Nghiên cứu đặc tính của chitinase tự nhiên và biểu hiện chitinase tái tổ hợp từ chủng nấm Le

Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.vn BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN NGUYỄN HỮU QUÂN NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH CỦA CHITINASE TỰ NHIÊN VÀ BIỂU HIỆN CHITINASE TÁI TỔ HỢP TỪ CHỦNG NẤM LECANICILLIUM LECANII LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Thái Nguyên, 2015 Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.bio Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.vn BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN NGUYỄN HỮU QUÂN NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH CỦA CHITINASE TỰ NHIÊN VÀ BIỂU HIỆN CHITINASE TÁI TỔ HỢP TỪ CHỦNG NẤM LECANICILLIUM LECANII Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 62 42 01 16 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Quyền Đình Thi PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh Thái Nguyên, 2015 Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.bio Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phii tai: https://wWw.YSinhHoc.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án cơng trình nghiên cứu tơi hướng dẫn PGS.TS Quyền Đình Thi, PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh, giúp đỡ cán Phòng Cơng nghệ Sinh học Enzyme, Viện Cơng nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần kết cơng bố tạp chí khoa học chuyên ngành cho phép đồng tác giả, phần lại chưa cơng bố cơng trình khác Mọi trích dẫn ghi rõ nguồn gốc Tác giả luận án Nguyễn Hữu Quân Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.bio Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phiii tai: https://wWw.YSinhHoc.vn LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới PGS.TS Quyền Đình Thi định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện hóa chất, thiết bị hỗ trợ kinh phí để tơi hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh bảo, sửa luận án để tơi hồn thành luận án Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô đồng nghiệp Phòng Cơng nghệ sinh học Enzyme, Viện Cơng nghệ sinh học giúp đỡ, hợp tác chia sẻ kinh nghiệm chun mơn cho tơi q trình tiến hành thực nghiệm đề tài Tôi xin cảm ơn hỗ trợ đề tài “Nghiên cứu sản xuất sử dụng chế phẩm từ nấm Lecanicillium spp để diệt rệp muội (Aphididae) gây hại trồng” thuộc chương trình Cơng nghệ sinh học Bộ Nông nghiệp & Phát triển nơng thơn PGS.TS Quyền Đình Thi TS Vũ Văn Hạnh làm chủ nhiệm, 2010-2013 Tôi xin cảm ơn Khoa Khoa học Sự sống, Phòng Đào tạo Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện thuận lợi trình học tập hồn thành luận án Tơi xin cảm ơn Ban chủ nhiệm Khoa Giáo dục Trung học sở, Khoa Sinh - Kỹ thuật nơng nghiệp, Phòng Khoa học Cơng nghệ Hợp tác quốc tế, Ban Giám hiệu Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên bạn đồng nghiệp ủng hộ, tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành luận án Lời cảm ơn sau tơi xin dành cho gia đình người thân, bạn bè động viên giúp đỡ, tạo điều kiện cho suốt trình làm nghiên cứu sinh Tác giả luận án Nguyễn Hữu Quân Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.bio Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phiiiitai: https://wWw.YSinhHoc.vn MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC HÌNH ix DANH MỤC BẢNG xii MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Những đóng góp luận án Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài luận án Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nấm Lecanicillium lecanii 1.2 Chitinase 1.2.1 Nguồn gốc chitinase 1.2.2 Phân loại chitinase 1.2.3 Cấu trúc trung tâm hoạt động chitinase 1.2.4 Cơ chế phản ứng chitinase 12 1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính chitinase 14 1.