Đang tải... (xem toàn văn)
ĐẶT VẤN ĐỀ Chất lượng an toàn vệ sinh thực phẩm (ATVSTP) có liên quan trực tiếp hàng ngày, thường xuyên, liên tục đến sức khỏe con người, ảnh hưởng lâu dài đến nòi giống. Sử dụng thực phẩm không đảm bảo chất lượng, vệ sinh sẽ dẫn đến các nguy cơ cao gây ngộ độc thực phẩm cấp tính và mạn tính. Không những thế, nó còn ảnh hưởng đến sự phát triển kinh tế, xã hội, an ninh chính trị và quan hệ quốc tế [13]. Theo thống kê của Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa bệnh tật Mỹ thì hàng năm trên thế giới có khoảng 1,3 tỷ người tiêu chảy trong đó có 70% nguyên nhân do sử dụng thực phẩm không an toàn [28]. Tại các nước đang phát triển, mỗi năm có khoảng 1/3 dân số bị các bệnh do thực phẩm gây ra, trong đó bệnh tiêu chảy là thường gặp nhất và gây tử vong khoảng 2,2 triệu người [23]. Ở Việt Nam ngộ độc thực phẩm là m ột vấn đề đang được quan tâm hàng đầu, theo ước tính của bộ Y tế, chỉ riêng năm 2001 đã có 4,2 triệu người bị ngộ độc thực phẩm. Từ năm 2001-2006, cả nước ghi nhận được hơn 560.0000 ca tiêu chảy do ngộ độc thực phẩm, trong đó có 84 ca tử vong. Riêng trong 9 tháng đầu năm 2010 đã ghi nhận được hơn 750.000 ca tiêu chảy và 12 ca tử vong liên quan đến thực phẩm. Tuy nhiên theo các chuyên gia thì số liệu thựcph ải gấp ít nhất 10 lần con số được công bố [6, 16]. Các bệnh liên quan đến thực phẩm hiện nay vẫn là một mối nguy cơ chính tác động đến sức khỏe con người trên thế giới [50]. Trong đó, vi khuẩn E.coli sinh độc tố (Enterotoxigenic- ETEC) là một trong những nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy quan trọng cho trẻ em ở các quốc gia đang phát triển và cho khách du lịch đến những vùng có dịch lưu hành. Thực phẩm và nước bị ô nhiễm là những phương tiện lây truyền chủ yếu của loại vi khuẩn này. Các mẫu xét nghiệm thực phẩm và nước thường có tỷ lệ ô nhiễm cao với ETEC ở vùng có dịch lư u hành [25,43]. Nhiễm trùng do ETEC thường xảy ra vào những mùa nóng, ẩm ướt sẽ là những điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn phát triển trong thực phẩm và nước. ETEC có khả năng sinh độc tố chịu nhiệt (heat stable toxin-ST) và độc tố không chịu nhiệt (heat labile toxin-LT). Độc tố không chịu nhiêt có cấu trúc và chức năng như độc tố tả (cholera toxin). Vì vậy người bị nhiễm độc tố này sẽ bị tiêu chảy cấp tính với mức độ mất nước trầm trọng. Trên thế giới nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và sản xuất thành công protein tái tổ hợp tiểu đơn vị B của độc tố LT của ETEC và s ử dụng protein tái tổ hợp này để thiết kế các bộ sinh phẩm chẩn đoán ETEC gây bệnh bằng kỹ thuật ELISA và latex thu được kết quả tốt [29, 34]. Nguyên lý của kỹ thuật là sử dụng protein tái tổ hợp tiểu đơn vị B của độc tố LT gây miễn dịch tạo kháng thể kháng LT, sau đó sử dụng kháng thể này để phát hiện độc tố LT của ETEC. Với điều ki ện khí hậu nóng ẩm ở Việt Nam và sự thiếu hiểu biết về vệ sinh an toàn thực phẩm của người dân nên ngộ độc thực phẩm do E. Coli sinh độc tố chiếm tỷ lệ không nhỏ. Phương pháp nuôi cấy không thể phát hiện được ETEC trong thực phẩm. Bởi vậy, việc sử dụng kỹ thuật PCR nhằm phát hiện các gen mã hóa độc tố của các chủng ETEC trong