Công nghệ sinh học ngày nay đang ngày càng đóng vai trò quan trọng trong cuộc sống. Trong những năm gần đây, chúng ta đã chứng kiến sự bùng nổ trong việc ứng dụng di truyền học, tế bào học, protein tái tổ hợp để nâng cao chất lượng cuộc sống; từ các phương pháp điều trị mới đến các xét nghiệm chẩn đoán nhanh chóng và các hướng liệu pháp điều trị mới trong y học. Hiện nay, trong y học, các protein có hoạt tính sinh học đang ngày càng được sử dụng rộng rãi để làm thuốc điều trị như các loại hormon, enzym... Trước đây, nguồn nguyên liệu để sản xuất các loại protein này chủ yếu là chiết từ các bộ phận của động vật. Tuy nhiên do nhu cầu ngày càng cao trong khi nguồn cung từ động vật rất hạn chế, giá thành lại đắt nên việc tổng hợp protein tái tổ hợp được đặt ra một cách cấp thiết. Trong những thập niên gần đây, với những bước tiến lớn trong công nghệ sinh học phân tử việc tổng hợp protein không còn khó khăn như trước nhờ phương pháp tổng hợp sinh học. Mặc dù một số protein có thể tổng hợp bằng con đường hoá học song phương pháp tổng hợp sinh học thể hiện tính tối ưu và thực tiễn cao. Thực tế hiện nay phương pháp này đã được áp dụng rộng rãi không những để tổng hợp một số loại protein làm thuốc như insulin, growth hormon...mà còn để tổng hợp rất nhiều hợp chất khác mà nguồn nguyên liệu hạn chế hoặc con đường tổng hợp hoá học gặp khó khă
MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Công nghệ sinh học đóng vai trò quan trọng sống Trong năm gần đây, chứng kiến bùng nổ việc ứng dụng di truyền học, tế bào học, protein tái tổ hợp để nâng cao chất lượng sống; từ phương pháp điều trị đến xét nghiệm chẩn đoán nhanh chóng hướng liệu pháp điều trị y học Hiện nay, y học, protein có hoạt tính sinh học ngày sử dụng rộng rãi để làm thuốc điều trị loại hormon, enzym Trước đây, nguồn nguyên liệu để sản xuất loại protein chủ yếu chiết từ phận động vật Tuy nhiên nhu cầu ngày cao nguồn cung từ động vật hạn chế, giá thành lại đắt nên việc tổng hợp protein tái tổ hợp đặt cách cấp thiết Trong thập niên gần đây, với bước tiến lớn công nghệ sinh học phân tử việc tổng hợp protein không khó khăn trước nhờ phương pháp tổng hợp sinh học Mặc dù số protein tổng hợp đường hoá học song phương pháp tổng hợp sinh học thể tính tối ưu thực tiễn cao Thực tế phương pháp áp dụng rộng rãi để tổng hợp số loại protein làm thuốc insulin, growth hormon mà để tổng hợp nhiều hợp chất khác mà nguồn nguyên liệu hạn chế đường tổng hợp hoá học gặp khó khăn Mục tiêu chuyên đề 2.1 Khái quát nội dung protein protein tái tổ hợp 2.2 Tổng hợp phân tích tình hình nghiên cứu, phát triển ứng dụng loại thuốc protein tái tổ hợp y học 2.3 Nêu bật định hướng phát triển, ứng dụng protein tái tổ hợp có hoạt tính sinh học cao nhằm phục vụ chăm sóc sức khỏe cộng đồng Nội dung chuyên đề Chuyên đề trình bày theo nội dung sau: Chương Protein sở khoa học protein tái tổ hợp 1 Chương Nguyên lý sản xuất định hướng phát triển protein tái tổ hợp 2 CHƯƠNG PROTEIN VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA PROTEIN TÁI TỔ HỢP 1.1 Protein Protein phát lần kỷ XVIII (1745 Beccari); đầu gọi allbumin (lòng trắng trứng) Mãi đến năm 1838 , Mulder lần đưa thuật ngữ protein (xuất phát từ chữ Hy lạp proteos nghĩa “đầu tiên”, “quan trọng nhất”) Protein hợp chất hữu có ý nghĩa quan trọng bậc thể sống Về mặt số lượng, chiếm 50% trọng lượng khô tế bào Về thành phần cấu trúc, protein tạo thành chủ yếu từ amino acid qua liên kết peptide Cho đến người ta thu nhiều loại protein dạng cao kết tinh xác định thành phần nguyên tố hoá học, thông thường cấu trúc chúng gồm bốn nguyên tố C H O N với tỷ lệ C ≈ 50%, H ≈ 7%, O ≈ 23% N ≈ 16% Đặc biệt tỷ lệ N protein ổn định Ngoài protein gặp số nguyên tố khác S ≈ 0-3% P, Fe, Zn, Cu 1.2 Chức sinh học protein Ngoài vai trò thành phần cấu trúc tế bào mô, protein có nhiều chức phong phú khác định đặc điểm sống truyền đạt thông tin di truyền, chuyển hoá chất enzyme, kháng thể chống lại bệnh tật, hormon dẫn truyền tín hiệu tế bào v.v có chất protein Sự phát triển sinh học phân tử dựa lý thuyết trung tâm “DNA RNA Protein” Như vậy, biến đổi DNA dẫn đến biến đổi cấu trúc phân tử protein chức sinh học bị biến đổi kéo theo thay đổi có liên quan đến toàn thể Trong trình tiến hoá sinh vật hình thành thích nghi chức diễn giai đoạn lịch sử lâu dài Sự xuất protein biến dạng (mất hoạt tính đột biến cấu trúc) thường kèm bệnh tật 3 Y học ngành khoa học sống, ngày với tiến khoa học, hiểu biết bệnh lý mức độ phân tử vượt khỏi giới hạn giải phẩu tế bào quan Sinh học phân tử đời tạo cách mạng quan niệm bệnh Từ đó, phát triển bệnh học phân tử luôn kèm với sinh học phân tử Sự biến đổi cấu trúc protein hay xuất enzyme có cấu trúc bất thường yếu tố di truyền gây nên Dựa theo biểu di truyền người ta chia protein bệnh lý làm hai loại lớn: a Những biến đổi số lượng của protein: Là thay đổi tăng giảm protein đó, chí xuất protein mà tế bào bình thường không tổng hợp cách thường xuyên Những protein có cấu trúc bình thường biến đổi gene cấu trúc Những lệch lạc rối loạn trình điều hoà sinh tổng hợp