Đề tài (y học) thiết kế và biểu hiện protein tiểu đơn vị b độc tố không chịu nhiệt LT của ETEC và sản xuất kháng thể đa dòng kháng LT trên quy mô phỏng thí nghiệm

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Chất lượng ATVSTP có liên quan trực tiếp hàng ngày, thường xuyên, liên tục đến sức khỏe người, ảnh hưởng lâu dài đến nòi giống dân téc Sử dụng thực phẩm không đảm bảo chất lượng, vệ sinh dẫn đến ngộ độc cấp tính, ngộ độc mạn tính, bệnh truyền qua thực phẩm Chất độc tính lũy thể gây ảnh hưởng đến sức khỏe lâu dài, giảm khả lao động, gây bệnh mạn tính, rối loạn chuyển hóa gây ung thư Khơng thế, cịn ảnh hưởng đến phát triển kinh tế, xã hội, an ninh trị quan hệ quốc tế [13] Theo thống kê Trung tâm kiểm sốt phịng ngõa bệnh tật Mỹ hàng năm giới có khoảng 1,3 tỷ người tiêu chảy có 70% nguyên nhân sử dụng thực phẩm không an toàn [26] Tại nước phát triển, năm có khoảng 1/3 dân số bị bệnh thực phẩm gây ra, bệnh tiêu chảy thường gặp gây tử vong khoảng 2,2 triệu người [22] Ở Việt Nam ngộ độc thực phẩm vấn đề quan tâm hàng đầu, theo ước tính Y tế, riêng năm 2001 cú 4,2 triệu người bị ngộ độc thực phẩm Từ năm 2001-2006, nước ghi nhận 5600000 ca tiêu chảy ngộ độc thực phẩm, có 84 ca tử vong Riêng tháng đầu năm ngoái ghi nhận 750.000 ca tiêu chảy có 12 ca tử vong Thực tế theo chuyên gia phải gấp 10 lần số công bố [10].[20] Các bệnh liên quan đến thực phẩm mối nguy tác động đến sức khoẻ người giới (Wood CS 1983) Trong đó, vi khuẩn E.coli sinh độc tố (ETEC) nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy quan trọng cho trẻ em quốc gia phát triển cho khách du lịch đến vựng cú dịch lưu hành Thực phẩm nước bị ô nhiễm phương tiện lây truyền chủ yếu loại vi khuẩn Các mẫu xét nghiệm thực phẩm nước thường có tỷ lệ ô nhiễm cao với ETEC vựng cú dịch lưu hành (Black CS, 1981,1982; Ryder CS, 1976) Nhiễm trùng ETEC thường xảy vào mùa nóng, ẩm ướt điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn phát triển thực phẩm nước ETEC có khả sinh độc tố chịu nhiệt ST độc tố không chịu nhiệt LT Độc tố không chịu nhiờt cú cấu trúc chức độc tố tả (cholerae toxin) Vì người bị nhiễm độc tố bị tiêu chảy cấp tính với mức độ nước trầm trọng Trên giới nhiều nhà khoa học nhiờn cứu sản xuất thành cơng protein tái tổ hợp tiểu đơn vị B độc tố LT ETEC sử dụng protein tái tổ hợp để thiết kế sinh phẩm chẩn đoán ETEC gây bệnh kỹ thuật ELSA latex thu kết tốt (Cryan B,1990; Oto CS,1983) Nguyên lý kỹ thuật sử dụng protein tái tổ hợp tiểu đơn vị B độc tố LT gây miễn dịch tạo kháng thể kháng LT sau sử dụng kháng thể để phát độc tố LT ETEC Tuy nhiên giá thành sản phẩm cao chưa đáp ứng với điều kiện kinh tế nước ta Ở Việt Nam, chi phí điều trị cho bệnh liên quan đến thực phẩm nguyên vi khuẩn gây nên đắt Tuy nhiên chưa có thống kê rõ ràng nguyên gây vụ ngộ độc thực phẩm nên khó phịng chống Ở Việt Nam, chi phí điều trị cho bệnh liên quan đến thực phẩm nguyên vi khuẩn gây nên đắt Tuy nhiên chưa có thống kê rõ ràng nguyên gây vụ ngộ độc thực phẩm nên khó phịng chống Với điều kiện khí hậu nóng ẩm Việt Nam thiếu hiểu biết vệ sinh an toàn thực phẩm người dân nên ngộ độc thực phẩm E Coli sinh độc tố (ETEC) chiếm tỷ lệ không nhỏ Phương pháp nuôi cấy phát ETEC thực phẩm mà phải phát có mặt độc tố ETEC thực phẩm kỹ thuật ELISA hay latex nhằm phát gen mã hóa độc tố chủng ETEC thực phẩm Cho đến có nghiên cứu Việt Nam tác giả Nguyễn Thị Thanh Yến CS năn 2005 viện dinh dưỡng ứng dụng kỹ thuật ELISA để phát khả sinh độc tố LT ETEC mẫu thực phẩm Tuy nhiên kỹ thuật giá thành cịn cao phức tạp khó áp dụng cho phong xét nghiệm thực phẩm tuyến tỉnh Xuất phát từ thực tiễn chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Thiết kế biểu protein tiểu đơn vị B độc tố không chịu nhiệt LT ETEC sản xuất kháng thể đa dịng kháng LT quy mơ thí nghiệm” Đây bước quan trọng cho nghiên cứu nhằm mục đích sản xuất sinh phẩm chẩn đốn độc tố không chịu nhiệt (LT) ETEC số nhóm thực phẩm Mục tiêu nghiên cứu: Thiết kế vector biểu gen mã hóa cho kháng nguyên tái tổ hợp EltB biến nạp vào tế bào khả biến DH5α Biểu tinh Protein EltB tế bào vi khuẩn E.coli BL21 Sản xuất kháng thể kháng LT thỏ quy mơ phịng thí nghiệm Chương TỔNG QUAN 1.1.Tình hình vệ sinh an tồn thực phẩm 1.1.1.Trên giới Theo thống kê Trung tâm kiểm sốt phịng ngõa bệnh tật Mỹ hàng năm giới có khoảng 1,3 tỷ người tiêu chảy có 70% nguyên nhân sử dụng thực phẩm không an toàn [26] Tại nước phát triển, năm có khoảng 1/3 dân số bị bệnh thực phẩm gây ra, bệnh tiêu chảy thường gặp gây tử vong khoảng 2,2 triệu người [22] Tại Úc, ngày có khoảng 11.500 người bị ngộ độc thực phẩm Ở Mỹ hàng năm ước đoán có khoảng đến triệu người bị mắc bệnh nguyên nhân ăn uống 9000 trường hợp tử vong [12].[48] Một nghiên cứu khác bệnh từ thực phẩm bị ô nhiễm VSV gây bệnh New-York Mỹ, phát có gia tăng gấp lần từ 1980 đến 1990 [6] Ở Trung Quốc năm 1998 có 292.000 người bị ngộ độc thực phẩm virus viêm gan A làm tử vong người Năm 1999 xảy 591 vụ ngộ độc thực phẩm với 17.971 người mắc, chết 108 người Nguyên nhân thực phẩm bị ô nhiễm VSV 8.505 trường hợp, hóa chất 9.506 trường hợp, thực vật hặc động vật có chất độc 2.719 trường hợp Phần lớn trường hợp ngộ độc xảy căng tin 7.529 trường hợp[2] Một thống kê 10 năm xác định yếu tố nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm Trung Quốc cho thấy 93,24 % nguyên nhân vi sinh vật, có 6,76% yếu tố hóa học [23] Ngộ độc thực phẩm VSV ngày gia tăng quốc gia phát triển quốc gia phát triển, đăc biệt E.coli Ở Nhật Bản năm 1996 có khoảng 800 người bị nhễm bệnh Enterohaemorrhagie E.coli [3] 1.1.2 Ở Việt Nam Tình trạng ô nhiễm thực phẩm diễn phổ biến nước, chủ yếu ô nhiễm mầm bệnh sinh học hóa chất [10] Tại Hà Nội, tỷ lệ thức ăn đường phố ô nhiễm vi khuẩn cao (46,7%) [10] Điều tra thành phố Hồ Chí Minh cho thấy, 100% mẫu thực phẩm kiểm tra: bánh mì, thịt nguội, thịt quay dưa muối khơng đảm bảo vệ sinh thực phẩm mặt vi sinh [3] Tại Hải Phịng có 76,4% thực phẩm khơng đạt tiêu chuẩn vệ sinh, tỷ lệ khơng đạt vệ sinh thức ăn đường phố 92,9% Có tới 85% mẫu thực phẩm ăn chợ không đạt tiêu chuẩn vi sinh, với số lượng vi khuẩn có thực phẩm vượt mức cho phép nhiều lần, kể vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm [20] Khơng thành phố lớn, tình trạng nhiễm vi sinh vật gây bệnh thực phẩm diễn phổ biến nhiều địa phương khác nước [10] Cùng với tình trạng nhiễm thực phẩm, ngộ độc thực phẩm Việt Nam