thực phẩm đang đượ c quan tâm [29, 34, 38]. Một nghiên cứu ở Việt Nam của Nguyễn Thị Thanh Yến và cộng sự năm 2005 tại viện Dinh dưỡng về ứng dụng kỹ thuật ELISA phát hiện khả năng sinh độc tố LT của ETEC trong các mẫu thực phẩm đã được công bố [21]. Tuy nhiên kỹ thuật này giá thành cao và phức tạp cho nên rất khó áp dụng cho các phòng xét nghiệm thực phẩm ở tuyến cơ sở. Xuất phát từ thực tiễn đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Thiết kế vector và bước đầu biểu hiện protein tiểu đơn vị B độc tố không chịu nhiệt LT của ETEC trên vi khuẩn E.coli”. Đây là bước quan trọng cho nghiên cứu tiếp theo để sản xuất bộ que thử nhanh nhằm chẩn đoán độc tố không chịu nhiệt (LT) của ETEC ở trên một số nhóm thực phẩm. Mục tiêu nghiên cứu: 1. Thi ết kế vector biểu hiện gen mã hóa cho kháng nguyên tái tổ hợp EltB. 2. Biểu hiện và tinh sạch Protein EltB trong tế bào vi khuẩn E.coli BL21.
Bộ giáo dục v đo tạo Bộ y tế Trờng Đại học y h nội Trịnh Thị Quế thiết kế vector v bớc đầu biểu hiện protein tiểu đơn vị B độc tố không chịu nhiệt của etec trên vi khuẩn e.coli luận văn thạc sĩ y học H nội - 2011 Bộ giáo dục v đo tạo Bộ y tế Trờng Đại học y h nội Trịnh Thị Quế thiết kế vector v bớc đầu biểu hiện protein tiểu đơn vị B độc tố không chịu nhiệt của etec trên vi khuẩn e.coli Chuyên ngành : Hoá sinh Mã số : 60.72.04 luận văn thạc sĩ y học Ngời hớng dẫn khoa học: TS. Trần Vân Khánh H nội - 2011 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Trần Vân Khánh - Phó giám đốc Trung tâm nghiên cứu Gen-Protein, người thầy đã dành nhiều thời gian giúp đỡ, tận tình hướng dẫn cho tôi ngày càng trưởng thành hơn trong học tập, nghiên cứu cũng như trong cuộc sống. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS. Tạ Thành Văn- Phó hiệu trưởng trường đại học Y Hà Nội, Giám đốc Trung tâm nghiên cứu Gen- Protein, người thầy đã tận tâm vì học trò, đã dạy cho tôi những kiến thức quý báu và đã tạo điều kiện cho tôi được tham gia thực hiện đề tài:“Nghiên cứu quy trình sản xuất bộ sinh phẩm immunoblotting chẩn đoán độc tố không chịu nhiệt (LT) của E.coli sinh độc tố ở trên một số nhóm thực phẩm” Tôi xin trân trọng cảm ơn: Đảng ủy, Ban Giám hiệu, phòng Đào t ạo Sau đại học trường Đại học Y Hà Nội Đảng ủy, Ban Giám đốc bệnh viện đa khoa tỉnh Hà Nam PGS.TS Nguyễn Thị Hà người đã dành cho tôi những ý kiến vô cùng quý báu để tôi tiến bộ hơn trong học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. Các thầy cô trong Bộ môn Hóa sinh, trường Đại học Y Hà Nội đã cho tôi kiến thức trong quá trình học tập. Tập thể các anh chị trong trung tâm nghiên cứu Gen – Protein trường Đại h ọc Y Hà Nội, đã hướng dẫn, sát cánh bên tôi khi thực hiện luận văn này. Các anh chị khoa xét nghiệm bệnh viện đa khoa tỉnh Hà Nam đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới cha mẹ, chồng con, anh chị em, bạn bè đồng nghiệp đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và làm luận văn. Hà nội, ngày 14 tháng 10 năm 2011. Bs TrÞnh ThÞ QuÕ DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ATVSTP An toàn vệ sinh thực phẩm Compartative ELISA ELISA cạnh tranh DEC Diarrheagenic Escherichia coli (E coli sinh độc tố gây tiêu