Đề tài (y học) ứng dụng kĩ thuật PCR chẩn đoán các gen gây bệnh của h pylori từ mẫu bệnh phẩm sinh thiết dạ dày

ĐẶT VẤN ĐỀ Vi khuẩn H.pylori phát Marshall Warren nǎm 1982 từ mảnh sinh thiết niêm mạc dày người Nhiều nghiên cứu cho thấy vi khuẩn đóng vai trị quan trọng nguyên nhân bệnh sinh viêm loét dày - tá tràng ung thư dày Các nghiên cứu dịch tễ học cho thấy khoảng nửa dân số giới bị nhiễm vi khuẩn (Trích biên hội thảo quốc tế nhiễm trùng H.pylori Dublin, Ireland, 7/1992) Hầu hết người nhiễm Helicobacter pylori khơng có triệu chứng, có tỉ lệ nhỏ bệnh nhân nhiễm phát triển thành bệnh loét dày (PUD - peptic ulcer diseases), số tiến triển thành ung thư dày (Rudi et al., 2000; Nomura et al 1994) Điều vài chủng H pylori mang nhiều độc tố chủng khác (Tovey et al., 2006) Sự biến đổi biểu lâm sàng có liên quan đến vài yếu tố yếu tố độc lực chủng, yếu tố miễn dịch thể chủ ảnh hưởng môi trường, kết hợp yếu tố (Atherton et al., 1997) Một vài gen độc lực có lẽ giữ vai trị phát sinh bệnh, cagA gene (chiếm khoảng 68% chủng) vacA gene (hầu có mặt tất chủng) tìm thấy có mối liên quan nhiều với mức độ bệnh (Yamazaki et al., 2005) Sự tác động yếu tố độc lực tế bào biểu mô dày làm sáng tỏ hệ thống phức tạp tương tác tế bào kích hoạt vi khuẩn (Moss ad Sood 2003) Những bệnh nhân viêm tá tràng, loét tá tràng, loét dày hầu hết nhiễm chủng mang gen cagA - vacA, giả thuyết chúng giữ vai trò quan trọng phát sinh bệnh (Censini et al., 1996) Vì việc phát chủng mang gen cagA - vacA có ý nghĩa quan trọng cơng tác dự phòng điều trị bệnh lý dày Hiện nay, việc ứng dụng kỹ thuật PCR đa mồi chẩn đoán phát gene độc lực Helicobacter pylori phổ biến giới, nhiên Việt Nam việc ứng dụng công nghệ chưa nhiều cơng trình dừng lại việc phát gene độc lực phản ứng riêng lẻ mà không phát chủng mang nhiều gene độc lực lúc, điều gây tốn không đáp ứng nhu cầu điều trị.Vì chúng tơi tiến hành nghiên cứu “Ứng dụng kĩ thuật PCR chẩn đoán gen gây bệnh H.pylori từ mẫu bệnh phẩm sinh thiết dày” với mục tiêu sau: -Xây dựng qui trình tách chiết DNA tổng số H.pylori từ mảnh sinh thiết dày -Xây dựng qui trình kĩ thuật Multiplex-PCR xác định gen gây bệnh H.pylori -Đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu kĩ thuật PCR xác định gen gây bệnh H.pylori -Ứng dụng kĩ thuật PCR xác định kiểu gen H.pylori gây bệnh bệnh nhân bị bệnh lý dày tá tràng(ung thư, loét dày) Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU TÌNH HÌNH NHIỄM HELYCOBACTER PYLORI TRÊN THẾ GIỚI VÀ TRONG NƯỚC 1 Tình hình nhiễm H Pylori Mặc dù nhiễm trùng H pylori phát cách không lâu sau công bố Marshall Warren nghiên cứu dịch tễ học làm người kinh ngạc “ nửa dân số giới bị nhiễm H pylori ”( hội thảo quốc tế nhiễm trùng H.pylori,Dublin,Ireland,1992) Các nghiên cứu cho thấy H pylori phân bố khắp khu vực, quốc gia giới mức độ lưu hành H pylori vùng, quốc gia khác phụ thuộc nhiều yếu tố tình trạng kinh tế xã hội yếu tố quan trọng Nhìn chung tỉ lệ nhiễm H pylori nước phát triển thấp so với nước phát triển, hai nhóm nước có gia tăng mức độ lưu hành theo tuổi * Ở nước phát triển: Các nghiên cứu dịch tễ học nước phát triển cho thấy tỉ lệ nhiễm H pylori khoảng 20% độ tuổi 40 50% độ tuổi từ 60 trở lên Tỉ lệ huyết dương tính với H pylori thấp 