protein Do protein có cấu trúc bình thường mà chỉ thay đổi số lượng nên chúng có chức bình thường chỉ thay đổi mức độ hoạt động Trong trường hợp protein enzyme lệch lạc số lượng enzyme dẫn đến rối loạn dây chuyền chuyển hoá chất thể sống b Những biến đổi chất lượng protein: Là rối loạn cấu trúc protein gene bị biến đổi, dẫn đến cấu trúc protein thay đổi kéo theo thay đổi chức sinh học protein Ví dụ, biến đổi cấu trúc hemoglobin (Hb) protein có chức vận chuyển oxygen máu dẫn đến bệnh thiếu máu, hay bệnh thiếu máu hồng cầu hình lưỡi liềm v.v… Ngoài ra, protein tham gia vào hệ thống miễn dịch Trong thể, có nhiều quan, nhiều loại tế bào đặc biệt nhiều loại protein thực chức riêng biệt tạo nên hiệu miễn dịch đặc hiệu không đặc hiệu Các protein miễn dịch nhắc đến nhiều kháng thể, bổ thể cytokine 1.3 Các phương pháp thu nhận, tinh protein tái tổ hợp Các phương pháp thu nhận tinh protein dựa tính chất hóa lý protein độ tích điện, kích thước phân tử, độ hòa tan 4 protein cần thu nhận Nhiều protein liên kết với phân tử sinh học khác nên việc thu nhận protein phụ thuộc vào chất liên kết Muốn thu nhận protein nguyên thể tức protein có tất tính chất tự nhiên đặc trưng nó, cần sử dụng biện pháp khác như: nhiệt độ, nồng độ proton (pH), sử dụng tác nhân hóa học, học, sóng siêu âm v.v 1.3.1 Phá vỡ tế bào Protein enzyme có tất thể động vật, thực vật vi sinh vật Sau tổng hợp tiết tế bào tồn dịch thể, dịch môi trường (gọi protein enzyme ngoại bào) giữ lại bên tế bào (protein enzyme nội bào) Các protein enzyme nội bào tồn dạng hòa tan tế bào chất bào quan (nhân, microsome, mitochondria v.v ) tế bào Do để chiết rút protein enzyme nội bào, bước phải phá vỡ cấu trúc tế bào có chứa protein enzyme chuyển chúng vào dung dịch Có thể phá vỡ cấu trúc tế bào biện pháp học nghiền với bột thủy tinh cát thạch anh, làm đồng hóa thiết bị nghiên đồng thể (homogenizator) Thiết bị có chày thủy tinh gắn với môtơ quay điều chỉnh tốc độ quay theo yêu cầu Các tế bào chày thùy tinh thành cối bị phá hủy Để việc phá vỡ có hiệu quả, mô thực vật, trước nghiền, người ta thường thái nhỏ mẫu để vào ngăn đá cho trương nước (ví dụ mẫu hạt khô) Còn mô động vật gan thận, chiết protein enzyme người ta cần cắt bỏ mô liên kết Muốn tách protein thành phần tế bào, người ta phải dùng yếu tố vật lý hóa học khác sóng siêu âm, dùng dung môi hữu butanol, acetone, glycerin, ethylacetat chất tẩy (detergent) Các hóa chất tốt cho việc phá vỡ bào quan tế bào quan thường chứa mỡ 5 1.3.2 Chiết rút protein Sau phá vỡ cấu trúc tế bào tiến hành chiết xuất protein enzyme dụng dịch đệm thích hợp, dung dịch muối trung tính nước protein enzyme nội bào ly tâm tách tế bào protein enzyme ngoại bào: việc chọn phương pháp tách chiết protein enzyme tùy thuộc vào tính chất protein enzyme cần nghiên cứu 1.3.3 Tinh protein 1.3.3.1 Loại tạp chất Trong dịch chiết thô thu protein enzyme có protein tạp, chất cao phân tử khác polysaccharid, acid nucleic chất phân tử nhỏ đường monose, chất lipid, muối khoáng v.v Để loại bỏ chúng phải sử dụng phối hợp nhiều biện pháp khác Để loại bỏ muối khoáng loại đường tạp chất có phân tử lượng thấp người ta thường dùng phương pháp thẩm tích (dialysis) đối nước hay đối dung dịch đệm loãng cách lọc qua gel sephadex Để loại bỏ protein tạp tạp chất có phân tử lượng cao khác, người ta hay dùng kết hợp nhiều biện pháp khác nhau: phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng nhiệt độ pH môi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn muối trung tính dung môi hữu cơ, phương pháp sắc ký trao đổi ion, điện di, phương pháp lọc gel 1.3.3.2 Các kỹ thuật thông thường tinh protein Sau nhận dịch chiết protein thô, người ta thường sử dụng phương pháp khác để tách chiết đồng thời làm tinh protein như: ly tâm, thẩm tích, sắc ký lọc gel, sắc ký trao đổi ion, sắc ký lực v.v… a Phương pháp ly tâm Máy ly tâm sử dụng để tách phần khác khỏi dung dịch Người ta gọi pha lỏng chất lỏng bên kết tủa, pha rắn mà thường lắng kết xuống đáy ống ly tâm gọi kết tủa Thực chất, ly tâm tăng tốc độ kết tủa tiểu phần rắn nhờ lực ly tâm Sự sai khác tỷ trọng nguyên 6 liệu lơ lững so với chất lỏng lớn tốc độ kết tủa cao Mặc dầu người ta coi số vòng quay phút đơn vị thông thường lực ly tâm, quy ước không thỏa mãn Chính vậy, mức độ tăng lực ly tâm đo cách xác bội số trị số gia tốc lực hút mặt biển, có nghĩa đo lực ly tâm tương đối (relative centrifugal force, RCF) đo giá trị bội số lực hút trọng trường (xg) Công thức để tính lực ly tâm tương đối là: Trong r bán kính đến đáy ống ly tâm tính "foot" (1 foot = 30,48cm), n số vòng quay giây Có thể tính giá trị lực ly tâm tương đối cách trực công thức: Lực ly tâm tương đối (g) = 1,1118 x 10-5 x R x N2 Trong đó: R bán kính (cm) nắp ly tâm tính từ tâm trục đến đáy ống ly tâm, N số vòng quay phút Do tính chất không bền với nhiệt phần lớn loại protein enzyme, tách chiết tinh chế chúng, cần sử dụng máy ly tâm lạnh Trong trường hợp điều kiện thí nghiệm có hạn chế, sử dụng số phương pháp nhằm đảm bảo trì mẫu nhiệt độ thấp Cần làm lạnh tốt mẫu ống ly tâm trước ly tâm Có