Nghiên cứu đặc tính của Chitinase tự nhiên và biểu hiện Chitinase tái tổ hợp từ chủng nấm Lecanicillium Lecanii (Luận văn thạc sĩ)

Nghiên cứu đặc tính của Chitinase tự nhiên và biểu hiện Chitinase tái tổ hợp từ chủng nấm Lecanicillium Lecanii (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu đặc tính của Chitinase tự nhiên và biểu hiện Chitinase tái tổ hợp từ chủng nấm Lecanicillium Lecanii (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu đặc tính của Chitinase tự nhiên và biểu hiện Chitinase tái tổ hợp từ chủng nấm Lecanicillium Lecanii (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu đặc tính của Chitinase tự nhiên và biểu hiện Chitinase tái tổ hợp từ chủng nấm Lecanicillium Lecanii (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu đặc tính của Chitinase tự nhiên và biểu hiện Chitinase tái tổ hợp từ chủng nấm Lecanicillium Lecanii (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu đặc tính của Chitinase tự nhiên và biểu hiện Chitinase tái tổ hợp từ chủng nấm Lecanicillium Lecanii (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu đặc tính của Chitinase tự nhiên và biểu hiện Chitinase tái tổ hợp từ chủng nấm Lecanicillium Lecanii (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu đặc tính của Chitinase tự nhiên và biểu hiện Chitinase tái tổ hợp từ chủng nấm Lecanicillium Lecanii (Luận văn thạc sĩ)

VÀ

LECANICILLIUM LECANII

,

.TS Ng.Tôi xin chân thành

i

ii

iii

vii

HÌNH ix

xii 1

1

2

2

3

3

5

Lecanicillium lecanii 5

1.2 Chitinase 5

6 1 7 9 12

14 16

L lecanii và chitinase 19

1.3 19

1.3.2 Trong 23

1.3 công 24

1.4 óa chitinase 25

1.4.1 25

1.4.2 29

33

33

33

2.1.2 33

33

2.1.4 Du 34

34

33 33

33

35 2.2.3 42

2.2.4 Các p 47

2.2.7 lý 49

50

L lecanii 50

3.1.1 L lecanii 50

3.1.2 L lecanii 50

53

L Lecanii 43H 61

61

3.2.2 L lecanii 43H 64

3.3 Nhân dòng gen mã hóa chitina L lecanii 43H 67

P pastoris X33 71

n gen Chit 71

P pastoris 72

77

tính P pastoris X33 79

L lecanii 85

85

87

3 88

89 L lecanii 43H 90

93

93 93

94

95

114

Ti ng Anh Ti ng Vi t

BLAST Basic local alignment search tool Ph n m m so sánh trình t

CMC Cacboxyl methyl cellulose Cacboxyl methyl cellulose

RNase Ribonuclease Enzyme th y phân RNA

RT-PCR Reverse transcription polymerase

-Tetramethylethylenediamine

N,N,N ,N Tetramethylethylenediamine

Trang Hình 1.1. C immitis 10

Hình 3.6.

56

Hình 3.7 Hình n di SDS-PAGE c a chitinase tinh s ch t ch ng n m L lecanii 43H và ho t tính chitinase c n qua c t DEAE-Sephadex A- ch có b t chitin huy n phù 0,5% 59

Hình 3.8 N và pH 61

Hình 3.9. b n nhi t b n pH c a chitinase 62

Hình 3.10. ng c a dung môi h và ch t t y r a lên ho t tính chitinase 65

Hình 3.11 Phân tích TLC các s n ph m th y phân chitin b i chitinase 67

Hình 3.12. dòng gen Chit 67

Hình 3.13 Trình gen Chit L lecanii 43H 68

Hình 3.14. Chit L Lecanii 43H và khác trong GenBank 69

Hình 3.15. Chit 70 Hình 3.16. o sánh trình L Lecanii 43H và khác trong GenBank 71

Hình 3.17. 72

Hình 3.18. P pastoris X33 71

Hình 3.19. 74

Hình 3.20. nhau 75

Hình 3.21. i n di SDS-PAGE c a rChit tinh s ch t P pastoris X33 78

32

L lecanii 34

39

a 1/[S] và 1/V 40

44

6. 45

B ng 3.1 K t qu tinh s ch chitinase t ch ng n m L lecanii 43H 59

63

P pastoris X33/pPChi 73

74

P pastoris X33 77

82

1

tâm ngh

Cùng -

hòa tan là do các enzyme (chitinase, protease

-acetyl

-trong chitin

uá trình

L lecanii.