10% trẻ 10 tuổi, tỉ lệ nhiễm trùng gia tăng theo tuổi hàng năm trẻ em khoảng 0,5%3 1,0% Ở người lớn tỉ lệ nhiễm trùng gia tăng theo tuổi hàng năm thấp trẻ em, từ 0,3%-0,5% [Bruce E CS, 1997; Graham CS, 1991] lại có bước nhảy mức độ lưu hành cao sau tuổi Đó tỉ lệ nhiễm thời thơ ấu họ, thời điểm mà tình trạng kinh tế xã hội nước phương Tây thấp [Graham DY CS,1991;Marshall BJ CS,1984] * Ở nước phát triển: Tỉ lệ nhiễm HP nước phát triển cao hẳn nước phát triển Trẻ bị nhiễm từ sớm, tỉ lệ 50% trẻ tuổi tăng lên đến 70%-90% người trưởng thành Tỉ lệ nhiễm trẻ hàng năm 10% lứa tuổi từ đến [Marshall BJ CS,1984; Mergaud F CS, 1989] Tuy nhiên tỉ lệ nhiễm không giống nước phát triển: Huyết dương tính với H pylori Algeri 43% trẻ em đạt tới 92% người lớn độ tuổi 40 đến 49 [Pradip K.Bardhan, 1997] Ở Nam Phi tỉ lệ H pylori dương tính 50% độ tuổi 10 94% độ tuổi 30 [ Pradip K.Bardhan, 1997] Ngay quốc gia mà tỉ lệ H pylori dương tính khác khu vực đối tượng: Chile số liệu vùng người lớn 43%-92%, trẻ em 6%-100% đối tượng khác [Guillmermo F CS, 1997] Ở Bangladesh cho thấy H pylori dương tính 61% trẻ 1-3 tháng tuổi, giảm xuống 33% trẻ 10-15 tháng lại tăng lên đến 84% trẻ 5-8 tuổi [Sarker SA CS, 1997] Như dịch tễ học H pylori bị chi phối nhiều yếu tố Tháng 06/1994 chi nhánh quốc tế nhóm nghiên cứu ung thư WHO định nghĩa H pylori tác nhân gây ung thư người Khoảng 50% dân số giới đánh giá nhiễm H pylori Tỉ lệ lưu hành H pylori huyết nói chung tăng theo tuổi: 5-27% thời thơ ấu >70% người >50 tuổi Ước tính khoảng 8-10% dân số giới bị loét dày tá tràng (LDDTT), LDD chiếm khoảng phần tư Ở nước châu Âu, tỷ lệ LDDTT khoảng 5-10% dân số Ở Mỹ có khoảng 4-10% dân số bị LDDTT Viêm loét dày-tá tràng (DD-TT) bệnh lý phổ biến Tại Mỹ, tỉ lệ mắc bệnh tính suốt đời, khoảng 12% nam giới 10% nữ giới Bệnh có tỉ lệ tử vong thấp, gây đau đớn tốn cho bệnh nhân Ước tính có khoảng 5-10% dân số giới bị bệnh đau dày Riêng bên Mỹ có đến 25 triệu người bị bịnh, số đàn ông đàn bà bịnh ngang Ở Việt Nam tỉ lệ 7% Tuy nhiên, điểm quan trọng mà y học ngày phát có đến 70% số dân có nguy bị nhiễm chứng bệnh nguyên nhân xác định vi trùng Helicobacter Pylori 1.2 Tình hình bệnh lý dày Helicobacter Pylori nước Việt Nam nằm khu vực có tỉ lệ nhiễm H.pylori cao chưa có nghiên cứu dịch tễ học qui mô mô tả tranh đầy đủ nhiễm trùng H.pylori Việt Nam Theo kết xét nghiệm huyết học, Phùng Đắc Cam, tỉ lệ lưu hành kháng thể kháng H.pylori nhóm người có bệnh dày - tá tràng 98,2%, nhóm khỏe mạnh 77,4% Tỉ lệ nhiễm nhóm 6,5-7,3% (13) Theo kết nghiên cứu Nguyễn Khánh Trạch 528 người Thanh Hóa, Hà Nội, Nha Trang thấy tỉ lệ nhiễm H.pylori (xác nhận phương pháp ELISA) người khỏe mạnh cộng đồng 75%; đó, nam chiếm 76,4%; nữ 74,7% HÌNH THỂ VÀ CẤU TRÚC GENOME CỦA HELICOBACTER PYLORI 2.1 Phân loại danh pháp: Helicobacter pylori ban đầu gọi Campylobacter like organism chúng có hình thái giống nhóm tác nhân gây bệnh đường ruột khác biết Campylobacter Sau Goodwin cộng đề nghị xếp vào giống giống Helicobacter Tháng năm 1989, tạp chí quốc tế hệ thống học vi khuẩn chấp nhận giống vi khuẩn Helicobacter, từ Campylorbacter pylori gọi Helicobacter pylori Hiện theo hệ thống học vi khuẩn, giống Helicobacter giống thuộc phân lớp epsilon, ngành proteobacteria