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng tới trình sinh tổng hợp chitinase 16 Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.bio Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phiiv tai: https://wWw.YSinhHoc.vn 1.3 Ứng dụng nấm L lecanii chitinase 18 1.3.1 Trong lĩnh vực nông nghiệp bảo vệ môi trường 18 1.3.2 Trong lĩnh vực y học 22 1.3.3 Trong lĩnh vực công nghệ sinh học 23 1.4 Một số nghiên cứu gen biểu gen mã hóa chitinase 24 1.4.1 Trên giới 24 1.4.2 Ở Việt Nam 28 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 31 2.1 Vật liệu hóa chất 31 2.1.1 Chủng giống 31 2.1.2 Thiết bị 31 2.1.3 Hóa chất 31 2.1.4 Dung dịch đệm 32 2.1.5 Môi trường nuôi cấy 32 2.2 Phương pháp nghiên cứu 33 2.2.1 Phương pháp nuôi cấy 33 2.2.2 Phương pháp hóa sinh 35 2.2.3 Tinh chitinase 37 2.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố lý hóa lên hoạt tính độ bền chitinase tự nhiên tái tổ hợp 39 2.2.5 Các phương pháp sinh học phân tử 42 2.2.6 Phương pháp thử nghiệm 46 2.2.7 Xử lý số liệu 48 Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.bio Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phiv tai: https://wWw.YSinhHoc.vn Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 49 3.1 Sàng lọc, kiểm tra khảo sát điều kiện sinh tổng hợp chitinase từ nấm L lecanii 49 3.1.1 Sàng lọc chủng nấm L lecanii sinh tổng hợp chitinase cao 49 3.1.2 Kiểm tra chủng nấm L lecanii 43H dựa vào đoạn gen 28S rRNA 49 3.1.3 Khảo sát điều kiện sinh tổng hợp chitinase 52 3.2 Tinh đánh giá tính chất lý hóa chitinase từ chủng nấm L Lecanii 43H 57 3.2.1 Tinh chitinase 57 3.2.2 Đánh giá tính chất lý hóa chitinase từ chủng nấm L lecanii 43H 59 3.3 Nhân dòng gen mã hóa chitinase từ chủng nấm L lecanii 43H 66 3.4 Biểu hiện, tinh đánh giá tính chất lý hóa rChit nấm men P pastoris X33 70 3.4.1 Thiết kế plasmid pPChit biểu gen Chit nấm men 70 3.4.2 Biểu chitinase tái tổ hợp nấm men P pastoris 71 3.4.3 Tinh rChit 76 3.4.4 Đánh giá tính chất lý hóa rChit từ nấm men P pastoris X33 78 3.5 Thử nghiệm khả ức chế rệp nấm bệnh chitinase bào tử từ nấm L lecanii 84 3.5.1 Ảnh hưởng chitinase tới phát triển nấm bệnh hại trồng 84 3.5.2 Ảnh hưởng rChit tới khả phát triển rệp 86 Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.bio Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phivi tai: https://wWw.YSinhHoc.vn 3.5.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả phát triển sợi nấm 87 3.5.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả nẩy mầm bào tử nấm 88 3.5.5 Khả diệt rệp chủng nấm L lecanii 43H 89 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 92 KẾT LUẬN 92 KIẾN NGHỊ 92 CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 93 TÀI LIỆU THAM KHẢO 94 DANH MỤC PHỤ LỤC 113 Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.bio Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phiviitai: https://wWw.YSinhHoc.vn DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tiếng Anh Tiếng Việt BLAST Basic local alignment search tool Phần mềm so sánh trình tự bp Base pair Cặp bazơ cDNA Complement DNA DNA tạo từ mRNA Chit Gene encoding chitinase Gen mã hóa chitinase CMC Cacboxyl methyl cellulose Cacboxyl methyl cellulose DEPC Diethylpyrocarbonate Diethylpyrocarbonate DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic DNase Deoxyribonuclease Enzyme thủy phân DNA dNTPs 2-Deoxynucleoside 5- Các nucleotide triphosphate ĐC Control Đối chứng IPTG Isopropyl-beta-D- Isopropyl-beta-D- thiogalactopyranoside thiogalactopyranoside EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid Axit ethylenediamine tetraacetic EtBr Ethidium bromide Ethidium bromide kb Kilo base Kilo base kDa Kilo Dalton Kilo Dalton M Marker Thang chuẩn OD Optical density Mật độ quang PCR Polymerase chain reaction Phản ứng khuếch đại gen RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.bio Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phiviiitai: https://wWw.YSinhHoc.vn RNase Ribonuclease Enzyme thủy phân RNA RT-PCR Reverse transcription polymerase Phản ứng khuếch đại gen chain reaction rChit Recombinante chitinase Chitinase tái tổ hợp SDS- Sodium dodecyl sulfate Điện di protein PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis Taq Thermus aquaticus Thermus aquaticus TBE Tris boric acid EDTA Tris boric acid EDTA TE Tris EDTA Tris EDTA TEMED N,N,N,N- N,N,N,N- Tetramethylethylenediamine Tetramethylethylenediamine v/v Volume/volume Thể tích/thể tích w/v Weight/volume Khối lượng/thể tích Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.bio Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.vn 