Brassica oleracea var acephala), rape (B napus) and turnip (B campestris var.rapifera) plants via Agrobacterium rhizogenes mediated transformation”, Plant Sci 87:161-169 19 Chung H, Park J-H, Lee H, Kim K, Sunter G, Kim J, Kim W, Chung I (2014), “Expression of a functional recombinant chimeric protein of human hepatis A virus VP1 and an Fc antibody fagment in transgenic tomato plants”, Plant Biotechnol Rep 8:243-249 41 20 Clare, J.J., Romanes, M.A., Rayment, F.B., Rowedder, J.E., Smith, M.A., Payne, M.M., Sreekrishna, K., and Henwood, C.A (1991), “Production of mouse epidermal growth factor in yeast: high-level secretion using Pichia pastoris strains containing multiple gene copies”, Gene, 105, pp 205–212 21 Cregg, J.M., Madden, K.R., Barringer, K.J., Thill, G.P., and Stillman, C.A (1989), “Functional characterization of the two alcohol oxidase genes from the yeast Pichia pastoris”, Mol Cell Biol, 9, pp 1316–1323 22 Daniell, H., Lee, S B., Panchal, T & Wiebe, P O (2001), “Expression of the native cholera B toxin subunit gene and assembly as functional oligomers in transgenic tobacco chloroplasts” J Mol Biol 311, 1001– 1009 23 Delaney, D et al in Plant Biotechnology: and Beyond (2002), “Proceedings of the 10th IAPTC&B Congress”, Orlando, Florida (ed Vasil, I.), pp 393–394 (Kluwer Academic, Dordrecht, The Netherlands, 2002) 24 Drake P, Chargelegue D, Vine N, van Dolleweerd C, Obregon P, Ma J (2003), “Rhizosecretion of a monoclonal antibody protein complex from transgenic tobacco roots”, Plant Molecular Biology 52(1):233-241 25 Fernandez J.M., Hoeffler J.P (1999), “Gene expression systems Using nature for the art of expression”, Academic Press, San Diego 26 Fernandez-San Millan, A., Mingo-Castel, A., Miller, M & Daniell, H (2003), “A chloroplast transgenic approach to hyperexpress and purify human serum albumin, a protein highly susceptible to proteolytic degradation”, Plant Biotechnol 1, 77–79 27 Fikrig E., Barthold S.W., Kantor F.S., et al (1990), “Protection of mice against the Lyme Disease agent by immunizing with recombinant OspA”, Science, 250, pp 553-556 28 Fischer, R & Emans, N (2000), “Molecular farming of pharmaceutical proteins”, Transgenic Res 9, 279–299 42 29 Fischer R, Schumann D, Zimmermann S, Drossard J, Sack M, Schillberg S (1999), “Expression and characterization of bispecific single-chain Fv fragments produced in transgenic plants”, Eur J Biochem 262:810-816 30 Francisco, J A et al (1997), Expression and characterization of bryodin and a bryodin 1-based single-chain immunotoxin from tobacco cell culture, Bioconjug Chem 8, 708–713 31 Geisse, S., and H P Kocker (2000), Protein expression in mammalian and insect cells, Methods Enzymol, 306: 19-42 32 Gellissen, G (2000), Heterologous protein production in methylotrophic yeasts, Appl Microbiol Biotechnol, 54, pp 741–750 33 Giddings G, Allison G, Brooks D, Carter A (2000), Transgenic plants as factories for biopharmaceuticals, Nat Biotechnol 18(11):1151-1155 34 Guda, C., Lee, S B & Daniell, H (2000), Stable expression of a biodegradable protein-based polymer in stable tobacco chloroplasts, Plant Cell Reps 19, 257–262 35 Gurtu, V., G Yan, and G Zhang (1996), IRES bicistronic expression vectors for efficient creation of stable mammalian cell lines, Biochem Biophys Res Commun, 229: 295-298 36 Harms, E., Wehner, A., Jennings, M.P., Pugh, K.J., Beacham, I.R., and Rohm, K.H (1991), Construction of expression systems for Escherichia coli asparaginase II and two-step purification of the recombinant enzyme from periplasmic extracts, Protein Expr Purif, 2, pp 144–150 37 Hiatt, A., Cafferkey, R & Bowdish, K (1989), Production of antibodies in transgenic plants Nature 342, 76–78 38 Hood, E E et al (1997), Commercial production of avidin from transgenic maize: characterization of transformant, production, processing, extraction and purification, Mol Breeding 3, 291–306 39 Hou, J., Tyo, K., Liu, Z., Petranovic, D., and Nielsen, J (2012), Engineering of vesicle trafficking improves heterologous protein secretion in Saccharomyces cerevisiae, Metab Eng, 14, pp 120–127 43 40 Invitrogen, Pichia expression kit, A manual of methods for expression of recombinant proteins in Pichia pastoris, Version M: 011102: 25-0043, Catolog no K1710-01 41 Jahic, M., Veide, A., Charoenrat, T., Teeri, T., and Enfors, S.