thể đặt trực tiếp máy ly tâm bé vào tủ lạnh, đưa dây dẫn qua lớp đệm cánh cửa tủ lạnh b Phương pháp thẩm tích Thẩm tích khuếch tán vi phân qua màng vốn không thấm chất keo hòa tan (protein, số polysaccharid) thấm dạng dịch tinh thể Các tinh thể (các muối, hợp chất hữu có trọng lượng phân tử thấp ) khuếch tán qua màng theo định luật Fick Nước khuếch tán từ dung dịch có nồng độ thấp (thường dung dịch rửa) vào dung dịch keo, ion (cation anion) chất phân tử nhỏ chuyển vào dung dịch có nồng độ thấp (thường chuyển vào dung dịch rửa) Trong trình tách chiết tinh protein, để loại muối ammonium sulphate 7 khỏi dung dịch protein cho dung dịch protein vào túi đặc hiệu làm nguyên liệu bán thấm Thông thường người ta hay dùng túi colodion cellophane (loại sau hay dùng hơn) Sau đặt túi vào bình chứa lượng lớn nước lượng lớn dung dịch đệm pha loãng (ví dụ đệm phosphate có pH = 7, nồng độ 0,01M) Vì màng cellophane màng bán thấm, có kích thước lỗ chỉ cho chất có phân tử qua vào dung dịch đệm loãng theo định luật khuếch tán Như vậy, muối khuyến tán vào nước dung dịch đêm loãng (di chuyển theo hướng giảm nồng độ), nước đệm loãng di chuyển từ dung dịch rửa vào túi chứa protein Protein đại phân tử vượt qua túi thẩm tích giử lại túi Bằng cách thay đổi thường xuyên dung dịch rửa tẩy muối khỏi protein , trình thẩm tích, dung dịch pha loãng Có thể làm giảm bớt loại trừ pha loãng tiến hành thẩm tích áp suất, có nghĩa dung dịch xử lý nằm áp suất thủy tĩnh đầy đủ, để dòng thủy động học nước từ dung dịch cân khuếch tán phân tử vào dung dịch Phương pháp thường đòi hỏi có thiết bị đặc biệt Phương pháp thẩm tích thông thường cho dung dịch có kết tủa protein vào túi thẩm tích (không 2/3 thể tích túi) Cho thuốc sát trùng toluen để bảo quản protein (vì thời gian thẩm tích lâu, protein bị hỏng) Buộc túi vào que thủy tinh, gác que thủy tinh lên miệng chậu nước để giữ túi chậu Cho vòi nước chảy nhẹ liên tục vào đáy chậu để thay đổi nước thường xuyên Muối (NH2)SO4 hòa tan nước bị loại dần Thời gian thẩm tích từ 24 - 48 giờ, làm thẩm tích lần cuối nước cất Có thể tăng tốc độ thẩm tích khuấy dung dịch rửa máy khuấy học hay máy khuấy từ Tất trình thẩm tích protein thường thao tác môi trường lạnh c Sắc ký lọc gel Sắc ký lọc gel kỹ thuật sắc ký cột dùng phổ biến tách chiết tinh protein 8 Dịch chiết protein enzyme loại bỏ phần lớn protein tạp chưa đảm bảo độ đồng cần thiết tiếp tục làm phương pháp sắc ký cột Cơ sở phương pháp lọc gel dựa vào khác nhau kích thước, hình dạng phân tử lượng protein enzyme có hỗn hợp để tách chúng Để đảm bảo cho việc tách protein enzyme tốt, chất rây phân tử phải chất trơ, không phản ứng với protein enzyme Chất cũng không hòa tan tương đối bền với yếu tố học cũng sinh học Ngoài chất sử dụng cho mục đích lọc phân tử phải chất tính đàn hồi (không co) phải chất ưa nước (hidrofil) Gel sephadex chất thỏa mãn yếu tố Sephadex chế phẩm dextran loài vi sinh vật khác Leuconostoc tạo chúng nuôi cấy môi trường chứa saccharose Trọng lượng phân tử dextran đạt tới hàng triệu lớn Phân tử dextran bao gồm chuỗi gốc glucose tạo thành liên kết 1,6 Số liên kết ngang tạo nhiều, kích thước lỗ sàng phân tử nhỏ Phương pháp lọc phân tử sephadex tiến hành sau: cho sephadex vào cột thủy tinh dài cân bằng dung dịch đệm có pH định Sau cho dung dịch protein enzyme lên cột Khi lọc chiết dung môi thích hợp, phân tử có trọng lượng phân tử nhỏ (ở muối) khuếch tán chậm chạp qua lỗ nhỏ hạt sephadex bị trương phồng, chất có trọng lượng phân tử lớn (protein enzyme) khả vào mà lách nhanh qua hạt sephadex chiết nhanh khỏi cột Vì ta tách chất có trọng lượng phân tử cao thoát khỏi cột gel trước so với chất có phân tử lượng nhỏ Hãng Sephadex (Pharmacia) Thụy Điển tung thị trường loại sephadex có kích thước khác có ký hiệu từ G10 đến G200 Số ký hiệu để chỉ mức độ hút nước chúng Ví dụ G10 để chỉ trương phồng 1g gel khô nhận 1ml nước (1ml/g) 9 Các sephadex có ký hiệu khác từ G10 đến G200 phục vụ việc lọc phân tử cho phép chất có trọng lượng phân tử khác lọt vào ngưỡng khác Người ta sử dụng sephadex để loại muối thay cho trình thẩm tích Cùng nhóm chất rây phân tử có nguồn gốc polisacharid, chế phẩm dextran sephadex (pharmacia) có molselect (Reanal) - sản phẩm Hungary ứng dụng nhiều nghiên cứu Ngoài nhóm chất rây phân tử chế phẩm dextran có nhóm chất rây phân tử chế phẩm gel acrilamid bao gồm biogel (Bio - Rad) acrilex (Reanal) Acrilex gel loại copolimer, tạo từ acrilamid N, N' metilen bisacrilamid Các acrilex gel có ký hiệu từ P - 300 dùng để tách chất có trọng lượng phân tử ngưỡng từ 100 - đến 300.000 Có thể sử dụng vùng pH từ - 11 Chất thứ ba agarose gel, loại sulphate Hay phổ biến loại sepharose (pharmacia) Người ta thường dùng chất để tách phân tử có trọng lượng lớn 106 Tóm lại phương pháp lọc rây phân tử người ta thể tách chất có trọng lượng phân tử khác có hỗn hợp (như polimer, polisaccharid, acid nucleic, protein) Người ta dùng kỹ thuật để loại muối thay cho trình thẩm tích Và nữa, trình tinh chế protein enzyme, chúng sử dụng để cô đặc dung dịch protein enzyme d Phương pháp sắc ký