100 44 Ghanem K M., Al-Garni S M., Al-Makishah N H (2010), "Statistical optimization of cultural conditions for chitinase production from fish scales waste by Aspergillus terreus", Afr J Biotechnol., 9, pp 5135-5146 45 Gomaa E Z (2012), "Chitinase production by Bacillus thuringiensis and Bacillus licheniformis: their potential in antifungal biocontrol", J Microbiol., 50, pp 103-11 46 Gooday G W., Humphreys A M., McIntosh W H (1986), "Roles of chitinases in fungal growth In: RAA Muzzarelli, C Jeuniaux, GW Gooday (eds): Chitin in nature and technology", Plenum Press, New York, pp 83 -91 47 Gopalakrishnan C (1989), "Susceptibility of cabbage diamondback moth Plutella xylostella L to the entomofungal pathogen Verticillium lecanii (Zimmerman), Viegas", Current Science, 58, pp 1256-1257 48 Hall R A (1981), "The fungus Verticillium lecanii as a microbial insecticide againt aphids and scales In: Microbial control of pests and plant disease 19701980 (H.D Burges, ed)", Academic Press London, pp 483-498 49 Hall R A (1981), "A new insecticide against greenhouse aphids and whitefly: the fungus Verticillium lecanii", Ohio Florists Assoc Bull, 626, pp 3-4 50 Hamsah N B (2009), "Optimization of inducers on expresion of recombinant chitinase in Escherichia coli using response surface methodlogy", Faculty of Chemical & Natural Resources Engineering Universiti Malaysia Pahang, pp 1-24 51 Harma G E., Hayes C K., Lorito M., Broadway R M., Di pietro A., Peterbauer C., Tronsmo A (1993), "Chitinolytic enzymes of Trichoderma harzinum: purification of chitobiosidase and endochitinase", Phytopathology, 83, pp 313-318 Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.bio Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.vn 101 52 Henrissat B., Bairoch A (1993), "New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities", Biochem J., 293, pp 781-788 53 Huang C J., Chen C Y (2004), "Gene cloning and biochemical characterization of chitinase CH from Bacillus cereus 28-9", Ann Microbiol., 54, pp 289-297 54 Huang J H., Chen C J., Su Y C (1996), "Production of chitinolytic enzymes from a novel species of Aeromonas", J Ind Microbiol., 17, pp 89-95 55 Ike M., Nagamatsu K., Shioya A., Nogawa M., Ogasawara W., Okada H., Morikawa Y (2006), "Purification, characterization, and gene cloning of 46 kDa chitinase (Chi46) from Trichoderma reesei PC-3-7 and its expression in Escherichia coli", Appl Microbiol Biotechnol., 71, pp 294-303 56 Iten W., Matile P (1970), "Role of chitinase and other lysosomal enzymes of Coprinus lagopus in the autolysis offruiting bodies", J Gen Microbiol., 61, pp 301-309 57 Jang MK, Kong B G., Jeong Y I., Lee C H., Nah J W (2004), "Physicochemical characterization of α-chitin, β-chitin, and γ-chitin separated from natural resources", J polym sci A polym chem., 42, pp 3423–3432 58 Jang M S., Lee Y M., Cho Y S., Choi Y L., Kim C H., Lee Y C (2005), "Overexpression and characterization of a novel chitinase gene from a marine bacterium Pseudomonas sp BK1", Indian J Biochem Biophys., 42, pp 339-344 59 Johansen J S (2006), "Studies on serum YKL-40 as a biomarker in diseases with inflammation, tissue remodeling, fibroses and cancer", Dan Med Bull., 53, pp 172-209 Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.bio Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.vn 102 60 Johnson D L., Huang H C., Harper A M (1988), "Mortality of grasshoppers (Orthoptera: Acrididae) inoculated with a Canadian isolate of the fungus Verticillium lecanii", J Invertebr Pathol., 52, pp 335-42 61 Kang S C., Park S., Lee D G (1999), "Purification and characterization of a novel chitinase from the entomopathogenic fungus, Metarhizium anisopliae", J Invertebr Pathol., 73, pp 276-281 62 Kao P M., Huang S C., Chang Y C., Liu Y C (2007), "Development of continuous chitinase production process in a membrane bioreactor by Paenibacillus sp CHE-N1", Process Biochemistry, 42, pp 606-611 63 Kern M S F., Vom E D., Schrank A., Vainstein M H., Pasquali G (2010), "Expression of a chitinase gene from Metarhizium anisopliae in tobacco plants confers resistance against