CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
2. XÁC ĐỊNH ĐỘ NHẠY VÀ ĐẶC HIỆU CỦA KỸ THUẬT
2.1. Tối ưu hóa nhiệt độ và thời gian gắn mồi cho phản ứng PCR.
Để tìm nhiệt độ gắn mồi phù hợp cho mỗi phản ứng PCR đối với gen đích VAG, Cag hoặc VAI thực hiện chương trình gradient nhiệt trên máy iCycler.
Dựa vào nhiệt độ nóng chảy trung bình của mỗi cặp mồi (Tm), nhiệt độ gắn mồi được chọn từ 49oC đến 55oC với các điểm đặt nhiệt là: 49; 49,5; 50,3; 51,4; 52,9;
54; 54,7 và 55 0C. Sử dụng mẫu Plasmid đã phân lập ở trên. Chuẩn bị 24 phản ứng PCR giống nhau về thành phần, trong đó có 8 phản ứng PCR nhân gen VAG và 8 phản ứng nhân gen VAI và 8 phản ứng nhân gen Cag của H.pylori tương ứng với các điểm nhiệt độ xác định ở trên. Thực hiện phản ứng PCR đồng thời trong cùng một điều kiện chỉ khác nhau về nhiệt độ gắn mồi.
Hình ảnh điện di của 3 gen Cag, VAG, VAI sau khi thực hiện gradient nhiệt tim nhiệt độ gắn mồi tối ưu của 3 gen.
Kết quả thấy hình ảnh điện di rõ nét nhất ở băng số 5 và số 6, tức là ở nhiệt độ từ 51,4C đến 52,9C, đối với gen
Đối với thời gian gắn mồi, thí nghiệm được chuẩn bị cho 12 phản ứng PCR trên các panel chuẩn giống hệt nhau về thành phần ứng, thời gian gắn mồi được thực hiện với mốc thời gian 30, 45, 60, 90 giây, trong đó có 4 phản ứng cho VAG, 4 phản ứng cho Cag và 4 phản ứng cho VAI. Chạy đồng thời trong cùng một điều kiện của phản ứng PCR chỉ khác về thời gian gắn mồi. Kết quả cho thấy sản phẩm PCR của cả ba gen rõ nét nhất là ở thời gắn mồi là 60 giây.
Như vậy, chu trình nhiệt tốt nhất để thực hiện phản ứng PCR nhân hai gen đích đặc hiệu chẩn đoán H.pylori là:
94 0C: 3 phút x 1 chu kì 94 0C:
52 0C:
30 giây 60 giây
72 0C: 7 phút x 1 chu kì 4 0C: vô cùng
2.2. Xác định độ nhạy và đặc hiệu kỹ thuật PCR với 3 gen là Cag, VAI,
VAG để chẩn đoán H.pylori là:
Hình ảnh điện di19 mẫu bệnh nhân có kết quả H.pylori dương tính
Độ nhạy và đặc hiệu của kỹ thuật PCR được thực hiện trên 30 mẫu bệnh nhân có H.pylori dương tính, với 30 mẫu Salmonella và E. coli chuẩn đã xác định bằng nuôi cấy và phân lập.
Kết quả điện di cho thấy trên tất cả bệnh nhân có H.pylori dương tính thì kết quả khuyeechs đại 3 gen Cag, VAI, VAG là: dương tính 20/20=100%.Còn với 30 mẫu samonella và E.coli thì âm tính 30/30=100%.
Bảng : Tỷ lệ dương tính và âm tính của phản ứng PCR nhân gen Cag, VAG, VAI
của các chủng H.pylori, Salmonella và E. Coli
Nhóm Phản ứng PCR Cộng
(+) (-)
H.pylori 20 0 20
Salmonella và E. coli 0 30 30
Cộng 20 30 50
* Độ nhạy (Sensitive): Se = (20/20) x 100% = 100%.
* Độ đặc hiệu (Specific): Sp = (30/30) x 100% = 100%.
Vậy kĩ thuật PCR xác định sự có mặt của H.pylori trong mẫu sinh thiết dạ dày có độ nhạy là 100% và độ dặc hiệu là 100%.
Trên nhóm bệnh nhân đã chọn thì tỉ lệ mang các gen gây bệnh như sau:
Nhóm bệnh nhân ung thư dạ dày thì tỉ lệ mang gen VAI là : Cag là : VAG là :
Nhóm bệnh nhân loét dạ dày thì tỉ lệ mang gen VAI là : Cag là : VAG là :
Nhóm bệnh nhân viêm dạ dày mạn thì tỉ lệ mang gen VAI là : Cag là : VAG là :
BÀN LUẬN
Nhiệt độ và thời gian gắn mồi là 2 yếu tố quyết định đến sự thành bại của phản ứng PCR do vậy xây dựng một nhiệt độ và thời gian gắn mồi phù hợp với từng gen của H.pylori là rất cần thiết để chẩn đoán sự có mặt của H.pylori trong mảnh sinh thiết.Để dò tìm người ta thường thực hiện trên máy PCR có chương trình Gradien nhiệt.Cố dịnh các điều kiện khác cho thay đổi điều kiện cần dò tìm.Trong nghiên cứu này chúng tôi tìm nhiệt độ và thời gian gắn mồi cho phản ứng PCR khuyeechs đại gen Cag, VAG, VAI của H.pylori.Kết quả cho thấy ở nhiệt độ 52°C cho kết quả gắn mồi tốt nhất.Thời gian duy trì gắn mồi phụ thuộc vào số lượng liên kết Hidro có trong mồi hay chính là số lượng nucleotid G và X hay số lượng nucleotid A và T. Kết quả nghiên cứu chứng minh rằng ở 60 giây cho kết quả gắn mồi tốt nhất.
Chu kì luân nhiệt xây dựng được qua nghiên cứu để có năng suất cao khi khuyeechs đại 3 gen Cag, VAI, VAG là:
94 0C: 3 phút x 1 chu kì 94 0C:
52 0C:
30 giây 60 giây
72 0C: 7 phút x 1 chu kì 4 0C: vô cùng
Qua nghiên cứu cũng xác định được độ nhạy của phương pháp PCR xác định H.pylori gây bệnh trên mẫu sinh thiết dạ dày là 100%.Ngược lại trên mẫu của Samonella và E.coli thì âm tính 100%, vì vậy tính đặc hiệu của kĩ thuật PCR là 100%.
Tỉ lệ mang gen trên các nhóm bệnh nhân lần lượt là: