Hỡnh 2.1. Sơđồ cỏc bước tiến hành nghiờn cứu 2.2.2. Cỏc phương phỏp tiến hành nghiờn cứu
2.2.2.1. Khuếch đại đoạn gen nạp EltB bằng kỹ thuật PCR
● Tỏch chiết DNA khuụn mẫu từ chủng ETEC.
- Cấy chủng chuẩn E.coli trờn đĩa thạch LB sau đú ủở 37 oC qua đờm. Khuyếch đại gen EltB bằng
kỹ thuật PCR
Tỏch dũng gen EltB
Đưa gen EltB vào vector biểu hiện pGEX
Kiểm tra vector biểu hiện chứa gen EltB
Biểu hiện protein tỏi tổ hợp
EltB trờn tế bao E.coli BL21
Kiểm tra Protein EltB bằng kỹ biến thuật Western blot
- Sau khi khuẩn lạc mọc, lấy một khuẩn lạc từđĩa thạch LB cấy sang mụi trường LB lỏng, lắc ở 37 oC/180 vũng/phỳt (v/p) trong12giờ.
- Lấy dịch khuẩn đó nuụi qua đờm cho vào ống falcol 5ml, ly tõm 3000 v/p trong 5 phỳt. Thu lấy cặn vi khuẩn ở đỏy ống.
- Thờm vào 900ul dung dịch Trizol + 200ul chloroform: isoamylalcohol, vortex kỹ trong 5 phỳt.
- Ly tõm ở tốc độ 13.000v/p trong 10 phỳt.
- Thu dịch nổi cú chứa DNA vào một ống eppendorf 1,5ml khỏc. - Thờm một thể tớch isopropanol lạnh và đểở -20oC trong 1 giờ. - Ly tõm với tốc độ 13.000v/p trong 10 phỳt, loại bỏ dịch nổi - Thờm vào 1ml ethanol 70%.
- Ly tõm ở tốc độ 13.000v/p trong 5 phỳt, loại bỏ dịch nổi, để khụ. - Hũa cặn DNA trong 20ul TE, giữở nhiệt độ -20oC.
● Thực hiện phản ứng PCR: Phản ứng PCR được tiến hành với cỏc thành phần như sau: Thành phần Thể tớch (àl) Dung dịch đệm (10X) 1 dNTPs 1 Primer BamHI- F 0,5 Primer XhoI- R 0,5
Taq DNA polymerase 0,1
DNA plasmid 1 (200ng/ml)
Nước khử ion vụ trựng 5,9
Chu trỡnh nhiệt của phản ứng PCR: 950 C : 5 phỳt 940C : 30 giõy 640C : 30 giõy 30 chu kỳ 720C : 1 phỳt 720C : 3 phỳt
● Chạy điện di và tinh sạch đoạn gen EltB
- Điện di sản phẩm PCR trờn thạch agarose 1,5% trong 30 phỳt ở hiệu
điện thế 100V, nhuộm gel trong dung dịch Ethidium brommide. Chụp ảnh để
ghi lại kết quảđiện di bằng hệ thống mỏy Genedoc, BioRad.
- Tinh sạch sản phẩm PCR bằng kớt tinh sạch DNA của QIAGEN
2.2.2.2. Nuụi cấy và tinh sạch Plasmid pGEX
- Chủng E. Coli DH5α cú chứa plasmid pGEX được nuụi cấy qua đờm trờn mụi trường canh thang LB cú chứa 100àg ampicillin/lit.
- Lấy huyền dịch khuẩn đó nuụi qua đờm cho vào Eppendorf 2ml, ly tõm 8000 v/p trong 5 phỳt. Thu lấy cặn vi khuẩn ởđỏy ống.
- Thờm 100μl dung dịch Sol I (50 mM glucose, 25 mM Tris-HCl (pH 8), 10 mM EDTA (pH 8)), hoà tan cho cặn tan hoàn toàn. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Bổ sung 200μl dung dịch Sol II (0,2N NaOH; 1% SDS (trọng lượng/ thể tớch: w/v)), đảo nhẹ.
- Thờm 150μl dung dịch Sol III (60 ml CH3COOK 5M; 11,5 ml CH3COOH; 28,5 ml nước), đảo nhẹ rồi đặt trong đỏ 5 phỳt.
- Ly tõm 13000 v/p trong 10 phỳt. Thu dịch nổi.