Rhizoctonia solani", Appl Biochem Biotechnol., 160, pp 1933-46 64 Khan M A., Rifat H., Mahboob A., Abdin M Z., Saleem J (2010), "Optimization of culture media for enhanced chitinase production from a novel strain of Stenotrophomonas maltophilia using response surface methodology", J Microbiol Biotechnol., 20, pp 1597-1602 65 Kiely T., Donaldson D., Grube A (2004), "Pesticides industry sales and usage, 2000 and 2001 market estimates", United States Environmental Protection Agency, pp 15-20 66 Kim C H., Tzu H., Chung S L., Ying T C., Chun Y L (2011), "The chitinolytic activities of Streptomyces sp TH-11", Int J Mol Sci., 12, pp 56-65 67 Kim H S., Timmis K N., Golyshin P N (2007), "Characterization of a chitinolytic enzyme from Serratia sp KCK isolated from kimchi juice", Appl Microbiol Biotechnol., 75, pp 1275-1283 68 Kim H Y., Lee H B., Kim U C., Kim I S (2008), "Laboratory and field evaluations of entomopathogenic Lecanicillium attenuatum CNU-23 for Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.bio Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.vn 103 control of green peach aphid (Myzus persicae)", J Microbiol Biotechnol., 18, pp 1915-1918 69 Kim J J (2004), "Pathologycal studies of Verticillium lecanii on the Cotton Aphid control", Agricultural Biology, pp 70 Kim J J., Kim C K (2008), "Selection of a highly virulent isolate of Lecanicillium attenuatum against cotton aphid", J Asia Pac Entomol., 11, pp 1-4 71 Kim J J., Lee M H., Yoon C S., Kim H S., Yoo J K., Kim K C (2001), "Control of Cotton aphid and greenhouse whitefly with a fungal pathogen, in biological control of greenhouse Pests", Food & Fertilizer Technology Center: Taipei, Taiwan, pp 8-15 72 Kim K J., Yang Y J., Kim J G (2003), "Purification and characterization of chitinase from Streptomyces sp M-20", J Biochem Mol Biol., 36, pp 185-189 73 Koga D., Isogai A., Sakuda S., Matsumoto S., Suzuki A., Kimura S (1987), "Specific inhibition of Bombyx mori chitinase by allosamidin", Agric Biol Chem., 51, pp 471-476 74 Kolla J P., Narayana., Muvva V (2009), "Chitinase production by Streptomyces sp ANU 6277", Braz J Microbiol., 40, pp 725-733 75 Kopparapu N K., Zhou P., Zhang S., Yan Q., Liu Z., Jiang Z (2012), "Purification and characterization of a novel chitinase gene from Paecilomyces thermophila expressed in Escherichia coli", Carbohydr Res., 347, pp 155-60 76 Kramer K J., Muthukrishnan S., Lowell J., White F (1997), "Chitinases for insect control In: N Carozzi, M Koziel (eds): Advances in insect conml: the role of transgenic plants", Taylor and Francis, Bristol, pp 185-193 Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.bio Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.vn 104 77 Kuzu S B., Guvenmez H K., Denizci A A (2012), "Production of a thermostable and alkaline chitinase by Bacillus thuringiensis sp kurstaki strain HBK-51", Biotechnol Res Int., 2012, pp 1-6 78 Laemmli U K (1970), "Clevage of structure proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4", Nature, 227, pp 680-685 79 Lee Y G (2002), "Selection of a highly virulent Verticillium lecanii strain against Trialeurodes vaporariorum at various temperatures", J Microbiol Biotechnol., 12, pp 145-148 80 Lee Y G., Chung K C., Wi S G., Lee J C., Bae H J (2009), "Purification and properties of a chitinase from Penicillium sp LYG 0704", Protein Expr Purif., 65, pp 244-250 81 Li D C., Chen S., Jing L U (2005), "Purification and partial characterization of two chitinases from the mycoparasitic fungus Talaromyces flavus", Mycopathologia, 159, pp 223-229 82 Lineweaver H., Burk D (1934), "The determination of enzyme dissociation constants", J Am Chem Soc., 56, pp 658-666 83 Liu B L., Kao P M., Tzeng Y M (2003), "Production of chitinase from Verticillium lecanii F091 using submerged fermentation", Enzyme Microb Technol, 33, pp 410–415 84 Lu Z X., Laroche A., Huang H C (2005), "Isolation and characterization of chitinases from Verticillium lecanii", Can J Microbiol, 51, pp 1045-1055 85 Luciana F F., Haroldo Y K., Hélia H S (2009), "Production, purification and application of extracellular chitinase from Cellulosimicrobium cellulans 