xảy thường xuyên Theo thống kê chưa đầy đủ Cục ATVSTP, từ năm 2000 đến năm 2007, trung bình năm có khoảng 181 vơ ngộ độc thực phẩm xảy với khoảng 5.211 người mắc khoảng 48 ca tử vong Tỷ lệ mắc ngộ độc thực phẩm trung bình 6,05/100.000 dân, tỷ lệ chết 0,06/100.000 dân/năm Tuy nhiên, thực tế, chưa có hệ thống giám sát đến sở, việc thống kê báo cáo chưa thiết lập nên số ca ngộ độc thực phẩm thực tế hàng năm cịn cao nhiều Theo ước tính WHO, ngộ độc thực phẩm hàng năm Việt Nam khoảng triệu ca Ngồi tình trạng ngộ độc thực phẩm cấp tính, ngộ độc thực phẩm mạn tính diễn phức tạp Ngộ độc thực phẩm mạn tính thường Ýt biểu lâm sàng thường khơng dội ngộ độc cấp tính Tuy nhiên, hậu ngộ độc thực phẩm mạn tính cịn nguy hiểm nhiều, dẫn đến hệ lụy cho sức khỏe cộng đồng Riêng quý IV năm 2010, nước xảy 18 vụ ngộ độc làm người tử vong, có vụ ngộ độc lớn từ 30 người trở lên Số người bị ngộ độc 323 người với 242 người nhập viện Nguyên nhân vi sinh (gồm nhóm vi khuẩn Salmonella, Streptoccocus, E.Coli Staphylococcus); độc tố tự nhiên hóa chất Có 5/18 vụ ngộ độc khơng xác định nguyên nhân không lấy mẫu thực phẩm lưu sở Mới nhất, ngày 30/12, có 461 công nhân thuộc công ty địa bàn quận 12 huyện Húc Mụn, TP.HCM phải nhập viện cấp cứu ngộ độc thực phẩm (Dinh dưỡng com.vn) 1.2.Ngộ độc thực phẩm E.coli 1.2.1 Vài nét E.coli E.coli Eschirich phân lập từ phân người năm 1885 E.coli ký sinh bình thường đại tràng người số động vật Sau trẻ đời khoảng 3h, người ta thấy E.coli đại tràng từ sống suốt đời với thể vật chủ E.coli góp phần tiêu hóa thức ăn, phân giải muối mật, sản xuất số sinh tố, giữ thăng vi khuẩn chí ruột Trong số vi khuẩn hiếu khí đại tràng, E.coli chiếm 80% Một số hình ảnh E.coli Hình Hình ảnh E.coli kính hiển vi điện tử Hình 2: khuẩn lạc E.coli môi trường thạch Endo 1.2.2 Phân loại Có nhiều cách phân chia lồi E.coli cách phân loại theo type huyết hay dùng Cách phân loại dựa cấu trúc kháng nguyên khác cú trờn bề mặt tế bào vi khuẩn - Kháng nguyên O định kháng nguyên quan trọng Bản chất lipopolisaccharide nằm trờn vỏch tế bào vi khuẩn Có 171 loại kháng nguyên O xác định, số số chỳng cú phản ứng chéo với vi khuẩn khác [34].[44] - Kháng nguyên K kháng nguyên bề mặt Kháng nguyên K nằm bên kháng nguyên O Người ta xác định khoảng 80 loại kháng nguyên K khác [14].[34] - Kháng nguyên H kháng nguyên lụng cú chất hóa học protein Có 56 loại kháng ngun lơng khác [14].[34] Dựa kháng nguyên O, K H người ta phân biệt 700 type huyết khác E.coli Phân loại dựa vào ly giải phage đặc hiệu có khoảng 50 type phage Phân loại dựa vào tính chất gây bệnh chia làm loại [21] - EPEC (Enteropathogenic E.coli): E.coli gây bệnh đường ruột - EHEC ( Enterohemorrhagic E.coli): E.coli gây chảy máu đường ruột - ETEC (Enterotoxigenic E.coli): E.coli sinh độc tố ruột - EIEC (Enteroinvasive E.coli): E.coli xâm nhập đường ruột - EAEC Enteroadherent E.coli) E.coli bám dính đường ruột 1.2.3 Đặc điểm sinh học 1.2.3.1 Hình thái học - E.coli trực khuẩn kích thước trung bình 1-3àx 0,5àm, đứng riêng rẽ thành đôi Trong điều kiện khơng thích hợp (ví dụ: mơi trường có kháng sinh), vi khuẩn dài sợi - Bắt mầu Gram (-) - Di động hệ thống lông xung quanh thân không di động - Có thể có vỏ 1.2.3.2 Tính chất ni cấy - Là loại hiếu khí hay hiếu kỵ khí tùy tiện - Nhiệt độ thích hợp 37 oC mọc 40 oC, sống nhiệt đô 5-40o C - pH 7,4 - E.coli phát triển dễ dàng môi trường nuôi cấy thông thường, số phát triển mơi trường tổng hợp nghèo chất dinh dưỡng - Ở điều kiện thích hợp, E.coli phát triển nhanh, thời gian phân chia thành hệ khoảng 20 đến 30 phút - Trong môi trường lỏng (như canh thang) sau 3-4h E.coli làm đục nhẹ môi trường, sau 24h làm đục Những ngày sau, đáy ống có cặn - Trên mơi trường đặc sau khoảng 8-10h, dùng kính lúp thấy khuẩn lạc Sau 24h đường kính khuẩn lạc khoảng 1,5mm, hình thái khuẩn lạc điển hình dạng S: trịn, lồi, ướt, màu xám, bề mặt sáng bóng, bờ đều, gặp dạng M dạng R - Trên môi trường thạch dinh dưỡng NA tạo khúm trũn ướt (dạng S) màu trắng đục Để lâu khóm trở nên khơ nhăn (dạng R) Kích thước khóm 23mm - Trên thạch mỏu: Cú chủng dung huyết β, có chủng khơng dung huyết α - Trên mơi trường chẩn đốn chuyên biệt EMB (Eozin Methyl Blue) tạo khúm tớm ánh kim - Trên môi trường Rapid’ E.coli tạo khuẩn lạc màu tím.- Trên mơi trường Macconkey, Endo, SS tạo khóm hồng đỏ.- Trờn cỏc môi trường đường: Lên men sinh lactose, glucose, galactose Lên men không saccarose không lên men dextrin, glycogen - Trên môi trường Macconkey, Endo, SS tạo khóm hồng đỏ 10 - Trên môi trường đường: Lên men sinh lactose, glucose, galactose Lên men không saccarose không lên men dextrin, glycogen 1.2.3.3 Tính chất sinh vật hóa học - Phản ứng oxydase(-), Citrat Simmons(-) - Lên men glucose (+), Lên men sorbitol (-), Lên men lactose(+/-) - Phản ứng RM (+), Phản ứng VP (-), Urease (-), Indole (+), H 2S (-), Sinh (+), Lysine decarboxylase (+), Arginine dihydrolase (+), Ornithin decarboxylase (+), ONPG (+) 1.2.4 Khả gây bệnh đường tiêu hóa E.coli vi khuẩn gây bệnh hội Hiện người ta xác định loại E.coli có khả gây tiêu chảy: ETEC , EPEC , EHEC, EIEC, EAEC ♦ ETEC Để gây bệnh tiêu chảy, E.coli đòi hỏi phải có hai yếu tố độc lực là: + Khả bám cư ngụ niêm mạc ruột + Khả sản sinh độc tố Các yếu tố bỏm dớnh: - Khả bám cư ngụ ETEC vào tế bào màng nhầy biểu mô ruột non điều kiện quan trọng trình gây bệnh Quá trình thực qua số yếu tố trung gian gọi CFA (Colonization Factor Antigen “yếu tố kháng nguyên cư ngụ”) yếu tố kháng nguyên bề mặt E.coli (E.coli surface antigen) Các CFA có chất protein chúng có tính kháng ngun ngun mạnh, có khả gây ngưng kết hồng cầu số loài khác [36].[38].[46] - Cho đến người ta phát số loại CFA khác CFA I, CFA II, CFA III, CFA IV CFAII mô tả yếu tố kháng 38 - Các mẫu huyết thỏ thu thập vào ngày 0, 13, 27 41 đợt gây miễn dịch Kiểm tra hiệu giá kháng thể kỹ thuật ELISA o Phiến ELISA đáy gắn kháng nguyên LTB nồng độ 0,5àg/giếng dung dich PBS 1X, pH7,2 qua đem nhiệt độ phịng thí nghiệm o Rửa lần X3 phút dung dịch PBS 1X (0,05% tween) o Phủ dung dung dịch BSA 2% PBS 1X 370C o Rửa lần X3 phút dung dịch PBS 1X (0,05% tween) o Pha loãng huyết thỏ vào giếng nồng độ pha loãng 1/40; 1/80; 1/160; 1/320… dung dịch PBS có 1% BSA Ủ 370C o Rửa lần X3 phút dung dịch PBS 1X (0,05% tween) o Nhỏ kháng thể kháng IgG thỏ gắn Enzyme (conjugate) Ủ 37 0C o Rửa lần X3 phút dung dịch PBS 1X (0,05% tween) o Cho