Sau phát H.pylori người ta cịn phát 21 lồi thuộc giống Helicobacter cư ngụ động vật khác khả phát nhiều vi khuẩn khác thuộc nhóm 2.2 Hình thể cấu trúc: Helicobacter Pylori có hình cong, xoắn nhẹ, gram âm, đường kính 0,3-1,0 µm, dài 1,5-5 µm, tiêu nhuộm có hình chữ S, dấu ~,dấu ?, hình cánh cung nuôi cấy lâu ngày Bề mặt vi khuẩn nhẵn, vỏ mỏng, có - roi, đầu mút hình củ hành Nhờ có roi, vi khuẩn di chuyển lớp chất nhày niêm mạc dày Vi khuẩn có hệ thống men phân giải ure hệ thống enzym gồm urease, oxidase, catalase, phosphatase kiềm, γ glutamyl, transferase, ANDase … men urease có vai trị quan trọng sinh bệnh học vi khuẩn Men urease có hệ thống gen gồm có C, D, A, B, I, F, G, H; gen A, B gen cấu trúc; cịn gen F, G, H gen hoạt tính giữ vai trò hoạt động men Men urease giữ vai trò thủy phân urea để tạo NH3 CO2, tạo vi môi trường kiềm bảo vệ cho H.pylori khỏi bị tác dụng acid dày Men urease làm tổn thương tế bào niêm mạc dày ion H+ sinh nhờ cân với NH3 nước khuếch tán vào thành dày làm tổn thương niêm mạc H.pylori sản xuất protein bề mặt có tính chất hóa ứng động bạch cầu đơn nhân đa nhân (Một số hình ảnh H Pylori) Kích cỡ tồn gen (genom) Helycobacter Pylori nằm khoảng 1,6-1,73 Mb chức 60 gen khác đồ gen HP xác định, số gen liên quan đến gây bệnh đặc biệt quan tâm CagA VagA - Gen VagA mã hóa cho độc tố VagA ( vacuolating toxin A) gây tổn thương tế bào niêm mạc hình thành nên khơng bào ( hốc) tế bào Gen có tất chủng Helycobacter Pylori vagA xuất khoảng 40%-50% số chủng lưu hành [Bruce E.Dunn CS, 1997; Zhongming Ge Diane E.Taylor, 1999] Độc tố hoạt hóa độ pH thấp có tính bền vững với acid pepsin Gen vacA (gen mã hóa cho độc tố VacA) khơng có vị trí cố định gen nằm cách xa tiểu đảo sinh bệnh thay đổi tùy thuộc chủng H.pylori Phần gen (m - middle) có hai alen m1 m2, vùng tín hiệu (s - signal) phân loại thành alen s1, bao gồm s1a, s1b s2 Những thay đổi khác gen quan trọng khả tiết độc tố gây rỗng hoạt động vi khuẩn, kiểu gen s1/m1 có khả tiết độc tố mức độ cao, kiểu gen s1/m2 tiết độc tố mức độ vừa phải, kiểu gen s2/m2 khơng có khả tiết độc tố, khơng thấy chủng có kiểu gen s2/m1 Những nghiên cứu gần thấy rằng, chủng có chứa gen vacA s1a có mối liên quan lớn với việc thâm nhiễm bạch cầu hạt tế bào lympho niêm mạc hang vị chủng có chứa kiểu gen s1b s2 Chủng chứa gen vacA m1 có mối liên quan lớn tổn thương biểu mơ dày chủng có gen m2 Bệnh loét hành tá tràng thường thấy bệnh nhân chứa chủng có kiểu gen s1a bệnh nhân có chưa chủng s1b s2 - Gen cagA mã hóa cho loại protein liên quan đến độc tính mang tên cagA ( cytotoxin-associated gen A ), gen có mặt hầu hết chủng phân lập biểu 50%-70% chủng lâm sàng [Leen-Jan van Doorn CS, 2001] Những chủng có biểu đồng thời cagA vagA thường gây tổn thương nặng niêm mạc invitro invivo, có vai trị gây bệnh rõ rệt, chủng gọi “ chủng độc ” xếp vào type I, phân biệt với type II ( khơng có cagA vagA ) có khả gây bệnh [Helena Enroth Lars Engstrand, 2001; Zhongming Ge Diane E.Taylor, 1999] Người ta gọi CagA độc tố có tính kháng nguyên mạnh thể người bệnh nhiễm chủng H.pylori sản xuất Cag A nhanh chóng xuất kháng thể kháng Cag A Gen Cag A thường có chủng vi khuẩn tiết độc tố gây rỗng tế bào Mặc dù gen Vac A, gen sản xuất độc tố gây rỗng, phần tiểu đảo sinh bệnh (PAI) người ta thấy độc tố gây rỗng (Vac A) khơng H.pylori tiết khơng có diện PAI Trên thực nghiệm người ta vô hiệu hóa gen Cag A thấy phần cịn lại PAI ngun vẹn vi khuẩn có khả tiết độc tố gây rỗng - Gen iceA phát gần đây, chức chưa hoàn toàn sáng tỏ quan sát thấy, điều đặc biệt biểu quan sát thấy H pylori tiếp xúc với tế bào niêm mạc người [Leen-Jan van Doorn CS, 2001] Ngồi cịn số gen quan trọng H pylori với chức chúng như: abcdABCD : tham gia vào hoạt tính eanzym urease babA/B : mã hóa cho điểm bám trung gian H pylori với té bào niêm mạc dày ureA/B : gen cấu trúc urease GyrA : kháng ciprofloxacin (Nguồn : Leen-Jan van Doom, 2001 ; Zhongming Ge, 1999) Các nghiên cứu sinh học phân tử cho thấy trật tự gen H.pylori thay đổi đa dạng chủng, chủng ký sinh dày người lại mang đặc điểm khác nhau, chí chủng trước sau điều trị thấy xuất số thay đổi DNA nhiễm sắc thể plasmid hai [Brown LM, 2000; Helena Enroth CS,1999] tính đa dạng chuỗi gen chủng H pylori có vùng mang đặc tính đột biến tái tổ hợp cao [Ge Wang CS, 1999] Điều giúp H pylori thích nghi cao với mơi trường, đồng thời giải thích khả kháng lại kháng sinh nhanh chóng chúng q trình đièu trị tạo số khác biệt kỹ thuật chẩn đoán kháng thể Người ta dựa vào gen Cag A, Vac A để chia typ H.pylori sau: - Typ I H.pylori có gen Cag A, Vac A sản xuất protein Cag A protein Vac A có độc tính typ có liên quan nhiều với tổn thương nặng nề dày - Typ II H.pylori gen Cag A, Vac A nên khơng sản xuất protein Cag A protein Vac A có độc tính - Typ III H.pylori khơng có gen Cag A, có gen Vac A - Typ IV H.pylori khơng có gen Vac A có gen Cag A Ngồi độc tố tế bào, H.pylori cịn tác động đến trình hình thành tiết thành phần dịch vị H.pylori hoạt hóa bạch cầu đa nhân bộc lộ HLADR thụ cảm thể interleukin bề mặt tế bào sản xuất superoxid, interleukin 1, yếu tố hoại tử u α H.pylori sản xuất protease làm phân hủy glycoprotein- lipid lớp chất nhày dẫn đến làm giảm độ nhày độ quánh lớp chất nhày; vi khuẩn làm tăng tổng hợp tiết chất nhày chất lượng chất nhày dày giảm, khả bảo vệ niêm mạc chất nhày giảm H.pylori sản xuất chất bám dính làm vi khuẩn dễ bám vào bề mặt niêm mạc tạo điều kiện cho vi khuẩn cư trú phát triển 2.3 Vị trí cư trú H.pylori Vi khuẩn H.pylori môi trường acid dịch vị làm lỏng lớp chất nhày che phủ niêm mạc dày; tạo môi trường riêng thích hợp cho vi khuẩn tồn phát triển Ở niêm mạc dày, H.pylori thường cư trú khe tế bào biểu mô phần sâu lớp chất nhày Đôi khi, người ta thấy H.pylori tế bào Ngoài niêm mạc dày, H.pylori cịn cư trú niêm mạc tá tràng, niêm mạc thực quản có dị sản niêm mạc dày Một số nghiên cứu nhận thấy H.pylori tồn môi trường quanh bào tương tế bào với pH thích hợp từ 4-8; nhiên khoảng pH từ 4- vi khuẩn H.pylori tồn khơng phân chia 2.4 Nuôi cấy H pylori thuộc loại vi khuẩn hiếu khí, chúng thường ni điều kiện có 5% O2 , 10%CO2, 85%N2, Nhiệt độ 35-370C độ ẩm cao Phần lớn môi trường nuôi H pylori sử dụng máu ngựa máu cừu tươi, mơi trường chọn lọc có nhiều kháng sinh vancomycin, trimethoprim amphotericin B để ức chế tạp nhiễm(Fred M Sutton CS) Sau 3-5 ngày ni cấy (có thể đến 14 ngày) nhận thấy khuẩn lạc trịn, bóng, màu xám trong, đường kính 0,5-1mm, khơng tan máu tan máu anpha Trên