191", Braz J Microbiol., 40, pp 623-630 86 Ma G Z., Gao H N., Zhang Y H., Li S D., Xie S D., Wu S J (2012), "Purification and characterization of chitinase from Gliocladium catenulatum strain HL-1-1", Afr J Microbiol Res., 6, pp 4377-4383 Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.bio Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.vn 105 87 Mathivanan N., Kabilan V., Murugesan K (1998), "Purification, characterization, and antifungal activity of chitinase from Fusarium chlamydosporum, a mycoparasite to groundnut rust, Puccina arachidis", Can J Microbiol., 44, pp 646-651 88 Matroudi S., Zamani M R., Motallebi M (2008), "Molecular cloningf of chitinase 33 (CHIT33) gene from Trichoderma atroviride", Braz J Microbiol., 39, pp 433-437 89 Matsumiya M., Miyauchi K., Mochizuki A (1998), "Distribution of chitinase and b-N-acetylhexosaminidase in the organs of a few squid and a cuttlefish", Fish Sci., 64, pp 166–167 90 Matsumiya M., Mochizuki A (1996), "Distribution of chitinase and b-Nacetylhexosaminidase in the organs of several fishes", Fish Sci., 62, pp 150–151 91 Mayorga-Reyes L., Calderon-Garza E., Gutierrez-Nava A., GonzalezCervantes R., Azaola-Espinosa A., Barranco-Florido E (2012), "Characterization and expression of the chitinase chitII gene from Lecanicillium lecanii in solid-state fermentation", Rev Mex Ing Quim., 11, pp 97-104 92 Miller G L (1959), "Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugars", Anal Chem., 31, pp 426-428 93 Milner R J (1997), "Prospects for biopesticides for aphid control", Biocontrol, 42, pp 227-239 94 Mizoguchi E (2006), "Chitinase 3-like-1 exacerbates intestinal inflammation by enhancing bacterial adhesion and invasion in colonic epithelial cells", Gastroenterology, 130, pp 398-411 95 Moazami N p (2002), "Biopesticides production, in Encyclopedia of Biological physiological and Health Sciences, Encyclopedia of life support systems", Encyclopedia Of Life Support Systems, pp 1-52 Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.bio Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.vn 106 96 Mustafa U., Kaur G (2010), "Studies on extracellular enzyme production in Beauveria Bassiana isolates", Res India Publications, 6, pp 701-713 97 Nawani N N., Kapadnis B P (2005), "Optimization of chitinase production using statistics based experimental designs", Process Biochemistry, 40, pp 651-660 98 Nirala N K., Das D K., Srivastava P S., Sopory S K., Upadhyaya K C (2010), "Expression of a rice chitinase gene enhances antifungal potential in transgenic grapevine (Vitis vinifera L.)", Vitis, 49, pp 181-187 99 Okay S., Özdal M., Kurbnoğlu E B (2013), "Characterization, antifungal activity, and cell immobilization of a chitinase from Serratia marcescens MO-1", Turk J Biol., 37, pp 639-644 100 Okazaki K., Kawabata T., Nakano M., Hayaka S (1999), "Purification and properties of chitinase from Arthrobacter sp.NHB-10", Biosci Biotechnol Biochem., 63, pp 1644-1646 101 Okey Z (2005), "Clonging of chitinase a gene (ChiA) from Serratia marcescens BN10 and its expression in coleoptera-specific Bacillus thuringiensis", The graduate School of Natural and AppliedSciences of Middle East Technical University, pp 15-20 102 Park H., Kim K (2010), "Selection of Lecanicillium strains with high virulence against developmental stages of Bemisia tabaci", Mycobiology, 38, pp 210-214 103 Park J K., Morita K., Fukumoto I., Yamasaki Y., Nakagawa T., Kawamukai M., Matsuda H (1997), "Purification and characterization of the chitinase (Chi A) from Enterobacter sp G-1", Biosci Biotechnol Biochem., 61, pp 684-689 104 Park S K., Cho H W., Heo K W., Hur D Y., Lee H K (2009), "Role of acidic mammalian chitinase and chitotriosidase in nasal polyps", Otolaryngol Head Neck Surg, 141, pp 462-6 Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.bio Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.vn 107 105 Patil N S., Waghmareb S R., Jadhav J P (2013), "Purification and characterization of an extracellular antifungal chitinase from Penicillium ochrochloron MTCC 517 and its application in protoplast formation", Process Biochemistry, 48, pp 176-183 