-O (2006), Process technology for production and recovery of heterologous proteins with Pichia pastoris, Biotechnol Prog, 22, pp 1465–1473 42 Jarvis, D L., Z S Kawar, and J R Hollister (2008), Engineering Nglycosylation pathways in the baculovirus-insect cell system, Curr Opin Biotechnol, 9: 528-533 43 Jha S, Sanyal I, Amla D (2015), High-level expression and purification of a therapeutic recombinant serine protease inhibitor from transgenic tomato plants, International Journal of Advance Research In Science And Engineering 4(4):1158-1176 44 Kaelin W.G.Jr., Krek W., Sellers W.R., DeCaprio J.A., Ajchenbaum F., Fuchs C.S., Chittenden T., Li Y., Farnham P.J., Blanar M.A., et al (1992), Expression cloning of a cDNA encoding a retinoblastomabinding protein with E2F-like properties, Cell., 70(2), pp 351-364 45 Kapusta, J et al (1999), A plant-derived edible vaccine against hepatitis B virus, FASEB J 13, 1796–1799 46 Kitts, P A., and R D Possee (1993), A method for producing recombinant baculovirus expression vectors at hight frequency, Bio Techniques, 14: pp 810-817 47 Komarnytsky, S., Borisjuk, N V., Borisjuk, L G., Alam, M Z.& Raskin I (2000), Production of recombinant proteins in tobacco guttation fluid, Plant Physiol 124, 927–933 48 Kathuria, S et al (2002), Efficacy of plant-produced recombinant antibodies against HCG Human Reproduction 17, 2054–2061 49 Kittipongpatana N, Hock R, Porter J (1998), Production of solasodine by hairy root, callus, and cell suspension cultures of Solanum aviculare Forst, Plant Cell Tiss Org Cult 52:133-143 44 50 Kost, T A., and J P Condreay (1999), Recombinant baculovirus as expression vector for insect and mammalian cells, Curr Opin Biotechnol, 10:428-433 51 Kwon T, Kim Y, Lee J, Yang M (2003), Production and secretion of biologically active human granulocyte-macrophage colony stimulating factor in transgenic tomato suspension cultures Biotechnology Letters 25:1571-1574 52 Lal P, Ramachandran V, Goyal R, Sharma R (2007), Edible vaccines: current status and future, Indian J Med Microbiol 25(2):93-102 53 Lamphear, B J et al (2002), Delivery of subunit vaccines in maize seed, J Control Release 83, 169–180 54 Laprise, M H., F Grondin, and C M Dubois (1998), Enhanced TGF1 maturation in high five cells coinfected with recombinant baculovirus encoding the convertase furin/pace: improved technology for the production of recombinant proproteins in insect cells, Biotechnol Bioeng, 58:85-91 55 Larrick, J W., Yu, L., Naftzger, C., Jaiswal, S & Wycoff, K (2001), Production of secretory IgA antibodies in plants, Biomolecular Eng 18, 87–94 56 Lightner D.V (1996), A handbook of shrimp pathology and diagnostic procedures for for disease of cultured penaeid shrimp, World aquaculture Society, Baton Rouge, Lousiana, USA 57 Lin-Cereghino, G.P., Stark, C.M., Kim, D., Chang, J., Shaheen, N., Poerwanto, H., Agari, K., Moua, P., Low, L.K., Tran, N., et al (2013), The Effect of ?-Mating Factor Secretion Signal Mutations on Recombinant Protein Expression in Pichia pastoris, Gene 519, pp 311– 317 45 58 Ma, J K et al (1998), Characterization of a recombinant plant monoclonal secretory antibody and preventive immunotherapy in humans, Nature Med 4, 601–606 59 Ma, J K et al (1995), Generation and assembly of secretory antibodies in plants, Science 268, 716–719 60 Ma, J K.