trao đổi ion Phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa vào khác điện tích tổng số protein enzyme Hay nói cách khác, phương pháp dựa sở phản ứng trao đổi ion protein tan nước dung dịch đệm loãng tác nhân trao đổi ion Tác nhân (hay nguyên liệu) trao đổi ion chất nhựa có tích nhóm sinh ion chất ionit Đây chất giá trơ, không tan nước, có chất cellulose chất gel dextran có lưới phân nhánh (sephadex, molselect) chất nhựa polistirol Chất giá thể thường kết hợp với nhóm ion hóa Các chất trao đổi ion có chất giá 10 10 Người ta thường sử dụng gen kháng kháng sinh để làm dấu hiệu chỉ thị tế bào dung nạp plasmid để phân lập tế bào môi trường thạch chứa kháng sinh chỉ thị Tế bào nhận plasmid tái tổ hợp nuôi cấy để phát triển thành dòng Với số plasmid, việc cho vào môi trường nồng độ thấp kháng sinh chloramphenicol dẫn đến việc chép plasmid điều khiển khiến cho hàng trăm plasmid tổng hợp tế bào vi khuẩn Nuôi cấy nhân bản dòng vi khuẩn được biến đổi để tổng hợp protein: Sau có dòng vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp mong muốn, ta đưa vi khuẩn vào môi trường nuôi cấy thích hợp Quần thể vi khuẩn phát triển nhanh chóng tổng hợp chuỗi polypeptide mà gen mục tiêu đưa vào mã hoá Bằng kỹ thuật khác ta tách tinh chế sản phẩm Xử lý chuỗi polypeptide để được protein có hoạt tính mong muốn: Chuỗi polypeptide tổng hợp xong thường dạng pro-protein Dạng thường hoạt tính sinh học (protein chưa trưởng thành) Các chuỗi protein cần xử lý enzyme tác nhân thích hợp để có cấu trúc không gian hoạt tính mong muốn Hiện kỹ thuật áp dụng để tổng hợp nhiều thuốc có chất protein Ví dụ, tổng hợp insulin người dùng điều trị bệnh tiểu đường Thiết kế plasmid: Gen mã hoá insulin chứa hai chuỗi DNA (chuỗi dài chứa 18 phân đoạn nucleotide, chuỗi ngắn chứa 11 phân đoạn) hai chuỗi nucleotide tổng hợp thành đoạn gen riêng biệt ghép riêng rẽ vào plasmid pBR322 gần phần cuối gen β-galactosidase Plasmid biến nạp vào E.coli nhân lên E.coli Sau phiên mã sang mRNA hai mạch insulin tạo thành tiết với β-galactosidase Sau tách polypeptide khỏi 17 17 enzyme BrCN, hai mạch gắn lại với tạo insulin hoạt động (kỹ thuật block) Kỹ thuật sản xuất insulin bước cũng kỹ thuật tái tổ hợp DNA, gen gắn vào gen mã hoá proinsulin Sau chiết, proinsulin thuỷ phân protease cắt mạch peptid cho insulin hoạt động Hình Quy trình tổng hợp insulin tái tổ hợp vi khuẩn 18 18 CHƯƠNG NGUYÊN LÝ VÀ ĐỊNH HƯỚNG PHÁT TRIỂN PROTEIN TÁI TỔ HỢP 2.1 Quy trình sản xuất thuốc protein tái tổ hợp công nghệ sinh học 2.1.1 Giai đoạn nghiên cứu Về nguyên tắc, kỹ thuật protein tái tổ hợp hay tạo dòng (cloning) gồm bước sau (1) tách chiết tinh DNA gene sinh vật cần tạo dòng, (2) tạo đoạn gene mã hóa cho protein mong muốn in-vitro phản ứng chuỗi (PCR), (3) tạo vector chuyển gene, (4) chuyển gene mong muốn vào tế bào nhận, (5) phát phân lập dòng tế bào nhận có khả sản xuất nhiều protein tái tổ hợp Trong tế bào chủ, đoạn gene tái tổ hợp biểu thành protein tái tổ hợp mong muốn Việc sản xuất protein tái tổ hợp thường bắt đầu việc lựa chọn “nhà máy sản xuất protein”, thông qua hai đường: khuẩn E.coli tế bào động vật có vú CHO E.coli chủng vi sinh vật thường lựa chọn để làm tế bào tải nạp Ưu điểm hệ thống biểu dễ thực hiện, hệ thống lên men không phức tạp, không đòi hỏi trang thiết bị, vật tư đắt tiền Tuy nhiên, việc sản xuất protein tái tổ hợp E.coli cũng gặp nhiều khó khăn, protein có nguồn gốc từ người động vật có vú (là đối tượng để sản xuất protein tái hợp) Các protein tái tổ hợp có nguồn gốc động vật sản xuất từ E.coli thường phải qua giai đoạn tái gấp cuộn ( refolding) tinh chế phức tạp Để khắc phục điều này, dòng tế bào động vật có vú 3T3, CHO, BHK sử dụng, tế bào CHO (tế bào buồng trứng chuột túi má Trung Quốc) sử dụng rộng rãi 60% sản phẩm protein tái tổ hợp sản xuất từ tế bào CHO Điều kiện tiên để định thành công trình sản xuất thuốc theo đường tái tổ hợp thiết kế hệ thống biểu Thông thường công ty lớn giới chuyên thiết kế khung biểu có sẵn, nhóm nghiên cứu phát triển công ty dược tìm kiếm liệu liên quan đến sản phẩm cần sản xuất tìm cách tối ưu hóa hiệu sản xuất 19 19 cao Các tế bào (vi khuẩn, nấm men hay tế bào động vật) chuyển gene “nhà máy” để sản xuất protein tái tổ hợp mong muốn hệ thống nồi lên men 2.1.2 Giai đoạn sản xuất Để lên men tế bào dùng phương pháp nuôi cấy bề mặt, nuôi cấy chìm, nuôi cấy lắc, nuôi cấy huyền phù, nuôi cấy phân đợt, nuôi cấy liên tục, nuôi cấy phân đoạn - liên tục, nuôi cấy fedbatch… Sau lên men, tùy vào loại protein mà có phương pháp xử lý khác Chính thế, protein tái tổ hợp dùng sản xuất thuốc phải tinh hoàn toàn Công cụ hỗ trợ cho trình tinh hệ thống sắc ký lỏng Tùy loại protein khác mà phương pháp tinh chế thiết kế cho phù hợp Protein tái tổ hợp sau kiểm nghiệm bảo đảm độ an toàn đạt tiêu chuẩn WHO cục quản lý dược phẩm đem pha chế với thành phần tá dược khác để đóng ống đóng gói Sản phẩm cuối tái kiểm tra độ chắn độ an toàn cũng hoạt tính trước đem thị trường 2.