106 Patil R S., Ghormade V V., Deshpande M V (2000), "Chitinolytic enzymes: an exploration", Enzyme Microb Technol., 26, pp 473–483 107 Pe’er S., Chet I (1990), "Trichoderma protoplast fusion; a tool for improving biocontrol agents", Can J Microbiol., 36, pp 6-9 108 Prasad M., Palanivelu P (2012), "Overexpression of a chitinase gene from the Thermophilic Fungus, Thermomyces lanuginosus in Saccharomyces cerevisiae and characterization of the recombinant chitinase", J Microb Biochem Technol., 4, pp 86-91 109 Purwani E Y., Maggy T S., Yaya R., Jae K H (2004), "Characteristics of thermostable chitinase enzymes from the indonesian Bacillus sp.1326", Enzyme Microb Technol., 35, pp 147-153 110 Rabeeth M., Anitha A., Srikanth G (2011), "Prufication of an antifungal endochitinase from a potential biocontrol agent Streptomyces grieus", Pak J Biol Sci., 14, pp 788-797 111 Ramirez-Coutino L., Espinosa-Marquez J., Peter M G., Shirai K (2010), "The effect of pH on the production of chitinolytic enzymes of Verticillium fungicola in submerged cultures", Bioresour Technol., 101, pp 9236-40 112 Ramirez-Coutino L., Marin-Cervantes M C., Huerta S., Revah S., Shirai K (2006), "Enzymatic hydrolysis of chitin in the production of oligosaccharides using Lecanicillium fungicola chitinases", Process Biochem., 41, pp 1106–1110 113 Ramli A N M., Mahadi N M., Rabu A., Murad A M A., Bakar F D A., Illias R M (2011), "Molecular cloning, expression and biochemical Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.bio Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.vn 108 characterisation of a cold-adapted novel recombinant chitinase from Glaciozyma antarctica PI12", Microbial Cell Factories, 10, pp 94 114 Rana I A., Loerz H., Schaefer W., Becker D (2012), "Over expression of chitinase and chitosanase genes from Trichoderma harzianum under constitutive and inducible promoters in order to Increase disease resistance in Wheat (Triticum aestivum L)", Molecular Plant Breeding, 3, pp 37-49 115 Rast D M., Horsch M., Furter R., Gooday G W (1991), "A complex chitinolytic system in exponentially growing mycelium of Mucor rouxii properties and function", J Gen Microbiol., 137, pp 2797-2810 116 Rattanakit N., Plikomol A., Yano S., Wakayama M., Tachiki T (2002), "Utilization of shellfish waste as a substrate for solid-state cultivation of Aspergillus sp S1-13 evaluation of a culture based on chitinase formation which is necessary for chitin-assimilation", J Biosci Bioeng., 93, pp 550-556 117 Revah-Moiseev S., Carroad P A (1981), "Conversion of the enzymatic hydrolysate of shellfish waste chitin to single-cell protein", Biotechnol Bioeng., 23, pp 1067-1078 118 Rocha-Pino Z., Vigueras G., Shirai K (2011), "Production and activities of chitinases and hydrophobins from Lecanicillium lecanii", Bioprocess Biosyst Eng., 34, pp 681-6 119 Rosenberger R F (1979), "Endogenous lytic enzymes and wall metabolism In: JH Burnett, APJ Trinci (eds): Fungal walls and hyphal growth", Cambridge University Press, pp 265-278 120 Ruiz-Sanchez A., Cruz-Camarillo R., Salcedo-Hernandez R., Ibarra J E., Barboza-Corona J E (2005), "Molecular cloning and purification of an endochitinase from Serratia marcescens (Nima)", Mol Biotechnol., 31, pp 103-111 121 Sambrook J., Russell D W (2001), "Molecular cloning: A laboratory manual", Cold spring harbor laboratory press: New York, 2, pp 1-21 Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.bio Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.vn 109 122 Sandhya C., Adapa L K., Nampoothiri K M., Binod P., Szakacs G., Pandey A (2004), "Extracellular chitinase production by Trichoderma harzianum in submerged fermentation", J Basic Microbiol., 44, pp 49-58 123 Sanger F., Nicklen S., Coulson A R (1977), "DNA sequencing with chainterminating inhibitors", Proc Natl Acad Sci U S A., 74, pp 5463-5467 124 Shinde S V., Patel K G., Purohit M S., Pandya J R., Sabalpara A N (2010), "Lecanicillium lecanii (Zimm.) Zare and games an important biocontrol agent for the management of insect pests - areview", Agricultural Reviews, 31, pp 235-252 125 Singh A K., Mehta G., Chhatpar H S (2009), "Optimization