tiêu nhuộm Gram, hình thể đa số hình cong, mức độ xoắn khơng điển tiêu trực tiếp từ mảnh sinh thiết, có trực khuẩn Sau ngày ni cấy, thấy thể hình cầu 2.5 Đường lây,nguồn lây Nguồn truyền nhiễm H pylori chủ yếu người, số tác giả đề cập đến cừu khỉ rhesus nguồn truyền nhiễm(Dore MP CS,Hazel M Mitchell 2001), việc phân lập H pylori không phổ biến Mặc dù phân bố H.pylori khắp giới đường lây chúng chưa hiểu cách đầy đủ Đường lây truyền chủ yếu từ người sang người qua đường tiêu hoá Phương thức lây đề cập nhiều đường phânmiệng, đương miệng-miệng đường dày miệng(hay cịn gọi đường chất nơn-miệng) , đường quan trọng cịn nhiều tranh luận VAI TRÒ CỦA H.PYLORI VỚI BỆNH LÝ VIÊM LOÉT DẠ DÀY VÀ LOÉT HÀNH TÁ TRÀNG 3.1 Vai trị H.pylori với bệnh lí viêm dày loét hành tá tràng Viêm dày tình trạng viêm niêm mạc dày Dựa vào triệu chứng viêm dày, chia thành hai loại viêm dày cấp mạn tính 10 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Lấy mẫu bệnh phẩm Các bệnh nhân mắc bệnh lý dày tá tràng có định phẫu thuật sinh thiết mảnh niêm mạc (chủ yếu vùng hang môn vị) Được bảo quản vân chuyển tới phịng thí nghiệm Tách DNA từ mảnh sinh thiết : Mảnh sinh thiết lấy mẫu nhỏ đem nghiền với 500µ dung dịch PBS chày eppendorf 1,5ml Sau hút lấy phần dung dịch đem cất -20°C để dùng dần * Tách DNA theo quy trình Clorofom : -Lấy 1000µ dịch nghiền,cho thêm 500µ Lisis Buffer + 15µ Lysozyme -Votex, ủ 30 phút nước đá -Thêm 15µ Proteinkinase K,lắc kỹ -Ủ 56°C 3h -Cho 100µ Clorofom, Phenol, isoamyl (25:24:1) -Ly tâm 13000vịng /10 phút -Hút phần nước vào ống có 500µ cồn 100° 25µ dung dịch Owen -Ủ -20°C 3h -Ly tâm 13000vòng /10 phút -Bỏ phần nước nổi,giữ cặn - Cho thêm 1000µ cồn 70° lắc vài lần -Ly tâm 13000vịng /10phút -Hút bỏ nước -Làm khơ, cho thêm 50µ nước khử ion, giữ -4°C 21 3 Chuẩn bị thành phần phản ứng PCR Thành phần phản ứng tính tốn chuẩn bị bảng sau: Bảng thành phần phản ứng PCR đa mồi TT Thành phần Nước khử ion Đệm gồm MgCl2 (10X) dNTPs Mồi VAI F, VAI R, Cag F, Cag R, VAG F, VAG R Buffer Taq DNA polymerase Nồng độ MgCl2: 1,5 mM 2,5 mM 10pmol/mồi 75u (NEB) cDNA phản ứng PCR thứ Tổng số (µl) Thể tích (µl) 11 85 0 5µl mồi x6 = 0µl 15 25 Phản ứng PCR Phản ứng PCR tiến hành theo chu trình luân nhiệt sau tìm nhiệt độ gắn mồi phù hợp sau: sau biến tính DNA nhiệt độ 940C phút; thực 35 chu kỳ chu kỳ gồm: 940C x 30 giây, 590C x phút, 720C x phút 30 giây; bước cuối kéo dài nhiệt độ 720C phút giữ 40C Điện di sản phẩm PCR Sản phẩm DNA điện di gel Agarose 1,2% Chuẩn bị gel Agarose: + Chuẩn bị Agarose 1,2% dung dịch đệm 1X TBE (1,2 gram + 100ml dd 1xTBE ) + Đun lị vi sóng cho Agarose tan hoàn toàn + Dung dich Ethidium Bromide 10 mg/ml + Để nguội đến 600C, hòa tan µl Ethidium Bromide 10 mg/ml (chất có khả gắn xen base phân tử DNA) lắc đều, đổ gel vào khay điện di ngang lắp lược + Rút lược sau gel đông lại (khoảng 30 phút) 22 Quá trình điện di kiểm tra sản phẩm PCR: + Gel đặt nằm ngang buồng điện di có chứa dung dịch đệm (1xTBE) đến mức phủ kín bề mặt thạch +Nạp bệnh μl phẩm nhuộm đệm loading dye 1x (5μl) vào rãnh điện di + Điện di thực theo phương nằm ngang với dịng điện chiều có hiệu điện 110 Vơn, dịng 80 mA, thời gian khoảng 45 phút + Quan sát chụp ảnh máy soi Gel-Dolphil Phát DNA H pylori phân biệt genotype H pyori Sản phẩm c-DNA H pylori nhuộm Ethidium Bromide Gel Agarose, soi tia cực tím (UV) máy soi Dolphin Sự tồn sản phẩm tổng hợp c-DNA phản ứng PCR kích thước mong đợi (so sánh với thang chuẩn DNA) cho phép chẩn đoán tồn H pylori mẫu bệnh phẩm Dựa vào kích thước khác sản phẩm PCR khuyếch đại nhờ primer đặc hiệu genotype H pylori cho phép phân biệt genotype H pylori Phân tích xử lý số liệu Số liệu nghiên cứu tổng hợp, báo cáo xử lý theo phương pháp thống kê y học 23 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Xây dựng quy trình phát H pylori mẫu bệnh phẩm sinh thiết dày Qui trình phát H.pylori thể hịên sơ đồ sau: Thu thập xử lí bệnh phẩm Nghiền bệnh phẩm Tách chiết tinh DNA phương pháp Chloroform, xác định DNA tổng số phương pháp đo mật độ quang học Khuyếch đại đồng thời 3gen đặc hiệu H.py lori Điện di đọc kết Qui trình xác định H.pylori từ mẫu sinh thiết dày 24 1 Thu thập bệnh phẩm Thu thập xử lý bệnh phẩm có ảnh hưởng trực tiếp đến giá trị kết xét nghiệm Những mẫu bệnh phẩm thu thập xử lý cách khơng thích hợp dẫn đến kết xét nghiệm khơng xác, tuân thủ đắn quy trình xét nghiệm Bệnh phẩm để chẩn đoán genome gây bệnh H pylori thu thập theo nguyên tắc đảm bảo an tồn, khơng gây nhiễm chéo từ bệnh nhân sang bệnh nhân khác trình lấy mẫu bệnh viện gây dương tính giả Bệnh phẩm lấy tai phịng mổ phịng sinh thiết sau vận chuyển tới tủ lạnh -20ºC để bảo quản Nghiền bệnh phẩm Bệnh phẩm nghiền với 500µ dung dịch 1xPBS sau hút lấy phần nước đem bảo quản -20ºC để dùng dần Tách chiết tinh DNA phương pháp Chloroform: Bệnh phẩm tách theo qui trình chloroform sau: -Lấy 1000µ dịch nghiền,cho thêm 500µ Lisis Buffer + 15µ Lysozyme -Votex, ủ 30 phút nước đá -Thêm 15µ Proteinkinase K,lắc kỹ -Ủ 56°C 3h -Cho 100µ Clorofom, Phenol, isoamyl (25:24:1) -Ly tâm 13000vịng /10 phút -Hút phần nước vào ống có 500µ cồn 100° 25µ dung dịch Owen -Ủ -20°C 3h -Ly tâm 13000vòng /10 phút -Bỏ phần nước nổi,giữ cặn - Cho thêm 1000µ cồn 70° lắc vài lần -Ly tâm 13000vịng /10phút -Hút bỏ nước -Làm khơ, cho thêm 50µ nước khử ion, giữ -4°C -Đo OD để xác định nồng độ DNA độ tinh 25 Qui trình thực phản ứng PCR Thực phản ứng khuyếch đại song song gen đặc hiệu H.pylori VAG, Cag, VAI Thực điện di DNA gel agarose đọc kết quả: Quá trình điện di thực mô tả phần 3.5.Sau điện di ta đưa vào máy Gel-Dolphil để chụp hình ảnh điện di DNA Đọc kết dựa độ dài DNA thạch.Hình ảnh thu lưu trữ đĩa cứng máy tính Sau số kết sau điện di: Trên thạch ta thấy hình ảnh gen đặc hiệu H.pylori có độ dài là: VAI 280 bp, Cag 350 bp ,VAG 642 bp Điều chứng tỏ có mặt H.pylori mẫu bệnh phẩm lấy XÁC ĐỊNH ĐỘ NHẠY VÀ ĐẶC HIỆU CỦA KỸ THUẬT 2.1 Tối ưu hóa nhiệt độ thời gian gắn mồi cho phản ứng PCR Để tìm nhiệt độ gắn mồi phù hợp cho phản ứng PCR gen đích VAG, Cag VAI thực chương trình gradient nhiệt máy iCycler Dựa vào nhiệt độ nóng chảy trung bình cặp mồi (Tm), nhiệt độ gắn mồi chọn từ 49oC đến 55oC với điểm đặt nhiệt là: 49; 49,5; 50,3; 51,4; 52,9; 54; 54,7 55 0C Sử dụng mẫu Plasmid phân lập Chuẩn bị 24 phản ứng PCR giống thành phần, có phản ứng PCR nhân gen VAG phản ứng nhân gen VAI phản ứng nhân gen Cag H.pylori tương ứng với điểm nhiệt độ xác định Thực phản ứng PCR đồng thời điều kiện khác nhiệt độ gắn mồi 26 Hình