1.1 Lecanicillium lecanii

Lecanicillium

L longisporum, L muscarium L nodulosum L lecanii

Verticillium lecanii Ngày nay, L lecanii

acid [43] Chitinase L psalliotae

nhau v

Bacillus circulans

3 vùng: vùng

N-p [140]

(Phe-Asp-Gly-Ile-Asp-Trp-L lecanii -Met-Leu-Ser-Ile-Gly-Gly) và vùng liên

Hình 1.3. S mecescens [99]

-acetyl -142

N

acetyl glucosamine (Hình 1.4) [106]

Hình 1.4. - B circulans [106]

1.2.5

1.2.5.1.

-S macescens B4A [147], Enterobacter sp G-1 [103], B subtilis và

[86], M anisopliae [61], Aspergillus fumigates [145]

-60°C

1.2.5.2.

Penicillium ochrochloron MTCC 517

[105], L psaliotae [42] và v S marcescens MO-1 [99]

L chlamydosporium và L suchlasporium [136], M anisopliae [61], vi

A niger LOCK 62 [25] Zang và

B bassiana Bb174 trong môi

quá trình

Neurospora crassa và Aspergillus nidulans [119]

1.3.1.2

Lecanicillium

trùng

1.3.2 Trong

chitin Chitinase bi

và làm suy [38], [104]

, khi b

chitinase này bao

nh Các

-chitin trên vi [94]

[130] Chitinase 1

[59]

oligosaccharide

1.4.1.2 chitinase trong Bacillus

tính enzyme; trong khi các ion Ba2+, Fe2+và Sn2+

enzyme [11]

Penicillium sp M4

A tumefaciens

pBI333-EN4-RCC2

[3]

P pastoris

YP

nase

acetyl glucosamine (µg/ml)

2.2.2.4 chitinase

500 vòng/phút trong 10 phút 50 mlr

-Sephadex -

Hình 2.3.

chitin

Menten, Km

-+, Al3+, Ba2+, Ca2+, Cu2+, Fe2+, Hg2+, K+, Mg2+, Mn2+, Ni2+

114 và Triton 0,5-

X-stadt, -butanol/acetic

2-phút Hút 500 l

-20khi ly t

l -20 C [121]

l TE và 0,25 l C.

72°C/10 phút.

6 Thành

l vector pJET1.2/blunt và 0,5 l T4-

22 C trong

2-2.2.3.10

50

-

loài Lecanicillium

Lecanicillium sp VL7 (DQ849287.1), Lecanicillium sp Vl-19 (AY312606.1) (Hình 3.3B)

A

B

L lecanii

JX665044: L lecanii 43H, DQ849287.1: Lecanicillium sp VL7, AY312603.1:

Lecanicillium sp Vl-5, AY312606.1: Lecanicillium sp Vl-19, AB360355.1:

L saksenae, AB378510.1: L attenuatum, AB378519.1: L psalliotae,

EF026003.1: L lecanii ARSEF 4075, EF026005.1: L lecanii ARSEF 6543

L lecanii

và chúng tôi là

gian sinh chitinase

L lecanii

-37°C (Hình 3.4B)

-chitin

L lecanii

(Hình 3.5A)

Paenibacillus sp D1

Paenibacillus sp CHE-N1 [62] Streptomyces sp ANU

6277 [74] là 1,0%; Stenotrophomonas maltophilia sinh chitinase cao

[64]

(urê, NaNO3, KNO3, (NH4)2SO4, NH4NO3)