- Ly tõm 13000 v/p trong 10 phỳt. Chuyển pha trờn sang ống Eppendorf 1.5ml mới.
- Bổ sung dung dịch isopropanol lạnh theo tỷ lệ 1:1, ủ ớt nhất 20 phỳt. - Ly tõm 13000 v/p trong 10 phỳt. Thu kết tủa.
- Rửa kết tủa 2 lần bằng 500μl ethanol 70%, ly tõm 7000 v/p trong 1 phỳt. - Làm khụ DNA bằng mỏy, sau đú thờm 50μl nước khử ion, để ở nhiệt
độ phũng cho tan hoàn toàn.
- Kiểm tra độ tinh sạch Plasmid bằng cỏch điện di trờn thạch agarose 1,5% - Bảo quản ở -20oC để phục vụ cho cỏc nghiờn cứu tiếp theo.
2.2.2.3. Biến nạp đoạn gen EltB vào vector pGEX
Đoạn gen EltB mó húa tiểu đơn vị B độc tố khụng chịu nhiờt của ETEC sẽ được biến nạp vào vector biểu hiện pGEX. Protein EltB sẽ được tổng hợp trong tế bào E. coli BL21 dưới sựđiều khiển của Tac promoter (hỡnh 2.2).
EltB
ACCBamHI XhoIGCC
2.2.2.3.1. Cắt đoạn gen EltB và plasmid pGEX bằng enzym giới hạn
Đoạn gen EltB và plasmid pGEX sau khi được tinh sạch sẽ được cắt bằng Enzym giới hạn XhoI và BamHI theo tỷ lệ:
Thành phần Thể tớch (àl) BamH1 1 Xho1 1 Buffer 1 DNA 2 H20 5 Tổng số 10 Ủở 370C trong 5 giờ Điện di kiểm tra sản phẩm cắt
Tinh sạch sản phẩm cắt: sử dụng kớt tinh sạch của QIAGEN gồm cỏc bước như sau:
- Sau khi xỏc định đoạn DNA cần tỏch trờn bản gel điện di, cắt mảnh gel chứa đoạn này cho vào ống 1,5 ml và cõn xỏc định trọng lượng.
- Cho vào ống đệm QG theo tỷ lệ 3:1 (thể tớch đệm trờn trọng lượng gel chứa mẫu) và ủở 50°C trong 10 phỳt cho mảnh gel bị hũa tan hoàn toàn.
- Thờm 1 thể tớch isopropanol vào nếu đoạn DNA cú độ dài trờn 4 kb. - Để thu DNA, toàn bộ hỗn hợp trờn được cho vào cột QIA, cột này đó
được đặt trong ống thu nhận và ly tõm 12000 vũng/ phỳt, 1 phỳt, 4°C. Loại bỏ
- Tiếp tục thờm 0,5 ml đệm QG vào cột QIA và ly tõm 12000 vũng/ phỳt, 1 phỳt, 4°C để loại bỏ hoàn toàn cỏc cặn của gel điện di.
- Rửa cột QIA bằng 0,75 mL đệm PE, ly tõm 12000 vũng/ phỳt, 1 phỳt, 4°C. Loại bỏ phần dịch và tiếp tục ly tõm 12000 vũng/ phỳt, 1 phỳt, 4°C.
- Cỏc cột QIA được đặt vào cỏc ống thu mẫu 1,5 ml. Để thu mẫu DNA, 25 μl nước cất vụ trựng được cho vào phần tõm cột và để yờn 1 phỳt. Sau đú, ly tõm 12000 vũng/ phỳt, 1 phỳt, 4oC, để thụi DNA ra khỏi cột. Loại bỏ cột và cất giữ mẫu ở -20oC.
- Sản phẩm thụi gel sau khi tinh sạch được điện di kiểm tra lại trờn gel agarose 0,8% trước khi tiến hành kỹ thuật nối đoạn gen.
2.2.2.3.2. Đưa đoạn gen EltB vào vector pGEX
Sau khi cắt bằng enzym giới hạn đoạn gen EltB sẽđược đưa vào vector pGEX bằng ligation kit (promega) theo qui trỡnh sau:
Thành phần Thể tớch(àl) Ligate bufer 10X 2 EltB DNA 5 pGEX plasmid 2 Ligate 1 H20 10 Tổng số 20 Ủở nhiệt độ 160C trong 16-18 giờ
Biến nạp sản phẩm ligate vao tế bào biến nạp E. Coli DH5α theo cỏc bước như sau:
Trộn hỗn hợp ligate với 100àl tế bào biến nạp E. Coli DH5α, ủ trong
đỏ mạt 30 phỳt. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ủ hỗn hợp ở 42o C trong 2 phỳt.