chất phát triển màu (Subtrate) 10-15 phút o Dừng phản ứng Dung dịch H2SO4 2M: 50àl/giếng o Đọc kết máy đọc ELISA bước sóng 450nm o Tính hiệu giá đáp ứng kháng thể thỏ băng phầm mềm EXEL Thu hoạch kháng thể 39 Tuần thứ (ngày thứ 42) kể từ đợt miễn dịch thỏ lấy máu thu hoạch kháng huyết theo qui trình đây: + Hai ngày trước lấy máu thỏ uống nước (không ăn) nhằm hạn chế thành phần prụtein khỏc huyết thanh, lipit… + Lấy máu động mạch cổ dụng cụ lấy máu vô trùng váo cỏc ống Falcon 50 ml + Để tủ lạnh 40C vòng + Ly tâm máu 2500 vũng/ phỳt X phút Sau chắt huyết + Huyết ly tâm tiếp 10.000 vũng/ phỳt X 20 phút để loại bỏ cặn + Bất hoạt bổ thể nhiệt độ 560C vòng + Cho thêm NaN3 vào huyết đạt nồng độ 0,001% + Đóng ống 1ml giữ nhiệt độ -200C Tinh kháng thể đa dòng - Tinh kháng thể : Kháng thể đa dòng tinh kít tinh kháng thể Protein G (SIGMA) - Đo nồng độ kháng thể sau tinh sạch: Đo nồng độ kháng thể sau tinh kít đo nồng độ protein (promega) 40 CHƯƠNG DỰ KIẾN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Thiết kế biểu thành công protein tiểu đơn vị B độc tố không chịu nhiệt LT ETEC quy mô phịng thí nghiệm Sản xuất kháng thể kháng protein tái tổ hơp EltB quy mơ phịng thí nghiệm Sản xuất kháng thể kháng LT quy mô phịng thí nghiệm 41 CHƯƠNG DỰ KIẾN BÀN LUẬN VÀ KẾT LUẬN - Bàn luận dựa vào kết thu - Kết luận dựa vào mục tiêu nghiên cứu 42 DỰ TRÙ KINH PHÍ Kinh phí trích từ đề tài “Nghiên cứu quy trình sản xuất sinh phẩm immunoblotting chẩn đốn độc tố khơng chịu nhiệt (LT) E.coli sinh độc tố số nhóm thực phẩm” Đề tài tài trợ kinh phí từ ngân sách Sự nghiệp Khoa học 43 KẾ HOẠCH TIẾN HÀNH VÀ NƠI THỰC HIỆN ĐỀ TÀI - Đề tài tiến hành từ tháng năm 2011 đến tháng 10 năm 2011 - Địa điểm nghiên cứu: Labo Trung tâm mơn Hóa sinh Trường Đại học Y Hà Nội TÀI LIỆU THAM KHẢO I TIẾNG VIỆT Alf.A.Lindberg, (1998) Những tiến miễn dịch dự phòng bệnh nhiễm khuẩn đường ruột Hội thảo bệnh nhiễm khuẩn đường ruột đường thở- Hà Nội 18-21/3/1998: pp 60-64 Đặng Oanh(2002) Tình hình hoạt động mục tiêu đảm bảo chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm tháng đầu năm 2001, Tạp chí Y học dự phòng Tõy Nguyờn, số 20, tr 17-19 Đinh Thị Bích Hằng.(2002) Tìm hiểu tình trạng nhiễm vi khuẩn số loại thức ăn đường phố phường Thắng Lợi,thành phố Buôn Ma Thuột Luận văn thạc sĩ, trường đại học y Hà Nội Hồ Huỳnh Thùy Dương (1998).Phương pháp PCR Sinh học phân tử, Nhà xuất giáo dục, tr 190- 199 Hoàng Tiến Mỹ(1997), “Khảo sát vi khuẩn thường gây tiêu chảy cấp lứa tuổi tớnh khỏng thuốc”, Luận án tiến sỹ y khoa, Trường Đại học y dược TP Hồ Chí Minh Huỳnh Tân Tiến, (2000), Thực trạng thức ăn đường phố thành phố Hồ Chí Minh, Tài liệu hội thảo bảo đảm vệ snh an tồn thức ăn đường phố với văn minh thị, Hà Nội, Tr 37-40 Khuất Hữu Thanh,( 2003) Cơ sở di truyền học phân tử kỹ thuật gen Nhà xuất Khoa học kỹ thuật- Hà Nội Kiều Thị Mai Phương (1998), Khảo sát thực trạng ô nhiễm vi khuẩn thức ăn đường phố cửa hàng ăn dọc quốc lộ 1A huyện Tiên Sơn, tỉnh Bắc Ninh, Luận án thạc sỹ, Trường Đại học Y tế cộng đồng Tr 37- 51 Lê Thị Tuyết Trinh (2007) Phát triển hoàn thiện hệ thống PCR đa mồi xác định trực tiếp Escherichia coli gây tiêu chảy từ phân Luận văn thạc sĩ y học Trường Đại học Y Hà Nội 10 Nguyễn Thị Hiền cs (2005), Tình hình nhiễm vi khuẩn nhận thức vệ sinh an toàn thực phẩm người kinh doanh thức ăn đường phố Cục An toàn vệ sinh thực phẩm - www.vfa.gov.vn 11 Nguuyễn Thị Thu Thái.