of medium constituents for improved chitinase production by Paenibacillus sp D1 using statistical approach", Letters in Applied Microbiology, 49, pp 708-714 126 Songjang K., Donchai T., Chaiyawat P., Meyer C R (2006), "Cloning and expression of chitinase gene isolated from Insect pathogenic fungi, Beauveria bassiana in Escherichia coli", Chiang Mai J Sci., 33, pp 347-355 127 St Leger R J., Cooper R M., Charnley A K (1986), "Cuticle-degrading enzymes of entomopathogenic fungi: regultion of production of chitinolytic enzymes", J Gen Microbiol., 132, pp 1509-1517 128 St Leger R J., Cooper R M., Charnley A K (1991), "Characterization of chitinase and chitobiase produced by the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae", J Invertebr Pathol., 58, pp 415-426 129 Sundheim L (1990), "Biocontrol of Fusarium oxysporum with a chitinase encoding gene from Sermtia marcescens on a stable plasmid in Pseudomonas", J Cell Biochem., 13A, pp 171 130 Sutherland T E., Maizels R M., Allen J E (2009), "Chitinases and chitinase-like proteins: potential therapeutic targets for the treatment of Thelper type allergies", Clin Exp Allergy., 7, pp 943-55 Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.bio Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.vn 110 131 Takao A T., Kawamoto N., Okazaki N., Nakazawa M., Miyatake K., Shinya S., Fukamizo T., Ueda M., Tamada T (2013), "Crystal structures of the catalytic domain of a novel glycohydrolase family 23 chitinase from Ralstonia sp A-471 reveals a unique arrangement of the catalytic residues for inverting chitin hydrolysis", J Bio Chem., 288, pp 18696-18706 132 Tanabe T., Kawase T., Watanabe T., Uchiada Y., Mitsutomi M (2000), "Purification and characterization of a 49-kDa chitinase from Streptomyces griseus HUT 6037", J Biosci Bioeng., 89, pp 27-32 133 Tang W., Li Y., Liu L., Zhang J., Xian H (2012), "Characterization and production optimization of a chitinase (Tachil) from Trichoderma asperellum in recombinant Pichia pastoris expression system", Wei Sheng Wu Xue Bao., 52, pp 345-352 134 Thiagarajan V., Revathia R., Aparanjinib K., Sivamanic P., Girilala M., Priyad C S., Kalaichelvana P T (2011), "Extra cellular chitinase production by Streptomyces sp PTK19 in submerged fermentation and its lytic activity on Fusarium oxysporum PTK2 cell wall", Int J Curr Sci., 1, pp 30-44 135 Thomas H., Arthur F M., Kara B., Stephen E., Rebecca C., Jon D R (2000), "The X-ray structure of a chitinase from the pathogenic fungus Coccidioides immitis", Cambridge University Press, 9, pp 544-551 136 Tikhonov V E., Lopez-Llorca L V., Salinas J., Jansson H.-B (2002), "Purification and characterization of chitinases from the nematophagous fungi Verticillium chlamydosporium and V suchlasporium", Fungal Genet Biol., 35, pp 67–78 137 Toharisman A., Suhartono M., Spindler-Barth M., Hwang J K., Pyun Y R (2005), "Purification and characterization of a thermostable chitinase from Bacillus licheniformis Mb-2", World J Microbiol Biotechnol., 21, pp 733-738 Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.bio Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.vn 111 138 Tschen J S M., Li I F (1994), "Optimization of formation and regeneration of protoplasts from biocontrol agents of Trichoderma sp", Mycoscience, 35, pp 257-263 139 Tsujibo H., Yoshida Y., Miyamoto K., Imada C., Okami Y., Inamori Y (1992), "Purification, properties, and partial amino acid sequence from a marine Aeromonas sp strain O-7", Can J Microbiol., 38, pp 891-897 140 Uchiyama T., Katouno F., Nikaidou N., Nonaka T., Sugiyama J., Watanabe T (2001), "Roles of the exposed aromatic residues in crystalline chitin hydrolysis by chitinase A from Serratia marcescens 2170", J Biol Chem., 276, pp 41343-41349 141 Ulhoa C J., Peberdy J F (1991), "Regulation of chitinase synthesis in Trichoderma harzianum", J Gen Microbiol., 137, pp 2163-2169 142 Vladimir E., Tikhonov., Luis V., Lopez L., Jesus S., Hans-Borje J (2002), "Purification and characterization of chitinases from the Nematophagous Fungi Verticillium chlamydosporium and Verticillium suchlasporium", Fungal Genet Biol., 35, pp 