Cho hỗn hợp trở lại đỏ mạt trong 2 phỳt.
Để hỗn hợp ở nhiệt độ phũng 2 phỳt.
Nhỏ vào hỗn hợp 1ml mụi trường canh thang SOC, ủ 30 phỳt ở 370C Ly tõm 2500v/5 phỳt ở 40C.
Lấy 100àl cặn lỏng lờn mụi trường thạch LB cú chứa 100àl/l ampicillin
ủở 370C qua đờm.
Kiểm tra kết quả biến nạp bằng kỹ thuật PCR
2.2.2.3.3. Kiểm tra đoạn gen biến nạp + Kỹ thuật PCR colonies
Nguyờn lý:
Nguyờn tắc kỹ thuật colony-PCR cũng dựa trờn nguyờn tắc của kỹ thuật PCR, chỉ khỏc ở mẫu DNA được thay thế bằng DNA plasmid được giải phúng từ khuẩn lạc. Ở nhiệt độ cao 94oC đến 95oC, màng tế bào bị phỏ vỡ, giải phúng plasmid tỏi tổ hợp. Plasmid tỏi tổ hợp sẽ làm khuụn cho phản ứng PCR nhõn gen bằng cặp mồi đặc hiệu, hoặc mồi vector.
Tiến hành:
Hũa tan tế bào vi khuẩn trong nước khử ion. Sau đú sử dụng hỗn hợp này để dựng cho phản ứng PCR.
Kỹ thuật PCR colony được thực hiện như bước bước 2.2.2.1 ở phõn phương phỏp
+ Kỹ thuật cắt Enzym giới hạn:
Những plasmid tỏi tổ hợp đó được kiểm tra bằng phản ứng PCR cho kết quả dương tớnh tiếp tục được kiểm tra bằng enzym giới hạn. Cỏc khuẩn lạc mang plasmid tỏi tổ hợp này được nuụi cấy trong mụi trường LB lỏng, cú bổ
sung Ampicilin. Sau đú, DNA của những plasmid tỏi tổ hợp được tỏch chiết theo quy trỡnh và được xử lý với cỏc enzym giới hạn.
Thành phần phản ứng cắt plasmid mang đoạn EltB với enzym BamHI và XhoI như sau: Thành phần Thể tớch (μl) Nước cất 2ì 5,0 Đệm Buffer 10ì 1,0 Enzym BamHI 1,0 Enzym XhoI 1,0
DNA plasmid –EltB 2,0
Tổng 10,0
Hỗn hợp phản ứng được ủở 37oC trong 5 giờ, sau đú được điện di kiểm tra trờn gel agarose 1%.
+ Giải trỡnh tự gen: - Thành phần phản ứng PCR: Thành phần phản ứng 1 mẫu (àl) Sản phẩm PCR tinh sạch 1.5àl Mồi 2.0 àl Bigdye 2.5X 3.0 àl Buffer 5X 4.0 àl Nước siờu sạch 9.5 àl Tổng số 20 àl
- Chu trỡnh nhiệt cho phản ứng PCR
960 C : 1 phỳt 960C : 30 giõy
500C : 30 giõy 30 chu kỳ
600C : 4 phỳt Giữở 40C
- Đọc trỡnh tự gen bằng mỏy đọc trỡnh tự ABI (Applied Biosystem) - So sỏnh cỏc đoạn gen và được so sỏnh với cỏc trỡnh tự chuẩn của ngõn hàng gen.
2.2.2.4. Biểu hiện protein tỏi tổ hợp EltB
- Tinh sạch plasmid pGEX-EltB
Chủng vi khuẩn E. Coli DH5α cú chứa Plasmid pGEX-EltB được nuụi
cấy qua đờm trong mụi trường canh thang LB cú chứa 100àg ampicillin sau (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
đú được ly tõm lấy căn tế bào và tỏch chiết plasmid (nhưở bước 2.2.2.2).
- Biến nạp plasmid pGEX-EltB vào tế bào biểu hiện protein E.coli BL21
Ủ trong hỗn hợp trong đỏ 30 phỳt.
Cho hỗn hợp vào trong mỏy ủ nhiệt ở 420C trong 1 phỳt.