-C et al (1995), Generation and assembly of secretory antibodies in plants, Science 268, pp 716–719 61 Ma, S W et al (1997), Transgenic plants expressing autoantigens fed to mice to induce oral immune tolerance, Nature Med 3, pp.793–796 62 Mason H, Warzecha H, Mor T, Arntzen C (2002), Edible plant vaccines pplication for prophylactic and molecular medicine, Trends Mol Med 8(7):324-329 63 Mason, H S., Lam, D M K & Arntzen, C J (1992), Expression of hepatitis B surface antigen in transgenic plants Proc, Natl Acad Sci USA 89, 11745–11749 64 Mayfield, S P et al (2003), Expression and assembly of a fully active antibody in algae, Proc Natl Acad Sci USA 100, pp 438–442 65 McGarvey, P B et al (1995), Expression of the rabies virus glycoprotein in transgenic tomatoes, Biotechnology 13, pp 1484–1487 66 McCormick, A A et al (1999), Rapid production of specific vaccines for lymphoma by expression of the tumor-derived single-chain Fv epitopes in tobacco plants, Proc Natl Acad Sci USA 96, 703–708 67 Merle, C et al (2002), Hydroxylated human homotrimeric collagen I in Agrobacterium tumefaciens-mediated transient expression and in transgenic tobacco plant, FEBS Lett 515, pp.114–118 68 Mierendorf R., Yeager K., Novy R (1994), pET system: Your choice for expression, News letter of Novagen Inc., 69 Mor T, Sternfeld M, Soreq H, Arntzen C (2001), Expression of Recombinant Human Acetylcholinesterase in Transgenic Tomato Plants, Biotechnology and Bioengineering 75(3):259-266 46 70 Muir S, Collins G, Robinson S, Hughes S, Bovy A, De Vos C, Van Tunen A, Verhoeyen M (2001), Overexpression of petunia chalcone isomerase in tomato results in fruit containing dramatically increased levels of flavonoids, Nat Biotechnol 19(5):470-474 71 Nagata T, Nemoto Y, Seiichiro H (1992), Tobacco BY-2 cell line as the "HeLa" cell in the cell biology of higher plants, Int Rev Cytol 13:21-30 72 New England Biolabs (2005), Tools for Protein Research, New England Biolabs Inc., Ipswich, USA 73 New England Biolabs, IMPACTTM I: One-step protein purification system, Purification of recombinant by a self- cleavable affinity tag, version 1.8, New England Biolabs Inc., Ipswich, USA 74 Nilsson J., Stahl S., Lundeberg J., Uhlen M., Nygren P.A (1997), Affinity Fusion Strategies for Detection, Purification, and Immobilization of Recombinant Proteins, Protein Expression And Purification, 11, pp 1–16, Article No PT970767 75 Novagen (2006), pET System Manual, TB055 11th Edition, Rev.B 0403, USA 800-207-0144 76 Perrin, Y et al (2000), Transgenic pea seeds as bioreactors for the production of a single-chain Fv fragment (scFV) antibody used in cancer diagnosis and therapy Mol Breeding 6, 345–352 77 PharMingen (1999), Baculovirus Expression vector system manual, 6thed, PharMingen, San Diego, Calif 78 Plasson C, Michel R, Lienard D, Saint-Jore-Dupas C, Sourrouille C, de March G, Gomord V (2009), Production of recombinant proteins in suspensioncultured plant cells, Methods Mol Biol 483:145-161 79 Pogrebnyak N, Golovkin M, Andrianov V, Spitsin S, Smirnov Y, Egolf R KH (2005), Severe acute respiratory syndrome (SARS) S protein production in plants: development of recombinant vaccine Proc Natl Acad Scie USA 102(25):9062-9067 47 80 Rachel Daly and Milton T W Hearn (2004), Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and production 81 Reuter L, Bailey M, Joensuu J, Ritala A (2014), Scale-up of hydrophobinassisted recombinant protein production in tobacco BY-2 suspension cells, Plant Biotechnology Journal 12(4):402-410 82 Richter, L J., Thanavala, Y., Arntzen, C J & Mason, H S (2000), Production of hepatitis B surface antigen in transgenic plants for oral immunization, Nature Biotechnol 18, 1167–1171 