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất protein có hoạt tính sinh học Insulin protein hormone tái tổ hợp (Abel, 1925); enzyme tái tổ hợp urease (Summer, 1926) Người ta tiếp tục sâu vào nghiên cứu cấu trúc chức phận protein cũng mối liên quan chúng Với công trình nghiên cứu nhà sinh hoá học người Mỹ J.H Northrop thu ba loại protein tái tổ hợp pepsin (1930), tripsin (1932), chymotripsin (1935) số công trình khác người ta hiểu rõ hoạt tính sinh học loại enzyme Đến năm 1953, Sanger xác định cấu trúc bậc insulin gồm có 51 amino acid; tiếp Hirs, Stein More cộng (1960) xác định cấu trúc bậc enzyme ribonuclease gồm 121 amino acid; cũng năm Braunitzer xác định hemoglobin người gồm chuỗi polypeptide, hai chuỗi - mỗi chuỗi141 amino acid hai chuỗi - mỗi chuỗi 146 amino acid hàng chục protein khác cytocrom, papain v.v Mặc dù từ năm 1953 lần Du Vigneaud tổng hợp hormon peptide oxytocin vasopressin phương pháp hoá học chỉ 10 năm sau (1963) Trung quốc, 20 20 Mỹ Tây Đức tổng hợp insulin theo mẫu cấu trúc bậc Sanger đưa ra; 1969 tổng hợp ribonuclease 1970 tổng hợp protein sinh trưởng Từ người bước vào giai đoạn tổng hợp nhân tạo protein, chất có tầm quan bậc sống Trong thập niên 70 việc tách chiết nghiên cứu chức protein có hoạt động sinh lý, đặc biệt lĩnh vực tính kháng khuẩn peptide diễn mạnh mẽ như: vai trò bảo vệ cationic protein hạt bào tương (Zeya, 1971; 1975); protein BPI (bacterial permeability inducing factor) tách từ bào tương bạch cầu trung tính bệnh nhân bị bệnh ung thư bạch cầu tuỷ mãn tính Tính chất cũng trình tự amino acid protein xác định công trình Pohl (1990) Morgan (1991) Vào năm 1993-1996 Shafer công bố nghiên cứu khả kháng khuẩn loại peptide tổng hợp hoá học dựa cấu trúc bậc cathepsin G, ông cho biết thêm peptide tổng hợp từ dạng D-amino acid dạng Lamino acid có hoạt tính kháng khuẩn tương đương Bên cạnh việc tách chiết nghiên cứu protein có hoạt tính sinh học tự nhiên tổng hợp hoá học, ngày với kỹ thuật di truyền đại nhà nghiên cứu xây dựng phương pháp để thu nhận peptide có hoạt tính sinh học cao nhằm chăm sóc bảo vệ sức khoẻ cộng đồng Dựa trình tự amino acid xác định từ peptide tách chiết tự nhiên peptide tổng hợp theo phương pháp hoá học, nhà nghiên cứu tổng hợp đoạn oligonucleotide tách nhân gene mã hoá peptide tự nhiên kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction), sau tạo vector tái tổ hợp biến nạp vào tế bào để thu nhận sản phẩm protein tái tổ hợp có hoạt tính mong muốn Mục đích sau tạo chủng sản xuất để thu nhận sản phẩm mức độ pilot Đây phương pháp mới, song cũng có kết đáng khích lệ tiến hành nhiều phòng thí nghiệm giới 21 21 Thành tựu bật lĩnh vực sản xuất protein tái tổ hợp loại vaccine phòng chống viêm gan B, sốt xuất huyết, bệnh đậu mùa v.v cho người nhiều loại vaccine cho động, thực vật Vaccine coi phương thức hữu nghiệm phòng chống làm giảm phần lớn tỷ lệ mắc chết đại dịch rủi ro đưa đến Vì lý khác nhau, quốc gia có cung ứng vaccine từ đầu đại dịch mà thường nhiều tháng sau Nền sản xuất vaccine lớn mang tính chất thương mại muốn có vaccine cũng phải có tới 3-6 tháng sau đại dịch virus bùng nổ Khả sản xuất vaccine cúm tập trung nhiều châu Âu Bắc Mỹ Năng lực sản xuất ước tính 300 triệu liều vaccine ba thành phần năm, khả xa với nhu cầu tăng lên đại dịch Tổ chức y tế giới (WHO), qua mạng lưới đặc biệt phòng thí nghiệm cúm quan sát liên tục diễn biến virus H5N1 từ ca nhiễm người Hong Kong năm 1997 Các phòng thí nghiệm chuẩn bị chủng vaccine nguyên (đầu tiên), chứng minh kỹ nghệ “giống gốc” để phát triển vaccine Các phòng thí nghiệm hướng dẫn việc phân tích cấu trúc phân tử virus, bảo đảm giúp đỡ công việc phát triển vaccine tiến triển Một phần việc quan trọng khám phá đột biến virus năm 2005 Hiện chưa đưa công thức vaccine cúm có hiệu kinh tế việc sử dụng hàm lượng kháng nguyên - thành phần kháng nguyên vaccine kích thích đáp ứng miễn dịch Bởi thử lâm sàng diễn với cách kiểm chứng công thức vaccine khác nhau, kể chất hấp phụ Chất tăng cường đáp ứng miễn dịch, lý thuyết cho phép bảo vệ thích hợp mức hàm lượng kháng nguyên thấp Xu hướng cũng nghiên cứu tiến hành Ở Việt nam ta, thập niên vừa qua tình hình nghiên cứu sản xuất chất protein có hoạt tính sinh học cũng thu kết đáng kể Nhiều công trình nghiên cứu phân lập tách chiết protein có hoạt tính 22 22 sinh học công bố Tuy nhiên, hầu hết công trình chỉ đề cập đến việc điều tra tự nhiên, nghiên cứu cấu trúc, chức ứng dụng, mà chưa đề cập nhiều đến sản xuất loại protein Mặc dù không nhiều cũng có ghi nhận bước đầu việc sản xuất thành công số loại vaccine phòng bệnh viện vệ sinh dịch tễ Trung ương vaccine virus viên gan B (kháng nguyên bề mặt- HbsAg), vaccine phòng viêm não Nhật bản, vaccine virus dại (kháng nguyên G) v.v Năm 2003, kỹ thuật di truyền nhóm tác giả Lê Trần Bình (Viện công nghệ sinh học-TTKH & CNQG) thu nhận loại peptide tái tổ hợp có hoạt tính kháng khuẩn loại protein khác có tên gọi melittin (loại protein có nọc ong dùng để điều trị bệnh nhiễm khuẩn làm tan khối u) Trong năm gần (2011), có nhiều công trình nghiên cứu trọng điểm cấp nhà nước nhằm thu nhận loại protein có hoạt tính sinh học cao sử dụng y học đề