Để trở lại trong đỏ 2 phỳt. Cho ra nhiệt độ phũng 1 phỳt.
Nhỏ vào hỗn hơp 900àl mụi trường canh thang SOC, ủ 30 phỳt ở 370C. Ly tõm 2500v/5 phỳt ở 40C.
Lấy 100àl cặn lỏng lờn mụi trường thạch LB cú chứa 100àl/l ampicillin
ủở 370C qua đờm.
Kiểm tra kết quả biến nạp bằng kỹ thuật PCR.
- Biểu hiện protein tỏi tổ hợp EltB
Chủng E. coli cú chứa vector pGEX-GST-EltB được cấy vào bỡnh nún 250 ml cú chứa 50ml canh thang. Lắc 150rpm ở nhiệt độ 37o C x 6 giờ (OD 0,6).
Khi đạt độđục OD=0,6, protein tỏi tổ hợp EltB sẽđược tổng hợp dưới sự điều khiển của tac promoter bằng cỏch cho vào bỡnh nuụi cấy hoạt chất kớch thớch tổng hợp protein ITPG (nồng độ cuối cựng là 1mM).
Lắc 150 vũng ở nhiệt độ 370C x 6 giờ (OD 0,6).
Thu hoạch tế bào bằng cỏch ly tõm 6000 vũng x 15 phỳt, bỏ nước nổi thu lấy tế bào vi khuẩn.
Hũa cặn tế bào đó thu hoạch vào 3ml dung dịch PBS1X.
Nhỏ 80 àl dung dich lysozym nồng độ 10mg/ml và ủ ở nhiệt độ 220C trong 10 phỳt sau đú nhỏ 30 àl of Triton X-100.
Phỏ vỡ tế bào bằng súng siờu õm sử dụng mỏy Braun Sonicator.
• Ly tõm 10000 vũng X 15 phỳt thu dịch nổi.
• Trộn dịch nổi với 2ml glutathione-sepharose gel (Pharamacia)
• Hỗn hợp được ủ ở 40C trong 18 giờ sau đú được chuyển sang cột tinh sạch protein.
• Rửa cột bằng 20 ml PBS cú 0.1% Triton X-100.
• Thu hoạch GST-EltB protein trong cột bằng 10 ml Tris buffer (10 mM, pH to 8.0 with HCl) cú chứa 5 mM reduced glutathione.
• Thu hoạch 1ml trong một lần sau đú phõn tớch protein tỏi tổ hợp bằng
điện di trờn gel SDS-polyacrylamide 12% (Pharmacia Phast System. 10- 15% gradient gels) và nhuộm gel bằng Coomasie Blue R250.
2.2.2.5 Kiểm tra protein EltB bằng Western blot
Western blot là kỹ thuật phỏt hiện protein bằng phương phỏp điện di trờn gel SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) Western blot bao gồm cỏc bước cơ bản sau:
- Protein được phõn tỏch bằng điện di trờn gel SDS-PAGE 15% trờn mỏy điện di đứng ở 200V trong 1 giờ.
- Cỏc protein được chuyển sang màng lai nitrocellulose, giữ nguyờn vị
trớ nhưđó phõn tỏch trờn gel bằng mỏy điện di đứng ở 100V trong 1 giờ. - Bloking màng lai trong đệm PBS 1X cú 2% skill-milk
Ủ màng lai đó cố định protein với khỏng thể đặc hiệu thỏ khỏng LT (primary antibody) ở nhiờt độ phũng trong 1 giờ. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Rửa màng lai 3 lần x 5 phỳt trong dung dịch PBS 1X cú 0,05% Tween-20, - Ủ màng lai với khỏng thể khỏng IgG thỏ (secondary antibody) cú gắn enzyme horseradish peroxidase ở nhiờt độ phũng trong 1 giờ.
- Rửa màng lai 3 lần x 5 phỳt trong dung dịch PBS 1X cú 0,05% Tween-20, - Ủ màng lai trong dung dịch phỏt hiện (detection kit)
- éặt một phim nhạy cảm với tia X lờn màng lai để phỏt hiện cỏc điểm sỏng phỏt ra do enzym.
Chương 3
KẾT QUẢ NGHIấN CỨU
3.1. Khuyếch đại đoạn gen biến nạp EltB bằng kỹ thuật PCR
- Sau khi tỏch chiết DNA từ chủng ETEC, đo nồng độ DNA khuụn, pha nồng độ DNA của cỏc mẫu như nhau khoảng 200ng/ml.