30,408 U/ml

T harziaum [122] khi nuôi trên môi

Sau khi kh o sát quá trình t a chitinase t ch ng n m L lecanii 43H v i

mu i ammonium sulphate các n t 45-95% (cách nhau 5%), chúng tôi

a ch c n mu i ammonium sulphate thích h p cho quá trình t a chitinase tinh s ch là 65% n mu i ammonium sulphate 65%, h

Ho t tính

t ng s(U)

Ho t tính riêng (U/mg) s ch

(l n)

Hi u

su t (%)

Hình 3.7. i n di SDS-PAGE c a chitinase tinh s ch (A) và ho t tính chitinase

ch t chitin huy n phù 0,5% (B)

Gi ng 1: enzyme thô, gi ng 2: enzyme t a mu i (NH4)2SO4 65%, gi ng 3-8

3.2.2 tính L lecanii 43H 3.2.2.1

[81], M anisopliae [61], A fumigate [145], Verticillium sp [142] và

G catenulatum [86] ho Trong khi, pH và nhi t

A B Hình 3.9. b n nhi b n pH (B) c a chitinase

(Tween 20, Tween 80, Triton 100 và Triton

X-sung Tween 80 0,5%; Tween 20 1,0-2,0% và Triton X114 1,0%

-A B Hình 3.10. ng c a dung môi h ) và ch t t y r a (B)

L lecanii 43H là 0,82 mg chitin huy4,51 U/mg protein

m và Vmaxm

(74,07 mol/h/ g protein) T harziunum CECT 2413 (3,6 và 5,2

-acetyl glucosamine Trong khi

Aeromonas

L lecanii

EcoRI và XbaI.

Hình 3.13 Trình gen Chit L lecanii 43H

AY705927: L lecanii DAOM 175104, DQ412944: L.lecanii 432, GU361767:

Trichothecium roseum, KC904797: L attenuatum CGMCC5328, KF041477: Cordyceps confragosa

E coli DH5

69- L lecanii DAOM 175104 (AY705927) và

T roseum (GU361767) (Hình 3.16).

AY705927: L lecanii DAOM 175104, DQ412944: L.lecanii 432, GU361767:

Trichothecium roseum, KC904797: L attenuatum CGMCC5328, KF041477: Cordyceps confragosa

Plasmid pPIChit (1), plasmid pPICZ

vector pPICZ A (~3,6 kb) và cDNA gen Chit (1269 bp) (Hình 3.17 B)

, khác nhau (BMM, BMMY, YB+YNB, YP, MM và MMY) HrChit

-5 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 và 2,5

[133]

L psalliotae hay L lecanii

Protein

riêng (U/mg)

III (có -50 kDa)

Hình 3.21. i n di SDS-PAGE c a rChit tinh s ch t P pastoris X33

-là 11-14, 16-18

3.4.4.2

(Hình

-n 80, Trito-n

Tween 80; Tween 20

0,5-riton X100 0,5-2,0% và T0,5-riton X114

1,0-

-Triton X-100 và -Triton X-114

-100 Bhushan và Hoondal (1998)

tính rChit

i ch ng; TW80: Tween 80, TW20: Tween 20, TX100: Triton X100, TX114: Triton X114; MeOH: methanol, IsOH: isopropanol, EtOH: ethanol, Acet: acetone, BtOH: n-butanol

80, Tween 20, Triton X100 và Triton X114

P pastoris

ton X114

m và Vmaxtrình Lineweaver-Burk [82]

i Trung tâm H - http://www.lrc-tnu.edu.vn/

T harzianum và Alternaria citri

2013 [99]

-5: chitinase

Hình 3.26 S R solani (A, B) và F oxysporum

sau khi phun 83%) (Hình 3.29).

nucleotide và

1 Huu Quan Nguyen, Dinh Thi Quyen, Sy Le Thanh Nguyen, Van Hanh Vu

chitinase from Lecanicillium lecanii:

purification, properties and application in biocontrol against plant pathogenic

Turkish Journal of Biology, 39, tr 6-14.