tài “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ chuyển gen vào lục lạp tạo thực vật sản xuất protein tái tổ hợp để ứng dụng y dược” nhóm tác giả Nguyễn Thị Thanh cộng (Viện Sinh học nhiệt đới - Viện hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam) thu nhận protein kháng nguyên tái tổ hợp tạo từ biến đổi gen lục lạp làm nguyên liệu để tạo kít chẩn đoán vaccine để phòng bệnh HIV/AIDS người, đề tài “Nghiên cứu công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp phục vụ điều trị bệnh đái tháo đường” nhóm tác giả Phạm Thành Hổ cộng (Trường đại học Khoa học tự nhiên - TP Hồ Chí Minh) xây dựng quy trình công nghệ sản xuất insulin bao gồm đủ bước tạo chủng vi sinh vật tái tổ hợp gen, lên men, thu nhận tiền thân insulin MPI, tái gấp cuộn, xử lý MPI thành insulin, tinh chế insulin đạt mức độ tương đương với insulin thương phẩm chứng minh insulin có hoạt tính chuột bị đái tháo đường bước phát triển vượt bậc mặt khoa học công nghệ Việt Nam 2.3 Một số loại thuốc protein tái tổ hợp y học và định hướng phát triển 2.3.1 Betaseron/Betaferon (Interferon β-1b) 23 23 Một kết công nghệ dược phẩm protein sản xuất interferon β-1b Protein tạo thay cysteine (Cys) cho serine (Ser) gốc thứ 17 phân tử interferon β dài 154 amino acid Protein tổng hợp biểu E coli hoạt tính đặc trưng gần với interferon β tự nhiên có nguồn gốc từ fibroblast, để sử dụng cho việc làm giảm tần số mức độ khốc liệt tái phát bệnh nhân lại có tái phát yếu bệnh đa xơ cứng 2.3.2 Humalog (Lispro Insulin) Humalog dạng biến đổi gen insulin người hai gốc C-terminus chuỗi B, proline (Pro) lysine (Lys) vị trí 28 29 tương ứng, đảo ngược thứ tự chúng Humalog dạng đồng đẳng hoạt động nhanh insulin, thiết kế để bắt chước tốc độ đáp ứng insulin tự nhiên thể thực phẩm Sự biến đổi C-terminus thiết kế dựa sở cấu trúc tương đồng trình tự với nhân tố sinh trưởng giống insulin (insulin-like growth factor 1, IGF-1) việc đảo ngược thứ tự giảm nhị trùng hóa (dimerization) tiểu đơn vị B 2.3.3 Các tá dược vaccine (adjuvants) Gần đây, phương pháp tiếp cận việc thiết kế vaccine giúp cho lĩnh vực y học có phát triển quan trọng Nhiều loại vaccine sản phẩm công nghệ sinh học có giá trị Công nghệ protein sử dụng để xây dựng phân tử protein cung cấp hỗ trợ miễn dịch (adjuvant) để gây đáp ứng miễn dịch kháng nguyên đồng phân phối (co-administered antigen) Các tá dược protein quan tâm đặc biệt nhằm kích thích phản ứng miễn dịch mucosal sau chủng ngừa cách uống (oral immunization) để tránh việc sử dụng phương pháp tiêm phòng vaccine (injection for vaccination) Những vaccine khảo nghiệm tốt độc tố Vibrio cholerae (CT) độc tố không bền nhiệt E coli (LT) Các cấu trúc tinh thể CT LT làm sáng tỏ Các thí nghiệm phát sinh đột biến điểm định hướng dựa cấu trúc LT giúp có hiểu biết đầy đủ mối quan hệ 24 24 tiểu đơn vị A có hoạt tính enzyme đơn với tiểu đơn vị B độc tố heterohexameric này, vị trí liên kết enzyme cofactor tiểu đơn vị A, điểm cắt hoạt động chúng Các nghiên cứu cho phép giải thích độc tố đột biến ổn định để lắp ráp holotoxin, độc tính in vitro chỉ mức tối thiểu giữ lại đặc tính miễn dịch tá dược chúng Ví dụ: đột biến Ser thành Lys gốc 63 tiểu đơn vị A LT ức chế liên kết với độc tính NAD cofactor cho hoạt tính ADP ribosyltransferase Đột biến S63K cho thấy cường độ độc tính giảm sáu lần đặc tính trì khả miễn dịch tá dược Một trường hợp khác, đột biến gốc 192 (arginine-Arg thành glycine-Gly) tiểu đơn vị A LT cũng thực Đột biến xảy vị trí mà tiểu vùng A1 bị phân giải khỏi tiểu vùng A2 bước hoạt động chức enzyme tiểu đơn vị A Đột biến cũng tạo độc tố bất hoạt enzyme để trì đặc tính tá dược Các độc tố đột biến thử nghiệm nghiên cứu lý thuyết lâm sàng để đánh giá lợi ích chúng 2.3.4 Sắp xếp lại vùng (liên kết, trao đổi xóa bỏ) Hầu hết protein lớn vùng cuộn xoắn độc lập nhỏ tạo thành Các vùng thường liên kết với chuỗi peptide ngắn nhiều trường hợp, tất cả, vùng xác định exon phân chia trình tự gen Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử, người ta bổ sung, loại bỏ trao đổi vùng từ protein tới protein khác để xây dựng lại phân tử protein 2.3.5 Các cytokine được dung hợp Các cytokine khác thường có chức chồng chéo hoạt động hợp lực tế bào để gây thay đổi sinh lý tế bào Liên kết cytokine cách dung hợp gen khung (inframe) buộc hai nhóm chức lại với nguyên tắc dẫn đến hiệu sinh học mong muốn liều thấp thực riêng rẽ Các dung hợp kiểu thực trường hợp interferon cách 25 25 thập kỷ Gần PIXY321, dạng dung hợp GM-CSF IL-3 cũng khảo sát Trong trường hợp này, gen GM-CSF IL-3 sửa đổi để loại bỏ vị trí N-glycosylation động vật có vú sau liên kết với nhờ bổ sung đoạn nối gồm 15 amino acid linh hoạt Cterminus GM-CSF N-terminus IL-3 Nấm men biểu PIXY321 cho thấy lực thụ thể tăng cường, hoạt tính sinh sản hoạt tính kích thích tạo khuẩn lạc cũng so sánh với số protein khởi đầu monomer 2.3.6 Các chất chủ vận hormone (hormone agonist) Sự phát triển chất siêu chủ vận (super-agonist) có hoạt tính sinh học tăng lên rõ rệt làm tăng lực liên kết hormone với receptor chúng Grossmann cộng mô tả thiết kế