ảnh điện di gen Cag, VAG, VAI sau thực gradient nhiệt tim nhiệt độ gắn mồi tối ưu gen Kết thấy hình ảnh điện di rõ nét băng số số 6, tức nhiệt độ từ 51,4C đến 52,9C, gen Đối với thời gian gắn mồi, thí nghiệm chuẩn bị cho 12 phản ứng PCR panel chuẩn giống hệt thành phần ứng, thời gian gắn mồi thực với mốc thời gian 30, 45, 60, 90 giây, có phản ứng cho VAG, phản ứng cho Cag phản ứng cho VAI Chạy đồng thời điều kiện phản ứng PCR khác thời gian gắn mồi Kết cho thấy sản phẩm PCR ba gen rõ nét thời gắn mồi 60 giây Như vậy, chu trình nhiệt tốt để thực phản ứng PCR nhân hai gen đích đặc hiệu chẩn đốn H.pylori là: 94 0C: phút 94 0C: 30 giây x chu kì 52 0C: 60 giây 72 0C: phút x chu kì C: vơ 2.2 Xác định độ nhạy đặc hiệu kỹ thuật PCR với gen Cag, VAI, 27 VAG để chẩn đốn H.pylori là: Hình ảnh điện di19 mẫu bệnh nhân có kết H.pylori dương tính Độ nhạy đặc hiệu kỹ thuật PCR thực 30 mẫu bệnh nhân có H.pylori dương tính, với 30 mẫu Salmonella E coli chuẩn xác định nuôi cấy phân lập Kết điện di cho thấy tất bệnh nhân có H.pylori dương tính kết khuyeechs đại gen Cag, VAI, VAG là: dương tính 20/20=100%.Cịn với 30 mẫu samonella E.coli âm tính 30/30=100% Bảng : Tỷ lệ dương tính âm tính phản ứng PCR nhân gen Cag, VAG, VAI 28 chủng H.pylori, Salmonella E Coli Nhóm H.pylori Salmonella E coli Cộng Phản ứng PCR (+) (-) 20 0 30 20 30 * Độ nhạy (Sensitive): * Độ đặc hiệu (Specific): Cộng 20 30 50 Se = (20/20) x 100% = 100% Sp = (30/30) x 100% = 100% Vậy kĩ thuật PCR xác định có mặt H.pylori mẫu sinh thiết dày có độ nhạy 100% độ dặc hiệu 100% Trên nhóm bệnh nhân chọn tỉ lệ mang gen gây bệnh sau:  Nhóm bệnh nhân ung thư dày tỉ lệ mang gen VAI : Cag : VAG :  Nhóm bệnh nhân loét dày tỉ lệ mang gen VAI : Cag : VAG :  Nhóm bệnh nhân viêm dày mạn tỉ lệ mang gen VAI : Cag : VAG : 29 BÀN LUẬN Nhiệt độ thời gian gắn mồi yếu tố định đến thành bại phản ứng PCR xây dựng nhiệt độ thời gian gắn mồi phù hợp với gen H.pylori cần thiết để chẩn đốn có mặt H.pylori mảnh sinh thiết.Để dị tìm người ta thường thực máy PCR có chương trình Gradien nhiệt.Cố dịnh điều kiện khác cho thay đổi điều kiện cần dị tìm.Trong nghiên cứu chúng tơi tìm nhiệt độ thời gian gắn mồi cho phản ứng PCR khuyeechs đại gen Cag, VAG, VAI H.pylori.Kết cho thấy nhiệt độ 52°C cho kết gắn mồi tốt nhất.Thời gian trì gắn mồi phụ thuộc vào số lượng liên kết Hidro có mồi số lượng nucleotid G X hay số lượng nucleotid A T Kết nghiên cứu chứng minh 60 giây cho kết gắn mồi tốt Chu kì luân nhiệt xây dựng qua nghiên cứu để có suất cao khuyeechs đại gen Cag, VAI, VAG là: 94 0C: phút 94 0C: 30 giây 52 0C: 60 giây 72 0C: phút 0C: vơ x chu kì x chu kì Qua nghiên cứu xác định độ nhạy phương pháp PCR xác định H.pylori gây bệnh mẫu sinh thiết dày 100%.Ngược lại mẫu Samonella E.coli âm tính 100%, tính đặc hiệu kĩ thuật PCR 100% Tỉ lệ mang gen nhóm bệnh nhân là: 30 KẾT LUẬN Qua nghiên cứu rút số kết luận sau Chu trình luân nhiệt thực phản ứng PCR khuyếch đại gen Cag, VAG, VAI phát H.pylori chu kỳ 940C x phút; 40 chu kỳ (940C x 30 giây, 520C x 60 giây, 720C x 1phút 30 giây), chu kỳ 72 0C x phút giữ C.Hay nhiệt độ gắn mồi hiệu 52°C thời gian gắn mồi hiệu 60 giây Kỹ thuật PCR gen Cag, VAG, VAI phát H.pylori có độ nhạy 100% độ đặc hiệu 100% 31 