( 2006) Xác định gen aap, agg R,astA, EAEC số chủng E.coli khác kỹ thuật PCR Luận văn thạc sĩ, trường đại học y Hà Nội 12 Nguyễn Thị Sợi (1996), Khảo sát vệ sinh an toàn thực phẩm tiêu vi sinh thức ăn đường phố hộ gia đình Hải Phịng, Luận án thạc sỹ, Trường Đại học Y Hà Nội, Tr 54-72 13 Nguyễn Hữu Dòng (2005), Hội nhập kinh tế quốc tế vấn đề đổi công tác quản lý thực phẩm Việt Nam Cục An toàn vệ sinh thực phẩm - www.vfa.gov.vn 14 Phạm Hồng Nhung (2000), “Đánh giá độ nhậy độ đặc hiệu phản ứng PRC chẩn đoán Eschierichia coli sinh độc tố ruột(ETEC), Luận văn tốt nghiệp bác sỹ, Trường Đại học y Hà Nội 15 Phạm Nguyệt Minh (2010) Nghiên cứu xây dựng quy trình phát gen độc tố B.cereus thực phẩm kỹ thuật Multiplex PCR Luận văn thạc sĩ y học trường đại học y Hà Nội 16 Phạm Văn Tất (1999) “Ngộ độc thực phẩm năm qua” Thuốc sức khỏe số 132, Tr.10 17 Phùng Khắc Cam (1995), “Bệnh tiêu chảy Escherichia coli”, Sổ tay kiểm soát bệnh truyền nhiễm, Nhà xuất y học tr.190-200 18 Trần Linh Thước (2006) Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử vào việc kiểm tra giám sát Vệ sinh an toàn thực phẩm Đề tài nghiên cứu khoa học Phát triển Công nghệ cấp Nhà nước 19 Trần Trí Tuệ (2002) Góp phần nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR đa mồi phân loại Escherichia coli gây tiêu chảy Luận văn thạc sỹ y học, trường đại học y Hà Nội 20 Trần Văn Thọ cs (2004), Đánh giá thực trạng đề xuất số giải pháp quản lý chủ yếu bảo đảm vệ sinh an toàn thực phẩm Hải Phịng Cục An tồn vệ sinh thực phẩm - www.vfa.gov.vn II PHẦN TIẾNG ANH 21 August.1 Bonrgeois, Chris H Gardiner (1993), “Etiology of acute diarrhea among United States militery personel deployed to South America and west africa”, J.Trop.Med.Hyg, Vol 48(2), p 243-248 22 Bean, N.H., Griphin, P.M., Goulding, J.S and Ivey, C.B (1990) Foodborne disease outbreaks, year summary, 1983-1987 J Food 23 Prot 53: 711-728 Bitzan M et al (1998) “ The rol of E.coli O157 infections in the classical haemolytic uraemic syndrome: results of a Central European, multicentre study”, Epidemiology and infection deseases 24 (110), pp 183- 196 Black, R E., K H Brown, S Becker, A R M Abdul Alim, and M H Merson 1982 Contamination of weaning foods and transmission of enterotoxigenic Escherichia coli diarrhea in children in rural Bangladesh Trans R Soc Trop Med Hyg 76:259–264 25 Black, R E., M H Merson, B Rowe, P R Taylor, A R M Abdul Alim, R J Gross, and D A Sack 1981 Enterotoxigenic Escherichia coli diarrhoea: acquired immunity and transmission in an endemic area Bull W H O 59:263–268 26 Cast (1994) CAST Report: Foodborne Pathogens: Risks and Consequences Task Force Report No 122, Washington, DC: Council for Agricultural Science and Technology E 27 Capacity building for the prevention of food-borne diseases Interim report prepared for the Asian Development Bank Food Administration, Hanoi, Vietnam World Health Organization 7p., (2002) 28 Cryan, B 1990 Comparison of three