biến thể TSH người (human thyroid-stimulating hormone) có hoạt tính tăng lên 1.300 lần Các biến thể thiết kế dựa tương đồng với hCG (kích dục tố màng đệm người-human chorionic gonadotrophin), loại glycoprotein hormone khác chia sẻ tiểu đơn vị α chung Sự thay nhóm tích điện dương vùng móc (loop region) TSH phối hợp tăng hoạt tính chúng 2.3.7 Thay liên kết đặc hiệu Thay liên kết đặc hiệu thực cách chuyển vùng đặc hiệu cho phối tử từ protein đến protein khác Một số trường hợp đòi hỏi thay đổi nhỏ, số khác đòi hỏi việc chuyển đổi quy mô lớn nhiều gốc Ví dụ tính đặc hiệu hormone prolactin biến đổi cách thay amino acid receptor liên kết bề mặt cho hormone biến đổi liên kết với receptor hormone sinh trưởng Các phân tử protein thường có vùng loop nối kiểu cấu trúc thứ cấp khác (α-helix, β-strand) Trong số trường hợp chức gốc protein loop mục tiêu cho thí nghiệm thay tương đối đơn giản Ví dụ: đặc trưng nhân tố sinh trưởng có tính base 26 26 fibroblast biến đổi thành loại có tính acid cách thay vùng d-loop đặc biệt 27 27 KẾT LUẬN Protein có vai trò vô quan trọng đời sống người Nó thành phần cấu trúc tế bào mô, protein có nhiều chức phong phú khác định đặc điểm sống truyền đạt thông tin di truyền, chuyển hoá chất enzyme, kháng thể chống lại bệnh tật, hormon dẫn truyền tín hiệu tế bào v.v có chất protein Kỹ thuật protein tái tổ hợp hay tạo dòng (cloning) gồm bước: (1) tách chiết tinh DNA gene sinh vật cần tạo dòng, (2) tạo đoạn gene mã hóa cho protein mong muốn in-vitro phản ứng PCR, (3) tạo vector chuyển gene, (4) chuyển gene mong muốn vào tế bào nhận, (5) phát phân lập dòng tế bào nhận có khả sản xuất nhiều protein tái tổ hợp Trong tế bào chủ, đoạn gene tái tổ hợp biểu thành protein tái tổ hợp mong muốn Hiện nay, protein tái tổ hợp sử dụng nhiều y học, mở hướng điều trị hiệu bệnh người, giúp giảm chi phí điều trị nâng cao hiệu phòng điều trị bệnh, nâng cao chất lượng sống 28 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đái Duy Ban, Lữ Thị Cẩm Vân, 1994, “Chuyên đề Công nghệ gen sản xuất vaccine thế hệ mới ứng dụng Y học nông nghiệp hiện đại”, TT KHTN& CN QG, Hà Nội Nguyễn Hữu Chấn, Nguyễn Thị Hà, Nguyễn Nghiêm Luật, Hoàng Bích Ngọc, Vũ Thị Phương, 2001, “Hoá sinh” NXB Y học, Hà Nội Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998, “Sinh học phân tử”, NXB Giáo dục, Hà Nội Nguyễn Hoàng Lộc, 2007, “Nhập môn công nghệ sinh học”, NXB Đại học Huế Cao Đăng Nguyên, Đỗ Quý Hải, 2007, “Công nghệ protein”, NXB Đại học Huế Khuất Hữu Thanh, 2004, “Liệu pháp gen - Nguyên lý ứng dụng”, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Trọng Tuệ, Lê Văn Phủng, Chom Kyu Chong, Lee Sang Oh, 2007, “Nghiên cứu biểu hiện proinsulin người vector pET-28A (+) tế bào Escherichia coli BL21 (DE3)”, Tạp chí nghiên cứu y học, ISSN 0868202X, Tập 47, số 2, tr 11-15 Phạm Thị Kim Trâm, Trần Thị Thuý Hằng, Nguyễn Quốc Bình (2008), “Biểu hiện protein sinh dược (insulin, interferon alpha 2b) Pichia pastoris”, Hội nghị Khoa học toàn quốc lần thứ IV - Hoá sinh sinh học phân tử phục vụ nông, sinh, y học công nghệ thực phẩm, NXB Khoa học kỹ thuật, tr 568-571 Trần Hồng Vân, Nguyễn Trọng Tuệ, Lê Văn Phủng, 2008, “Nghiên cứu số điều kiện tối ưu biểu hiện proinsulin người tái tổ hợp E.Coli BL21 (DE3) với vector pET-28A (+)”, Tạp chí nghiên cứu y học, ISSN 0886-202X, tr.56-61 29 29 Tiếng Anh 10 Bains W ,2003, “Biotechnology from A to Z”, Oxford University Press Inc, New York, USA 11 Coleman WB and Tsongalis GJ , 1997, “Molecular Diagnostics (For The Clinical Laboratorian)”, Humana Press Inc Totowa, New Jersey, USA 12 Cabrita L.D., Bottomley S.P , 2004, “Protein expression and refolding- a practical guide to getting the most out of inclusion bodies”, Biotechnol Annu., Rev 10, pp 31-50 13 Fersht Alan, 1998, “Structure and Mechanism in Protein Science”, W H Freeman, 3rd Rev Edit 14 Jungbauer A., Kaar W , 2007, “Current status of technical protein refolding”, Journal of Biotechnology, 128(3), pp 587-596 15 Klefenz H , 2002, “Industrial Pharmaceutical Biotechnology”, Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, Germany 16 Lehninger A.L, 2004, “Principles of Biochemistry”, 4th Edition W.H Freeman 17 Leon O., Roth M , 2000, “Zinc fingers: DNA binding and protein-protein interactions”, Biological research Biol Res v-33 n.l 18 Liebler Daniel C., 2002, “Introduction to proteomics”, Humana Press Inc Totuwa, New Jersey 19 Marshak DR, Gardner RL and Gottlieb D , 2001, “Stem Cell Biology”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA 20 Microfluidics, 2006, “User Manual”, Model M-110EH-30, Microfluidizer® Processor, Part No.85.0004 21 New England Biolabs Inc., 2005, “Tools for Protein Research”, Ipswich, USA 22 Novagen, 2006, “pET System Manual”, TB055 11th Edition, Rev.B 0403, USA 800-207-0144 23 Pollard JW and Walker JM., 1997, “Basic Cell Culture Protocol”s, Humana Press Inc Totowa, New Jersey, USA 30 30 24 Reseacher’s Asociates, 1996, “Vaccine Handbook”, The national Institue of Health, Tokyo, Japan 25 Ratledge C and Kristiansen B., 2002, “Basic