- Tiến hành phản ứng PCR theo thành phần và chu kỳ nhiệt đó được tối
ưu mụ tảở phần phương phỏp sau đú chạy điện di trờn gel agarose 1,5% ta thu được kết quả:
Hỡnh 3.1. Hỡnh ảnh PCR khuếch đại gen EltB.
M: Marker 1 kb; 1-3: Sản phẩm khuyếch đại gen EltB từ chủng ETEC chuẩn
Nhận xột: Kết quả điện di trờn gel agarose cho thấy đoạn gen tỏch
được đạt yờu cầu, gồm một băng rừ nột kớch thước 312bp tương đương kớch thước của gene EltB, khụng cú sản phẩm phụ.
3.2. Nuụi cấy và tinh sạch plasmid pGEX và cắt bằng enzym giới hạn
Sau khi nuụi cấy chủng E.coli DH5α cú chứa plasmid pGEX trờn mụi trường canh thang LB cú chứa 100àg ampicillin/lớt, sản phẩm sẽ được tinh sạch, cắt bằng enzym BamHI và XhoI sau đú kiểm tra bằng điện di trờn gel agarose 1,5% ta thu được kết quả:
bp
Hỡnh 3.2: Hỡnh ảnh plasmid pGEX sau khi đó được tinh sạch và cắt bằng enzym.
M: marker 1 kb; 1 hỡnh ảnh trước khi cắt bằng enzym; 2, 3 hỡnh ảnh sau khi cắt bằng enzym
Nhận xột: Kết quảđiện di trờn gel agarose cho thấy plasmid tỏch được
đạt yờu cầu, gồm một băng rừ nột kớch thước 4,9kb (giếng số 1) và hai băng xấp xỉ 4,9 kb sau khi được cắt bằng enzym giới hạn XhoI và BamHI (giếng số
2 và số 3) tương đương kớch thước của gen EltB, khụng cú sản phẩm phụ.
điều này cho thấy plasmid đạt yờu cầu cú thể sử dụng để biến nạp gen EltB.
3.3. Cắt đoạn gen EltB bằng cỏc enzym giới hạn.
- Đoạn gen EltB sau khi được tinh sạch sẽ được cắt bằng enzym giới hạn XhoI và BamHI, điện di thu được sản phẩm như sau:
Hỡnh 3.3. Kiểm tra đoạn gen EltB sau cắt bằng enzym.
MK: marker 100 bp, 1-3: đoạn gen EltB sau cắt bằng enzym XhoI và BamHI.
Nhận xột: Kết quảđiện di trờn gel agarose cho thấy sản phẩm PCR của
đoạn gen EltB cắt bằng enzym giới hạn cho hỡnh ảnh rừ nột kớch thước (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
MK 1 2 3 4,9kb
khoảng 312 bp (giếng số 1, 2 và 3). Cú thể sử dụng sản phẩm này để biến nạp vào vector pGEX.
3.4. Nối đoạn gen EltB vào vector pGEX
Sau khi cắt bằng enzym giới hạn đoạn gen EltB sẽđược nối vào vector pGEX bằng ligation kit và được biến nạp vào tế bào E. coli DH5α. cỏc tế bào
E. coli này sau khi được biến nạp sẽ được trải ra đĩa thạch LB cú chứa 100àg/ml ampicilline. Cỏc khuẩn lạc mọc trờn đĩa khỏng sinh sẽ được kiểm tra bằng cỏc kỹ thuật PCR, những khuẩn lạc sau khi được xỏc định cú đoạn gen EltB sẽ được lựa chọn để tỏch chiết plasmid và kiểm tra thờm bằng kỹ
thuật cắt emzym giới hạn và giải trỡnh tự gen.
3.4.1. Kiểm tra đoạn gen biến nạp bằng kỹ thuật PCR
1 2 3 4 5 6 - + M 7 8 9 10 11 12 13 14
Hỡnh 3.4: Kiểm tra đoạn gen EltB sau khi biến nạp vào vector pGEX-13X bằng kỹ thuật PCR.
M: Marker 1kb; 1-6, 7-12, 14: plasmid mang đoạn gen EltB;13: plasmid
khụng mang đoạn gen EltB; +: chứng dương -: chứng õm.
Nhận xột: ở hỡnh 3.4 cỏc giếng số 1-6, 7-12, 14 cú sản phẩm PCR là