2 Nguyen Huu Quan, Vu Van Hanh, Quyen Dinh Thi

expression of a gene encoding chitinase from Lecanicillium lecanii 43H in

Pichia pastoris In: the 3 rd Academic conference on natural science for master and PhD students from Asean countries, tr 438-445.

6 Nguyen Huu Quan, Vu Van Hanh, Quyen Dinh Thi (2012), « Biological

characteristics and virulence of Lecanicillium lecanii strains against Chinese

In: The 2 nd Academic conference on Natural Science for Master and PhD Students from Cambodia-Laos-Malaysia, tr 423-427.

1 Nguyen HQ, Vu VH and Quyen DT (2012) Lecanicillium lecanii strain 43H

28S ribosomal RNA gene, partial sequence GenBank: JX665044

2 Nguyen HQ, Vu VH and Quyen DT (2012) Lecanicillium lecanii strain 43H

chitinase gene, partial cds GenBank: JX665045

-, tr 321-324.3.

, tr 48-51.

7

mã hóa chitinase và th

, tr 82-86

- VAST, 50, tr 625-632.

12

46, tr 79-85

Penicillium

mía",

, 1, tr 484-488

14 Abbott W S (1925), "A method of computing the effectiveness of an

insecticide", J Econ Entomol., 18, pp 265-267.

15 Abd Elhamid M I., Makboul H E., Sedik M Z., Ismail I M., Ibrahim M

A (2010), "Cloning, expression and antifungal activity of an endochitinase

gene derived from Barley (Hordeum Vulgare)", Res J Agric Biol Sci., 6,

17 Altre J A., Vandenberg J D (2001), "Factors influencing the infectivity of

isolates of Paecilomyces fumosoreus against diamondback moth, Plutella xylostella", J Invertebr Pathol., 78, pp 31-36.

18 Altre J A., Vandenberg J D., Cantone F A (1999), "Pathogenicity of

Paecilomyces fumosoreus isolates to diamondback moth, Plutella xylostella: correlation with spore size, germintation speed, and attachment

to cuticle", J Invertebr Pathol., 73, pp 332-338.

19 Annamalai N., Giji S., Arumugam M., Balasubramanian T (2010),

"Purification and characterization of chitinase from Micrococcus sp AG84 isolated from marine environment", Afr J Microbiol Res., 4, pp 2822-2827.

20 Anuradha V., Revathi K (2013), "Purification and characterization of

chitinase fromtwo Bacillus sp isolated from crustacean shells", J

Microbiol Biotech Res., 3, pp 160-167.

21 Balasubramanian N., Juliet A A., Srikalavani P., Lalithakumari D (2003),

"Release and regeneration of protoplasts from Trichothecium roseum",

Can J Microbiol., 49, pp 263-268.

22 Barboza-Corona J E., Nieto-Mazzocco E., Velázquez-Robledo R., Salcedo-Hernandez R., Bautista M., Jiménez B., Ibarra J E (2003),

"Cloning, sequencing, and expression of the chitinase gene chiA74 from

Bacillus thuringiensis", Appl Environ Microbiol., 69, pp 1023-1029.

23 Barghini P., Moscatelli D., Garzillo A M V., Crognale S., Fenice M (2013), "High production of cold-tolerant chitinases on shrimp wastes in

bench-top bioreactor by the Antarctic fungus Lecanicillium muscarium

CCFEE 5003: Bioprocess optimization and characterization of two main

enzymes", Enzyme Microb Technol., 53, pp 331-338.

24

a thermostable chitinase from an alkalophilic Bacillus sp BG-11",

Biotechnol Lett, 20, pp 157 159.

25 Brzezinska M S., Jankiewicz U (2012), "Production of antifungal

chitinase by Aspergillus niger LOCK 62 and its potential role in the biological control", Curr Microbiol., 65, pp 666-72.

26 Caihong H., Qian Y., Jinzhu S., Yingqi S (2007), "Expression of a novel

chitinase gene from Trichoderma harzianum in Saccharomyces cerevisiae",

Proceedings of the 1 st International Conference on Bioinformatics and Biomedical Engineering held at Wuhan, China 1, pp 283-285.