Biotechnology”, Cambridge University Press, UK 26 Shuler ML and Kargi F., 2002, “Bioprocess Engineering-Basic Concepts 2nd ed”, Prentice Hall Inc., New Jersey, USA 27 Vallejo L.F., Rinas U., 2004, “Strategies for the recovery of active proteins through refolding of bacterial inclusion body proteins”, Microb Cell Fact, 3, pp 11 28 Walker JM and Rapley R., 2002, “Molecular Biology and Biotechnology 4th ed”, The Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK 29 Simon Roe, 2001, “Protein purification applications”, AEA Technology plc, Bioprocessing Facility, Oxford OX4 6LY, U.K Địa Website 30 http://www.ivac.com.vn/Default.asx 31 http://123doc.org/document/318920-cac-buoc-san-xuat-enzyme-protease-taito-hop-tu-chung-bacillus-sp-viet-nam-biet-tren-genbank-co-mot-so-trinh-tuma-hoa-cho-protein-cua-mot-so-loai-tro.htm 32 http://123doc.org/document/318921-tinh-che-protein-tai-to-hop-gnrh-tbk-oe-coli.htm 31 31 [...]... nhận được các loại protein có hoạt tính sinh học cao được sử dụng trong y học như đề tài Nghiên cứu ứng dụng công nghệ chuyển gen vào lục lạp tạo ra thực vật sản xuất protein tái tổ hợp để ứng dụng trong y dược” của nhóm tác giả Nguyễn Thị Thanh và cộng sự (Viện Sinh học nhiệt đới - Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam) đã thu nhận được protein kháng nguyên tái tổ hợp được tạo ra từ c y biến đổi... đoạn gene mã hóa cho protein mong muốn in-vitro bằng phản ứng PCR, (3) tạo vector chuyển gene, (4) chuyển gene mong muốn vào tế bào nhận, (5) phát hiện và phân lập các dòng tế bào nhận có khả năng sản xuất nhiều protein tái tổ hợp nhất Trong tế bào chủ, đoạn gene tái tổ hợp sẽ biểu hiện thành protein tái tổ hợp mong muốn Hiện nay, protein tái tổ hợp được sử dụng rất nhiều trong y học, mở ra hướng điều... sinh học phân tử việc tổng hợp protein không còn khó khăn như trước nhờ phương pháp tổng hợp sinh học Mặc dù một số protein có thể tổng hợp bằng con đường hoá học song phương pháp tổng hợp sinh học thể hiện tính tối ưu và thực tiễn cao Thực tế hiện nay phương pháp n y đã được áp dụng rộng rãi không những để tổng hợp một số loại protein làm thuốc như insulin, growth hormon mà còn để tổng hợp rất nhiều hợp. .. (kỹ thuật 2 block) Kỹ thuật sản xuất insulin một bước cũng bằng kỹ thuật tái tổ hợp DNA, gen được gắn vào ở đ y là gen mã hoá proinsulin Sau khi chiết, proinsulin được thuỷ phân bằng protease cắt mạch peptid cho insulin hoạt động Hình 1 Quy trình tổng hợp insulin tái tổ hợp bằng vi khuẩn 18 18 CHƯƠNG 2 NGUYÊN LÝ VÀ ĐỊNH HƯỚNG PHÁT TRIỂN PROTEIN TÁI TỔ HỢP 2.1 Quy trình sản xuất thuốc protein tái. .. phương pháp hoá học, các nhà nghiên cứu đã tổng hợp các đoạn oligonucleotide hoặc tách và nhân các gene mã hoá các peptide tự nhiên bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction), sau đó tạo các vector tái tổ hợp và biến nạp vào các tế bào để thu nhận các sản phẩm protein tái tổ hợp có hoạt tính mong muốn Mục đích sau đó tạo các chủng sản xuất để thu nhận sản phẩm ở mức độ pilot Đ y là phương pháp... khuẩn vào môi trường nuôi c y thích hợp Quần thể vi khuẩn sẽ phát triển nhanh chóng và tổng hợp ra chuỗi polypeptide mà gen mục tiêu đưa vào mã hoá Bằng các kỹ thuật khác nhau ta có thể tách và tinh chế các sản phẩm n y Xử lý chuỗi polypeptide để được protein có hoạt tính mong muốn: Chuỗi polypeptide được tổng hợp xong thường ở dạng pro -protein Dạng n y thường không có hoạt tính sinh học (protein. .. mà nguồn nguyên liệu hạn chế hoặc con đường tổng hợp hoá học gặp khó khăn Các bước cơ bản để tổng hợp một protein theo phương pháp tổng hợp sinh học (synthetic biology) trên tế bào vi khuẩn nhờ plasmid tái tổ hợp được tiến hành như sau: Thiết kế plasmid (vector) tái tổ hợp: Nếu hai loại DNA được xử lý với cùng một enzyme giới hạn thì mỗi DNA sẽ có đầu dính tương hợp nhau và 2 đoạn DNA y sẽ gắn lại... cả, các vùng n y có thể xác định như là các exon phân chia trong trình tự gen Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử, người ta có thể bổ sung, loại bỏ hoặc trao đổi các vùng từ một protein n y tới protein khác để x y dựng lại các phân tử protein 2.3.5 Các cytokine được dung hợp Các cytokine khác nhau thường có các chức năng chồng chéo nhau hoặc có thể hoạt động hợp lực trên cùng tế bào để g y ra... đang ng y càng được sử dụng rộng rãi để làm thuốc như các hormon, enzym trước đ y nguồn nguyên liệu để sản xuất các loại protein n y chủ y u là chiết từ các bộ phận của động vật Tuy nhiên do nhu cầu ng y càng cao trong khi nguồn cung từ động vật rất hạn chế, giá thành lại đắt nên việc tổng hợp protein được đặt ra một cách cấp thiết 15 15 Trong những thập niên gần đ y, với những bước tiến lớn trong công... chục các protein khác như cytocrom, papain v.v Mặc dù từ năm 1953 lần đầu tiên Du Vigneaud tổng hợp được các hormon peptide oxytocin và vasopressin bằng phương pháp hoá học và chỉ 10 năm sau (1963) Trung quốc, 20 20 Mỹ và T y Đức đã tổng hợp được insulin theo mẫu cấu trúc bậc 1 của Sanger đưa ra; 1969 tổng hợp được ribonuclease và 1970 tổng hợp được protein sinh trưởng Từ đó con người bước vào giai