83 Romanos, M.A., Scorer, C.A., and Clare, J.J (1992), Foreign gene expression in yeast: a review, Yeast Chichester Engl, 8, pp 423–488 84 Ruggiero, F et al (2000), Triple helix assembly and processing of human collagen produced in transgenic tobacco plants, FEBS Lett 469, 132– 136 85 Sarquis, M.I de M., Oliveira, E.M.M., Santos, A.S., and Costa, G.L da (2004), Production of L-asparaginase by filamentous fungi, Mem Inst Oswaldo Cruz, 99, pp 489–492 86 Seo, N S., J R Hollister, and D L Jarvis (2001), Mammallian glycosyltransferase expression allows sialogly-coprotein production by baculovirus-insect cells, Protein Expr Purif, 22: 234-241 87 Sijmons, P C et al (1990), Production of correctly processed human serum albumin in transgenic plants, Biotechnology 8, 217–221 88 Smith M, Mason H, Shuler M (2002), Hepatitis Bsurface antigen (HBsAg) expression in plant cell culture: Kinetics of antigen accumulation in batch culture and its intracellular form, Biotechnology and Bioengineering 80:812-822 89 Stoger, E et al (2000), Cereal crops as viable production and storage systems for pharmaceutical scFv antibodies, Plant Mol Biol 42, 583– 590 48 90 Stoger, E et al (2002), Practical considerations for pharmaceutical antibody production in different crop systems Mol Breeding 9, 149–158 91 Streatfield, S J et al (2001), Plant-based vaccines: unique advantages, Vaccine 19, 2742–2748 92 Staub, J M et al (2000), High-yield production of a human therapeutic protein in tobacco chloroplasts, Nature Biotechnol 18, 333–338 93 Sun Q, Ding L, Lomonossoff G, Sun Y, Luo M, Li C, Jiang L, Xu Z (2011), Improved expression and purification of recombinant human serum albumin from transgenic tobacco suspension culture, J Biotechnol 155(2):164-172 94 Tacket, C O et al (1998), Immunogenicity in humans of a recombinant bacterial-antigen delivered in a transgenic potato, Nature Med 4, 607– 609 95 Tacket, C O et al (2000), Human immune responses to a novel Norwalk virus vaccine delivered in transgenic potatoes, J Infect Dis 182, 302– 305 96 Terashima, M et al (1999), Production of functional human α1– antitrypsin by plant cell culture, Appl Microbiol Biotechnol 52, 516– 523 97 The QIAexpressionistTM (2003), A handbook for high-level expression and purification of 6xHis-tagged proteins, Fifth edition, QIAGEN, Germany 98 Tokmakov, A.A., Kurotani, A., Takagi, T., Toyama, M., Shirouzu, M., Fukami, Y., and Yokoyama, S (2012), Multiple post-translational modifications bear upon heterologous protein synthesis, J Biol Chem, jbc.M112.366351 99 Vaquero, C et al (2002), A carcinoembryonic antigen-specific diabody produced in tobacco, FASEB J 16, 408–410 49 100 Wongsamuth R, Doran P (1997a), Hairy roots as an expression system for production of antibodies In: In: Hairy Roots, Culture and Applications, 89-97, Harwood, Australia 101 Yano A, Maeda F, Takekoshi M (2004), Transgenic tobacco cells producing the human monoclonal antibody to hepatitis B virus surface antigen, J Med Virol 73:208-215 102 Yu, J & Langridge, W H (2001), A plant-based multicomponent vaccine protects mice from enteric diseases, Nature Biotechnol 19, 548– 552 103 Zeitlin, L et al (1998), A humanized monoclonal antibody produced in transgenic plants for immunoprotection of the vagina against genital herpes, Nature Biotechnol 16, 1361–1364 104 Zhang, W., Inan, M., and Meagher, M.M (2000), Fermentation strategies for recombinant protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris, Biotechnol Bioprocess Eng, 5, pp 275–287 105 Zhang, X., Urry, D W & Daniell, H (1996), Expression of an environmentally friendly synthetic protein-based polymer in transgenic tobacco plants, Plant Cell Reps 16, 174–179 106 Zhu, Z et al (1994), Expression of human α-interferon in plants, Virology 172, 213–222 50 [...]