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ TÍNH SÁNG TẠO CỦA ĐỀ TÀI Qui trình thu thập bệnh phẩm ,tách chiết tinh khuyếch đại gen Cag, VAG, VAI H.pylori để dạt suất cao phải tiến hành trên( 3.1) Xây dựng nhiệt độ thời gian gắn mồi tối ưu là: 52°C 60 giây Kĩ thuật PCR để xác định gen Cag, VAG, VAI H.pylori có độ nhạy độ đặc hiệu 100% Kĩ thuật PCR kĩ thuật xác định gen gây bệnh H.pylori Xác định gen H.pylori sở để tìm nguyên nhân gây bệnh lý dày bệnh nhân có nhiễm H.pylori Đó sở để xác định có điều trị điệt H.pylori hay khơng 32 Ý KIẾN ĐỀ NGHỊ Ứng dụng kĩ thuật PCR để xác định gen Cag, VAG, VAI gen độc lực vi khuẩn H.pylori Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện kĩ thuật PCR để xác định gen gây bệnh H.pylori từ mảnh sinh thiết dày 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO Phạm Quang Cử - Helicobacter pylori Vi khuẩn gây bệnh dày tá tràng Nhà xuất Y học, Hà Nội, 2008: – 47 Nguyễn Thị Hịa Bình – Tình hình nhiễm H pylori bệnh nhân loét dày – tá tràng Bệnh viện Đống Đa – Hà Nội Nội khoa 1995; 2: – 10 Phạm Quang Cử - Mối liên quan nhiễm Helicobacter pylori với viêm teo, dị sản ruột, loạn sản ung thư dày Luận án tiến sĩ Y học Hà Nội, 1999 Nguyễn Xuân Huyên – Bệnh loét dày – tá tràng Nhà xuất Y học, Hà Nội, 1999: 11 – 28 Hoàng Gia Lợi – Bệnh học nội tiêu hóa Học viện Quân Y, 2003: 19 – 48 Nguyễn Thị Tân cộng - Mối liên quan nhiễm H pylori với bệnh lý dày tá tràng điều trị H pylori Nội Khoa 1996; 2: 20 – 28 Nguyễn Khánh Trạch – Helicobacter pylori người lành người bệnh Hội thảo khoa học Helicobacter pylori bệnh lý dày tá tràng, Hà Nội tháng 4/2001 Nguyễn Thái Sơn, Phùng Đắc Cam, Kiều Chí Thành, Hồng Ngọc Hiền – Lưu hành kháng thể kháng H pylori bệnh nhân viêm loét dày tá tràng người Việt Nam bình thường khỏe mạnh Santanu Chattopadhyay, Rajashree Patra, T Ramamurthy, Abhijit Chowdhury, Amal Santra, G K Dhali, S K Bhattacharya, Douglas E Berg, G Balakrish Nair, and Asish K Mukhopadhyay – Multiplex PCR Assay for Rapid Detection and Genotyping of Helicobacter pylori Directly from Biopsy Specimens Journal of Clinical Microbiology, June 2004, p 2821 – 2824 Vol 42, No 10.J C Atherton, T L Cover, R J Twells, M R Morales, C J Hawkey, and M J Blaser – Simple and Accurate PCR – Based System for Typing Vacuolating Cytotoxin Alleles of Helicobacter pylori Journal of Clinical Microbiology, Sept 1999, p 2979 – 2982 Vol 37, No 11.Francis Mesgraud and Philippe Lehours – Helicobacter pylori Detection and Antimicrobial Susceptiblity Testing Clinical Microbiology Reviews, Apr 2007, p 280 – 322 Vol 20, No 34 35 ... xác định gen gây bệnh H. pylori -Đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu kĩ thuật PCR xác định gen gây bệnh H. pylori -Ứng dụng kĩ thuật PCR xác định kiểu gen H. pylori gây bệnh bệnh nhân bị bệnh lý dày tá... trình phát H pylori mẫu bệnh phẩm sinh thiết dày Qui trình phát H. pylori thể h? ??ên sơ đồ sau: Thu thập xử lí bệnh phẩm Nghiền bệnh phẩm Tách chiết tinh DNA phương pháp Chloroform, xác định DNA... bệnh nhân bị ung thư dày Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân: bệnh nhân có bệnh lý dày tá tràng có sinh thiết dày CÁC THIẾT BỊ VÀ H? ?A CHẤT PHỤC VỤ NGHIÊN CỨU 2.1 Các thiết bị nghiên cứu Bảng Các thiết