assay systems for detection of enterotoxigenic Escherichia coli heat-stable enterotoxin J Clin Microbiol 28:792–794 29 Galanis, E., Lo Fo Wong, D., Patrict, M., Wegener, H.C 2002 Characterizing the worldwide Distribution of Salmonella serotypes The role of WHO Global Salm-surv Danish Institute for Food and Veterinary Research 30 Giannella, R A., K W Drake, and M Luttrell 1981 Development of a radioimmunoassay for Escherichia coli heat-stable enterotoxin Infect Immun 33:186–192 31 Guerrant, R L., L L Brunton, T C Schnaitman, L I Rebhun, and A G Gilman 1974 Cyclic adenosine monophosphate and alteration of Chinese hamster ovary cell morphology: a rapid, sensitive in vitro assay for the enterotoxins of Vibrio cholerae and Escherichia coli Infect Immun 10:320– 327 32 http://www.undp.org.vn/mlist/develvn/042001/post32.htm 33 Ito, T., S Kuwahara, and T Yokota 1983 Automatic and manual latex agglutination tests for measurement of cholera toxin and heatlabile enterotoxin of Escherichia coli J Clin Microbiol 17:7–12 34 James P Nataro and James.B.Kaper (1998), “Diarrheagenic Escherichia coli”, Clinical Microbiol Rews, Vol 11(1), P.142-210 35 James.B.Kaper (1998), ”Enterohemorrhagic Escherichia coli”, Current opinion in microbiology, Vol 1, p.103-108 36 M.Paniagua, F.Espinoza, M.Ringman(1997), “Analysis of incidence of infection with enterotoxigenic Escherichia coli in a prospective cohort study of infant in Nicaragoa”, J.clin Microbiol., Vol 35(6), p.1404-1410 37 Nguyen TV, Le PV, Le CH, Weintraub A Antibiotic resistance in diarrheagenic Escherichia coli and Shigella strains isolated from children in Hanoi, Vietnam Antimicrob Agents Chemother 2005;49:816-9 38 Oberhelman, Laborde (1998), “Colonization with Enteroadherent, Enterotoxigenic and Enterohemorrhagic Escherichia coli among daycase center attendies in New Orleans”, J.Larisiana pediatr infect Dis., Vol 17(12), p 1159-1162 39 Oralak Serisantalergs, David Shlim and Piter Echeverria (1997), “Characterization of Escherichia coli from cases of childhood diarrhea in provincial Southwestern Nigeria”, J.Clin.Microbiol, Vol 35(6), p.1139-1141 40 OrJan olsvik( 1998) “PCR detection of heat-stable, and shiga-like toxingenes in Escherichia coli”, Protocol 1-16: PCR detection of E.coli toxingenes phương pháp 271-275 41 Peter Echeverria, (1993), “E.coli diarrhoea”, Baillieres clinical Gastroenterology, Vol7(2), pp243-262 42 Ryder, R W., D A Sack, A Z Kapikian, J C Mclaughlin, J Chakraborty, A.S Mizanur Rahman, M.H Merson, and J.G.Wells.1976 Enterotoxigenic Escherichia coli and reovirus-like agent in rural Bangladesh Lancet i: 650-663 43 Sethabutr, O., Venkatesan M., Murphy GS Et al, (1993) Detection of Shigella and enteroinvasive E.coli by amplification of the invation plasmid antigen H DNA sequence in patient with dysentery J Infect Dis., 167: p 458-461 44 Stanley falknow, Johnmakelanos (1990) “ Enteric Bacilli and Vibrios”, Microbiology, fourth edition, JB Lippincott company, pp 568-574 45 Streatfield, S J., M Sandkvist, T K Sixma, M Bagdasarian, W G J Hol, and T R Hirst 1992 Intermolecular interactions between the A and B subunits of heat-labile enterotoxin from