27 Campbell N A (1996), "Biology (4th edition) Benjamin Cummings", New

Work ISBN 0-8053-1957-3, 69, pp

28 Chen C C., Kumar H G A., Kumar S., Tzean S S., Yeh K W (2007),

"Molecular cloning, characterization, and expression of a chitinase from the

Entomopathogenic fungus Paecilomyces javanicus", Current Microbiology,

55, pp 8-13

29 Choi J H., Lee S Y (2004), "Secretory and extracellular production of

recombinant proteins using E coli", Appl Microbiol Biotechnol., 64, pp

625-635

30 Dahiya N., Tewari R., Tiwari R P., Hoondal G S (2005), "Chitinase from

Enterobacter sp NRG4: Its purification, characterization and reaction

pattern", Electron J Biotechnol., 8, pp 1-6.

31 Daniel M B., Michael D R., Stuart J E (1996), "Protein methods", New

York: Wiley-Liss, pp 91-95.

32 de la Cruz J., Hidalgo-Gallego A., Lora J M., Benitez T., Pintor-Toro J A., Llobell A (1992), "Isolation and characterization of three chitinases from

Trichoderma harzianum", Eur J Biochem., 206, pp 859-867.

33 di Pietro A., Lorito M., Hayes C K., Broadway R M., Harma G E., Harma

G E (1993), "Endochitinase from Gliocladium virens: Isolation,

characterization, and synergistic antifungal activity in combination with

gliotoxin", Phytopathology, 83, pp 303-313.

34 Diaz B M., Oggerin M., Lopez Lastra C C., Rubio V., Fereres A (2009),

"Characterization and virulence of Lecanicillium lecanii against different aphid species", BioControl, 54, pp 825-835.

35 Ding X., Gopalakrishnan B., Johnson L B., White F F., Wang X., Morgan

T D., Kramer K J., Muthukrishnan S (1998), "Insect resistance of

transgenic tobacco expressing an insect chitinase gene", Transgenic Res.,

7, pp 77-84

36 Duo C L., Shu C., Jing L U (2005), "Purification and partial characterization of two chitinases from the mycoparasitic fungus

Talaromyces flavus", Mycopathologia, 159, pp 223-229.

37 El-Katatny M H., Somitsch W., Robra K H., El-Katatny M S., Gubitz G

M (2005), "Production of chitinase and 1,3- gluanase by Trichoderma

harzianum for control of the phytopathogenic fungus Sclerotium rolfsii", Food Technol Biotechnol., 38, pp 137-180.

38 Elias J A., Homer R J., Hamid Q., Lee C G (2005), "Chitinases and

chitinase-like proteins in TH2 inflammation and asthma", J Allergy Clin

Immunol., 116, pp 497-500.

39 Fan Y., Zhang Y., Yang X., Pei X., Guo S., Pei Y (2007), "Expression of a

Beauveria bassiana chitinase (Bbchit1) in Escherichia coli and Pichia pastoris", Protein Expresson Purif., 56, pp 93-99.

40 Fenice M., Selbmann L., di Giambattista R., Federici F (1998),

"Chitinolytic activity at low temperature of an Antarctic strain (A3) of

Verticillium lecanii", Res Microbiol., 149, pp 289 300.

41 Frankowski J., Lorito M., Scala F., Schmid R., Berg G., Bahl H (2001),

"Purification and properties of two chitinolytic enzymes of Serratia

plymuthica HRO-C48", Arch Microbiol., 176, pp 421-426.

42 Gan Z., Yang J., Tao N., Liang L., Mi Q., Li J., Zhang K Q (2007),

"Cloning of the gene Lecanicillium psalliotae chitinase Lpchi1 and

identification of its potential role in the biocontrol of root-knot nematode

Meloidogyne incognita", Appl Microbiol Biotechnol., 76, pp 1309-17.

43 Gan Z., Yang J., Tao N., Yu Z., Zhang K Q (2007), "Cloning and expression analysis of a chitinase gene Crchi1 from the Mycoparasitic

Fungus Clonostachys rosea (syn Gliocladium roseum)", J Microbiol., 45,

pp 422-430