... tái tổ hợp bằng tế bào động vật có vú ít được sử dụng [86] 26 CHƯƠNG 2 HỆ THỐNG BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP Ở THỰC VẬT 2.1 Biểu hiện protein tái tổ hợp ở thực vật Nuôi cấy tế bào thực vật đã được sử dụng để sản xuất các sản phẩm tự nhiên cách đây hơn 20 năm và hiện nay chúng được sử dụng để sản xuất các protein tái tổ hợp Các tế bào thực vật rất thích hợp cho... phù hợp và các loại protein tái tổ hợp mới cho con người, được ứng dụng trong y tế và công nghiệp [38, 84] Ví dụ về các protein dược phẩm đã được sản xuất bằng hệ thống nuôi cấy thực vật được liệt kê trong bảng 2.1 Bảng 2.1 Một số protein tái tổ hợp sản xuất qua hệ thống thực vật Loại protein Hệ thống biểu hiện Mô tả Tài liệu Dược phẩm sinh học người Protein tái tổ hợp. .. circulan Khi được nạp vào cột chitin, protein dung hợp với CBP se được giữ lại Sau khi thực hiện phản ứng cắt của intein ở 4 oC bởi DTT hoặc β-Mercaptoethanol, protein mục tiêu được ly giải khỏi cột Hình 1.7 Sơ đồ biểu hiện và tinh chế sử dụng hệ thống gắn thẻ Chitin 2 Sản xuất protein tái tổ hợp trong tế bào nấm men 2.1 Những đặc điểm chung của hệ biểu hiện trong nấm men Nấm men là một... các chủng khuyết proteinase có thể được sử dụng để biểu hiện một số loại protein tiết nhất định [15] * Một số chủng P pastoris được sử dụng để biểu hiện protein tái tổ hợp Chủng Y-11430 GS115 GS190 GS200 SMD1168 SMD1165 SMD1163 Kiểu gen Dại His4 Arg4 His4 arg4 ∆pep4::URA his4 ura3 His4 prb1 Pep4 his4 prb1 Chú thích: Gene pep mã hóa proteinase A trong không bào Protein này cần thiết... tận cùng vào các glycoprotein liên kết N Vì vậy, hệ thống baculovirus không thể sử dụng để sản xuất một số glycoprotein động vật có vú quan trọng Ngoài ra, trong nhiều trường hợp, một protein tái tổ hợp không được xử lý chính xác từ tiền chất có kích thước lớn và bất hoạt thành dạng hoạt động trong tế bào côn trùng 4 Sản xuất protein tái tổ hợp trong tế bào động... thành Thuốc lá phần riêng lẻ Protein đầu tiên được sản Thuốc lá xuất trong hệ thống nuôi cấy huyền phù Protein tái tổ hợp dược Đậu tương phẩm đầu tiên được sản xuất nhờ đậu tương Protein tái tổ hợp đầu tiên Tảo biểu hiện trong tảo Vaccine tiểu đơn vị tái tổ hợp Thuốc lá Cà chua E.coli heatlabile enterotoxin Thuốc lá, khoai tây Protein vỏ virus Norwalk Khoai tây... xuất protein tối ưu 25 Hình 1.12 Hệ thống vector biểu hiện hai gen Nhìn chung, các vector biểu hiện trong động vật có vú linh hoạt và hiệu quả như các vector biểu hiện ở các hệ thống biểu hiện khác Tuy nhiên, sản xuất công nghiệp một protein tái tổ hợp với các tế bào động vật có vú chuyển gene có chi phí rất cao Chính vì điều này mà hệ thống biểu hiện protein. .. proteinase không bào khác như carboxypeptidase Y và proteinase B Đột biến gene pep4 se làm giảm hoạt tính của proteinase A và carboxypeptidase Y và giảm mạnh hoạt tính của proteinase B Gen prb1 mã 16 hóa proteinase B Đột biến gene prb1 thì chỉ hoạt tính proteinase B bị giảm Ngược lại, nếu đột biến 2 gene pep4 prb1 thì cả 3 protease se giảm hoạt tính [41] 2.3.3 Vector biểu hiện. .. tử cung ở chuột [48] Các kháng thể có thể được sử dụng để chẩn đoán hoặc điều trị các khối u sản sinh hCG, phát hiện mang thai và ngừa thai (khẩn cấp) 33 2.3 Các hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp ở thực vật chuyển gen 2.3.1 Dòng tế bào thuốc lá BY2 (Nicotiana tabacum Bright Yellow 2) Hệ thống dòng tế bào huyền phù bắt nguồn từ thực vật mang nhiều ưu điểm hơn... sang giai đoạn sản xuất protein tái tổ hợp ở quy mô công nghiệp bằng hệ thống BY2 như sản xuất protein tái tổ hợp hydrophobin [81] 34 Với ưu điểm của BY2 thì việc sản xuất protein tái tổ hợp trong các dòng tế bào thuốc lá BY2 se là một trong những hướng nghiên cứu có triển vọng và dễ dàng kiểm tra mức độ biểu hiện của protein tái tổ hợp trong tế bào thực