Escherichia coli promote holotoxin assembly and stability in vivo Proc Natl Acad Sci USA 89:12140–12144 46 Warawadee Nirdnoy, David N Taylor and Peter Echeverria (1997), “Distribution of colonization factor antigens among enterotoxigenic E.coli strains isolated from patiens with diarrhea in Nepal, Indonesia, Peru and Thailand”, J Clin Mcrobiol Vol 35(2), pp 527-530 47 WHO (2000), Food Safety and foodborn illness, N 237, 342-345 48 WHO PANO (1997), Epidermiology surveillance of foodborne Diseases,p 67-70 49 Wood, L.V., L.E Ferguson, P.Hogan, D.Thurman, D.Morgan, H.L Dupon, enteropathogens and in C.D.Ericson.1983.Incidence foods from Mexico of bacteria Appl.Environ Microbiol.Lett.148:35-42 50 Yolken, R H., H B Greenberg, M H Merson, R B Sack, and A Z Kapikian 1977 Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Escherichia coli heat-labile enterotoxin J Clin Microbiol 5:439–444 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1.Tình hình vệ sinh an toàn thực phẩm 1.1.1.Trên giới 1.1.2 Ở Việt Nam 1.2 Ngộ độc thực phẩm E.coli 1.2.1 Vài nét E.coli 1.2.2 Phân loại 1.2.3 Đặc điểm sinh học 1.2.4 Khả gây bệnh đường tiêu hóa 10 1.3 Ngộ độc thực phẩm ETEC 14 1.3.1 Trên giới 14 1.3.2 Ở Việt Nam 15 1.4.Các phương pháp xác định E.coli 15 1.4.1 Phương pháp định danh kinh điển .15 1.4.2 Thử nghiệm tạo váng gây ngưng kết hồng cầu .17 1.4.3 Phương pháp thử nghiệm động vật thực nghiệm 17 1.4.4 Phương pháp miễn dịch .17 1.4.5 Phương pháp nuôi cấy tế bào 20 1.4.6 Kỹ thuật sinh học phân tử 21 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .24 2.1 Đối tượng nghiên cứu 24 2.1.1 Chủng vi khuẩn plasmid 24 2.1.2 Hóa chất, máy móc thiết bị 24 2.1.3 Môi trường đệm 26 2.1.4 Cặp mồi sử dụng 26 2.2 Phương pháp nghiên cứu 26 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu .27 2.2.2 Các phương pháp tiến hành nghiên cứu 28 CHƯƠNG 3: DỰ KIẾN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 40 CHƯƠNG 4: DỰ KIẾN BÀN LUẬN VÀ KẾT LUẬN .41 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ELISA: : Enzym Linked Immuno Sorbent Assay (kỹ thuật miễn dịch gắn enzym) PBS: : Phosphate Buffer Saline-natri (Dung dịch đệm phosphat) PCR : Polymerase Chain Reaction E coli : Escherichia coli ETEC : Enterotoxigenic Escherichia coli (E.coli sinh độc tố ruột) DEC : Diarrheagenic Escherichia coli (E coli gây tiêu chảy) LT : Heat Labile Toxin (Độc tố không chịu nhiệt) ST : Heat Stable Toxin (Độc tố chịu nhiệt) ATVSTP : an toàn vệ sinh thực phẩm EltB : Escherichia coli Heat Labile Toxin B( tiểu đơn vị B độc tố không chịu nhiệt E.coli) ... thành công protein tiểu đơn vị B độc tố không chịu nhiệt LT ETEC quy mơ phịng thí nghiệm Sản xuất kháng thể kháng protein tái tổ hơp EltB quy mô phịng thí nghiệm Sản xuất kháng thể kháng LT quy mơ... tài: ? ?Thiết kế biểu protein tiểu đơn vị B độc tố không chịu nhiệt LT ETEC sản xuất kháng thể đa dòng kháng LT quy mơ thí nghiệm? ?? Đây b? ?ớc quan trọng cho nghiên cứu nhằm mục đích sản xuất sinh... bao gồm 28 kDa tiểu đơn vị A 11,5 kDa tiểu đơn vi B (LTB) Khả b? ??m dớnh tiểu đơn vị B vào thụ thể GM1 niêm mạc ruột non cho phép độc tố xâm nhập vào b? ?n tế b? ?o niêm mạc ruột Tiểu đơn vị A mang hoạt