chảy) E. coli Escherichia coli EAEC Enteroadherent E.coli (E.coli bám dính đường ruột) EHEC Enterohemorrhagic E.coli (E.coli gây chảy máu đường ruột) EIEC Enteroinvasive E.coli (E.coli xâm nhập đường ruột) ELISA Enzym Linked Immuno Sorbent Assay (kỹ thuật miễn dịch gắn enzym) EltB Escherichia coli Heat Labile Toxin B (tiểu đơn vị B độc tố không chịu nhiệt của E.coli) EPEC Enteropathogenic E. col (E. coli gây bệnh) ETEC Enterotoxigenic Escherichia coli (E.coli sinh độc tố ruột) LT Heat Labile Toxin (Độc tố không chịu nhiệt) PBS Phosphate Buffer Saline-natri (Dung dịch đệm phosphat) PCR Polymerase Chain Reaction Sandwich ELISA ELISA kẹp chả ST Heat Stable Toxin (Độc tố chịu nhiệt) Stx Shiga toxin producing MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 11 Chương 1: TỔNG QUAN 13 1.1. Tình hình vệ sinh an toàn thực phẩm 13 1.1.1. Trên thế giới 13 1.1.2. Ở Việt Nam 14 1.2. Ngộ độc thực phẩm do Escherichia coli 15 1.2.1. Vài nét về E.coli 15 1.2.2. Phân loại 17 1.2.3. Đặc điểm sinh học 18 1.2.4. Khả năng gây bệnh ở đường tiêu hóa 19 1.3. Ngộ độc thực phẩm do ETEC 23 1.3.1. Trên thế giới 23 1.3.2. Việt Nam 23 1.3.3. Bệnh cảnh lâm sàng và dịch tễ học của ngộ độ c thực phẩm do ETEC 24 1.4. Các phương pháp xác định E.coli 25 1.4.1. Phương pháp định danh kinh điển 25 1.4.2. Thử nghiệm tạo váng và gây ngưng kết hồng cầu 26 1.4.3. Phương pháp thử nghiệm trên động vật thực nghiệm 26 1.4.4. Phương pháp miễn dịch học 27 1.4.5. Phương pháp nuôi cấy trên tế bào 30 1.4.6. Kỹ thuật sinh học phân tử 31 1.4.7. Kỹ thuật sắc ký miễn dịch: 36 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37 2.1. Đố i tượng nghiên cứu 37 2.1.1. Chủng vi khuẩn và plasmid 37 2.1.2. Hóa chất, máy móc và thiết bị 37 2.1.3. Môi trường và đệm 39 2.1.4. Cặp mồi sử dụng 40 2.2. Phương pháp nghiên cứu 41 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu 41 2.2.2. Các phương pháp tiến hành nghiên cứu 41 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 53 3.1. Khuyếch đại đoạn gen biến nạp EltB bằng kỹ thuật PCR 53 3.2. Nuôi cấy và tinh sạch plasmid pGEX và cắt bằng enzym giới hạn 53 3.3. Cắt đoạn gen EltB bằng các enzym giới hạn 54 3.4. Nối đoạn gen EltB vào vector pGEX 55 3.4.1. Kiểm tra đoạn gen biến nạp bằng kỹ thuật PCR 55 3.4.2. Kiểm tra đoạn gen biến nạp bằng kỹ thuật cắ t enzym giới hạn 56 3.4.3. Kiểm tra đoạn gen biến nạp bằng giải trình tự gen 56 3.5. Biểu hiện protein tái tổ hợp EltB 58 3.5.1. Biến nạp plasmid pGEX-EltB vào tế bào biểu hiện protein E.coli BL21 58 3.5.2. Biểu hiện protein tái tổ hợp EltB 59 3.5.3. Kiểm tra protein EltB bằng Western blot 60 Chương 4: BÀN LUẬN 61 4.1. Khuyếch đại đoạn gen biến nạp EltB bằng kỹ thuật PCR 61 4.1.1. Thiết kế mồi 61 4.1.2. Tách chiết DNA khuôn mẫu từ ch ủng ETEC 62 4.1.3. Thực hiện phản ứng PCR 62 4.2. Nuôi cấy và tinh sạch plasmid pGEX 62 4.2.1. Lựa chọn vector tách dòng 62 4.2.2. Biến nạp đoạn gen EltB vào vector pGEX 63 4.3. Biểu hiện Protein tái tổ hợp EltB 64 4.3.1. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E.coli khả biến bằng sốc nhiệt 64 4.3.2. Kiểm tra sự biểu hiện của protein tái tổ hợp EltB 66 4.4. Kiểm tra mức độ biểu hiện protein EltB bằng Western blot 66 KẾT LUẬ N 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Hình ảnh E.coli trên kính hiển vi điện tử 16 Hình 1.2. Khuẩn lạc E.coli trên môi trường thạch Endo và Mac-conkey 16 Hình 1.3. Các bước trong Sandwich ELISA. 29 Hình 2.1. Sơ đồ các bước tiến hành nghiên cứu 41 Hình 2.2. Sơ đồ biến nạp EltB vào vector biểu hiện pGEX 44 Hình 3.1. Hình ảnh PCR khuếch đại gen EltB. 53 Hình 3.2. Hình ảnh plasmid pGEX sau khi đã được tinh sạch và cắt bằng enzym 54 Hình 3.3. Kiểm tra đoạn gen EltB sau cắt bằng enzym 54 Hình 3.4. Kiểm tra đoạn gen EltB sau khi biến nạp vào vector pGEX-13X bằng kỹ thuật PCR 55 Hình 3.5. Sản phẩm kiểm tra đoạn gen biến nạp bằng enzym cắt giới hạn 56 Hình 3.6. Hình ảnh giải trình tự gen của đoạn gen biến nạp EltB 57 Hình 3.7. Sản phẩm kiểm tra biến nạp bằng kỹ thuật PCR 58 Hình 3.8. Protein tái tổ hợp từ vi khuẩn E. coli BL21 mang vector pGEX-LtB. . 59 Hình 3.9. Kiểm tra chất lượng protein EltB tái tổ hợp bằng kỹ thuật western blotting 60 [...]... động của độc tố ruột không chịu nhiệt LT (Heat Labile Toxin) và < /b> độc tố ruột chịu nhiệt ST (Heat Stable Toxin) Một chủng E.coli có thể chỉ có LT, chỉ có ST hoặc cả 2 loại độc tố này ◘ Độc tố không chịu nhiệt LT LT là một protein < /b> có tính kháng nguyên mạnh, mang tính chất của một ngoại độc tố Cấu trúc và < /b> chức năng gần giống với độc tố của vi khuẩn tả (cholera toxin) Có 2 loại độc đố LT là LT I và < /b> LT II,... A và < /b> 11,5 kDa 5 tiểu < /b> đơn < /b> vị < /b> B (LTB) Khả năng b m dính của tiểu < /b> đơn < /b> vị < /b> B vào thụ thể GM1 trên niêm mạc ruột non sẽ cho phép độc tố này xâm nhập vào b n trong của tế b o niêm mạc ruột Tiểu < /b> đơn < /b> vị < /b> A mang hoạt tính enzym gồm 2 peptid A1 và < /b> A2 nối với nhau b i cầu nối disulfide [32, 42, 46] Cơ chế gây tiêu chảy của LT: Sau khi 5 tiểu < /b> đơn < /b> vị < /b> B giúp độc tố b m vào tế b o biểu < /b> mô ruột thì phần A được đẩy vào... hợp tiểu < /b> đơn < /b> vị < /b> B của độc tố LT của ETEC và < /b> sử dụng protein < /b> tái tổ hợp này để thiết < /b> kế < /b> các b sinh phẩm chẩn đoán ETEC gây b nh b ng kỹ thuật ELISA và < /b> latex thu được kết quả tốt [29, 34] Nguyên lý của kỹ thuật là sử dụng protein < /b> tái tổ hợp tiểu < /b> đơn < /b> vị < /b> B của độc tố LT gây miễn dịch tạo kháng thể kháng LT, sau đó sử dụng kháng thể này để phát hiện < /b> độc tố LT của ETEC Với điều kiện khí hậu nóng ẩm ở Vi t... độc tố không chịu nhiệt LT của ETEC trên vi khuẩn E.coli Đây là b ớc < /b> quan trọng cho nghiên cứu tiếp theo để sản xuất b que thử nhanh nhằm chẩn đoán độc tố không chịu nhiệt (LT) của ETEC ở trên một số nhóm thực phẩm Mục tiêu nghiên cứu: 1 Thiết < /b> kế < /b> vector < /b> biểu < /b> hiện < /b> gen mã hóa cho kháng nguyên tái tổ hợp EltB 2 Biểu < /b> hiện < /b> và < /b> tinh sạch Protein < /b> EltB trong tế b o vi khuẩn E.coli BL21 13 Chương 1 TỔNG... nhanh phát hiện < /b> kháng nguyên b mặt (HbsAg) của vius vi m gan B, hay que thử nhanh để phát hiện < /b> V cholerae O1 và < /b> O139 trong các mẫu b nh phẩm lâm sàng (Crystal Vc, dipstick)… Ở nghiên cứu của chúng tôi vi c thiết < /b> kế < /b> vector < /b> biểu < /b> hiện < /b> để sản xuất protein < /b> tái tổ hợp độc tố EltB của ETTEC là một trong những b ớc < /b> đi đầu < /b> tiên cho nghiên cứu tiếp theo nhằm chế tạo que thử nhanh phát hiện < /b> độc tố LT của ETEC trong... vi khuẩn phát triển trong thực phẩm và < /b> nước ETEC có khả năng sinh độc tố chịu nhiệt (heat 12 stable toxin-ST) và < /b> độc tố không chịu nhiệt (heat labile toxin -LT) Độc tố không chịu nhiêt có cấu trúc và < /b> chức năng như độc tố tả (cholera toxin) Vì vậy người b nhiễm độc tố này sẽ b tiêu chảy cấp tính với mức độ mất nước trầm trọng Trên thế giới nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và < /b> sản xuất thành công protein.< /b> .. tại vi n Dinh dưỡng về ứng dụng kỹ thuật ELISA phát hiện < /b> khả năng sinh độc tố LT của ETEC trong các mẫu thực phẩm đã được công b [21] Tuy nhiên kỹ thuật này giá thành cao và < /b> phức tạp cho nên rất khó áp dụng cho các phòng xét nghiệm thực phẩm ở tuyến cơ sở Xuất phát từ thực tiễn đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: Thiết < /b> kế < /b> vector < /b> và < /b> b ớc < /b> đầu < /b> biểu < /b> hiện < /b> protein < /b> tiểu < /b> đơn < /b> vị < /b> B độc tố không chịu nhiệt. .. trong vi c cải tạo sinh giới và < /b> b n thân mình Đã có những nỗ lực rất lớn được đầu < /b> tư nhằm nghiên cứu và < /b> ứng dụng protein < /b> tái tổ hợp tiểu < /b> đơn < /b> vị < /b> B độc tố không chịu nhiệt LT của E.Coli (rLTB) Một số nghiên cứu tập trung sản xuất rLTB thông qua hệ biểu < /b> hiện < /b> của tế b o Eukaryotic như nấm men, hệ thuốc lá chuyển gen và < /b> thực vật ăn được… nhưng thuận tiện và < /b> hiệu quả hơn cả là hệ E.coli 33 E coli chính là... chúng không có phản ứng miễn dịch chéo với nhau Độc tố LT I thường sinh ra ở các chủng ETEC gây b nh cho người và < /b> động vật Còn độc tố LT II hiếm khi được phát hiện < /b> trên các chủng ETEC phân lập được ở trên người Tuy nhiên độc đố LT II không liên quan đến b nh trên cả người và < /b> động vật Do vậy, thuật ngữ LT dùng để ám chỉ LT I 21 LT là độc tố có trọng lượng phân tử thấp 86 kDa, bao gồm 28 kDa tiểu < /b> đơn < /b> vị.< /b> .. nhất để biểu < /b> hiện < /b> protein < /b> tái tổ hợp invitro Tuy nhiên khó khăn chính là vi c giữ được hoạt tính của các protein < /b> sau khi biểu < /b> hiện < /b> b i E.Coli Có rất nhiều hệ vector < /b> được sử dụng cho tách dòng và < /b> biểu < /b> hiện < /b> protein < /b> tái tổ hợp b i E.coli như TA vector,< /b> pDriver vector,< /b> Teasy vector,< /b> pET vector < /b> * Vector < /b> tách dòng Vector < /b> tách dòng là một phân tử DNA có kích thước nhỏ cho phép cài một đoạn DNA ngoại lai vào . độc tố không chịu nhiệt của E. coli) EPEC Enteropathogenic E. col (E. coli gây b nh) ETEC Enterotoxigenic Escherichia coli (E. coli sinh độc tố ruột) LT Heat Labile Toxin (Độc tố không chịu. giải trình tự gen 56 3.5. Biểu hiện protein tái tổ hợp EltB 58 3.5.1. Biến nạp plasmid pGEX-EltB vào tế b o biểu hiện protein E. coli BL21 58 3.5.2. Biểu hiện protein tái tổ hợp EltB 59 3.5.3 - EHEC ( Enterohemorrhagic E. coli) : E. coli gây chảy máu đường ruột - ETEC (Enterotoxigenic E. coli) : E. coli sinh độc tố ruột - EIEC (Enteroinvasive E. coli) : E. coli xâm nhập đường ruột - EAEC