67-78 143 Vu V H., Hong S I., Kim K (2007), "Selection of entomopathogenic fungi for aphid control", J Biosci Bioeng., 104, pp 498-505 144 Watanabe T., Kanai R., Kawase T., Tanabe T., Mitsutomi M., Sakuda S., Miyashita K (1999), "Family 19 chitinases of Streptomyces species: characterization and distribution", Microbiology., 145, pp 3353-3363 145 Xia J I., Xiong J., Xu T., Zhang C G., Zhang R I., Zhang Q., Wu S., Qiu G Z (2009), "Purification and characterization of extracellular chitinase from a novel strain Aspergillus fumigatus CS-01", J Cent South Unive Technol., 16, pp 552-557 146 Xiao L., Liu C., Xie C., Cai J., Liu D., Chen Y (2010), "Heterogeneous expression of chitinase gene from Bacillus licheniformis MY75 and the Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.bio Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.vn 112 characterization of expressed ChiMY", Wei Sheng Wu Xue Bao., 50, pp 749-754 147 Zarei M., Aminzadeh S., Zolgharnein H., Safahieh A., Daliri M., Noghabi K A., Ghoroghi A., Motallebi A (2011), "Characterization of a chitinase with antifungal activity from a native Serratia marcescens B4A", Braz J Microbiol., 42, pp 1017-1029 148 Zeki N H., Muslim S N (2010), "Purification, characterization and antifungal activity of chitinase from Serratia marcescens isolated from fresh vegetables", J Pure Appl Sci., 23, pp 1-15 149 Zhang J., Cai J., Wu K., Jin S., Pan R., Fan M (2004), "Production and properties of chitinase from Beauveria bassiana Bb174 in solid state fermentation", Ying Yong Sheng Tai Xue Bao., 15, pp 863-866 150 Zhen X L., Laroche A., Hung C H (2005), "Isolation and characterization of chitinases from Verticillium lecanii", Can J Microbiol., 51, pp 1045-1055 151 Zhu Y., Pan J., Qiu J., Guan X (2008), "Isolation and characterization of a chitinase gene from entomopathogenic fungus Verticillium lecanii", Braz J Microbiol., 9, pp 314-320 Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.bio Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.vn 113 PHỤ LỤC Bảng P1 Thành phần loại đệm dung dịch Dung dịch Thành phần, nồng độ (w/v) Dung dịch APS Ammonium persulfate 10% Dung dịch Bradford gốc 100 ml ethanol 95% (v/v), 350 mg serva blue G, 200 ml phosphoric acid 88% (v/v) Dung dịch Bradford 425 ml H2O, 15 ml ethanol 95% (v/v), 30 ml working phosphoric acid 88% (v/v), 30 ml dung dịch Bradford gốc Dung dịch A Đệm Tris-HCl 1,5M, pH 8,8 Dung dịch B Đệm Tris-HCl 0,5M, pH 6,8 Dung dịch C Acrylamide 30%, bis-acrylamide 0,8% Dung dịch D SDS 10% Dung dịch DNS DNS 0,53%, NaOH 0,99%, KNaC4H4O6 15,3%, Na2S2O5 0,415%, phenol 0,38% (v/v) Dung dịch I Tris-HCl 100 mM, EDTA 10 mM, pH 8,0 Dung dịch II NaOH 0,2 N, SDS 1% Dung dịch III Kali acetate 60%, acid acetic 11,5% (v/v), nước 28,5% Dung dịch nhuộm DNA Ethidium bromide 0,1 g/ml Dung dịch nhuộm Coomassie brilliant blue 0,1%, methanol 30% PAGE (v/v), acid acetic 10% Dung dịch tẩy PAGE Methanol 30% (v/v), acid acetic 10% (v/v) Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.bio Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.vn 114 Đệm điện di protein Tris-HCl 20 mM, glycine 192 mM, SDS 0,1%, pH 8,8 Đệm 5x tra mẫu protein Brommophenol blue 0,05%, glycerol 50% pha đệm Tris-HCl M, pH 6,8 Đệm TE Tris-HCl 10 mM, EDTA mM, pH Đệm 10x TBE EDTA 20 mM, Tris-borate 900 mM, pH Đệm 6x tra mẫu DNA Brommophenol blue 0,09%, xylene xyanol 0,09%, glycerol 60% Đệm rửa DNA Ethanol 70% (v/v) Chia se tai lieu Y Sinh hoc mien phi tai: https://wWw.YSinhHoc.bio ... https://wWw.YSinhHoc.vn BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN NGUYỄN HỮU QUÂN NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH CỦA CHITINASE TỰ NHIÊN VÀ BIỂU HIỆN CHITINASE TÁI TỔ HỢP TỪ CHỦNG NẤM LECANICILLIUM LECANII Chuyên ngành:... tử nấm cần thiết Xuất phát từ lý trên, tiến hành lựa chọn đề tài luận án: Nghiên cứu đặc tính chitinase tự nhiên biểu chitinase tái tổ hợp từ chủng nấm Lecanicillium lecanii” Chia se tai lieu... (ii) Xác định trình tự nucleotide gen mã hóa chitinase từ chủng nấm L lecanii tuyển chọn; (iii) Biểu chitinase tái tổ hợp gen mã hóa phân lập từ chủng nấm L lecanii tuyển chọn nấm men Pichia pastoris