Sự ra đời của kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) đó đưa lại một cuộc cỏch mạng trong việc nghiờn cứu, phõn tớch gen và hệ gen. Bởi vỡ bằng kỹ thuật này giỳp chỳng ta cú thể tạo ra một số lượng lớn cỏc bản sao của một
đoạn DNA đớch quan tõm [4, 15].
Phản ứng PCR dựa trờn nguyờn lý tổng hợp DNA trong tế bào, trong đú DNA được nhõn lờn theo cơ chế bỏn bảo tồn. Về nguyờn tắc để bắt đầu quỏ trỡnh tổng hợp DNA, hai sợi DNA làm khuụn mẫu bị tỏch ra dưới tỏc dụng của nhiệt độ. Hai đoạn oligonucleotid gồm 20-40 nucleotid gọi là mồi sẽ gắn vào cỏc vị trớ bổ sung trờn đoạn DNA mẫu.
Trong điều kiện của PCR, hai mồi sẽ được kộo dài về hai phớa, tạo ra
đoạn DNA mới bổ sung với đoạn khuụn mẫu. Với một cặp mồi đặc hiệu một
đoạn DNA nào đú sẽ được tổng hợp sau mỗi chu kỳ của PCR. Việc thao tỏc
được thực hiện trực tiếp trờn chất liệu di truyền (đặc biệt trờn cỏc gen của vi khuẩn) để khuyếch đại đặc hiệu trờn hàng triệu hay hàng tỷ lần trong thời gian ngắn [15, 19].
Như vậy, số cặp mồi cần thiết sẽ tương ứng với số đoạn DNA cần khuyếch đại. Mỗi phản ứng PCR được thực hiện với sự tham gia của một cặp mồi đặc hiệu. Tuy nhiờn trong nhiều trường hợp, việc tiến hành nhiều phản ứng PCR sẽ mất khỏ nhiều thời gian và việc sàng lọc sẽ gõy tốn kộm [7].
Chớnh vỡ vậy, nhiều tỏc giả đó cải tiến đưa ra phương phỏp sử dụng nhiều cặp mồi trong một phản ứng PCR, để cựng một lỳc khuyếch đại được nhiều đoạn DNA. Trong chẩn đoỏn vi sinh, điều này đồng nghĩa với việc phỏt hiện được nhiều tỏc nhõn gõy bệnh chỉ bằng một phản ứng PCR. Kỹ thuật này
được gọi là PCR đa mồi (multiplex PCR). Ưu điểm của PCR đa mồi là tiết kiệm nhiều thời gian và nguyờn vật liệu, ớt tốn kộm.
Hiện nay kỹ thuật PCR đang được ỏp dụng rộng rói trờn thế giới để
phỏt hiện cỏc gen độc tố của E. coli gõy bệnh. Tại Việt Nam, cỏc kỹ thuật PCR đang được ỏp dụng để phỏt hiện cỏc gen độc tố của E. coli, nguyờn nhõn gõy tiờu chảy ở trẻ em [38].
Kỹ thuật tỏi tổ hợp DNA thường được gọi là kỹ thuật di truyền; ra đời trờn cơ sở hàng loạt thành tựu của sinh học phõn tử trong việc tỏch, cắt, nối, chuyển và cho cỏc gen biểu hiện đỳng như mong muốn. Nú cú vai trũ cỏch mạng húa đối với sự phỏt triển của sinh học và tạo ra quyền lực ghờ gớm cho con người trong việc cải tạo sinh giới và bản thõn mỡnh.
Đó cú những nỗ lực rất lớn được đầu tư nhằm nghiờn cứu và ứng dụng protein tỏi tổ hợp tiểu đơn vị B độc tố khụng chịu nhiệt LT của E.Coli (rLTB). Một số nghiờn cứu tập trung sản xuất rLTB thụng qua hệ biểu hiện của tế bào Eukaryotic như nấm men, hệ thuốc lỏ chuyển gen và thực vật ăn được… nhưng thuận tiện và hiệu quả hơn cả là hệ E.coli.
E. coli chớnh là một trong những vật chủ được sử dụng nhiều nhất để
biểu hiện protein tỏi tổ hợp invitro. Tuy nhiờn khú khăn chớnh là việc giữ được hoạt tớnh của cỏc protein sau khi biểu hiện bởi E.Coli. Cú rất nhiều hệ
vector được sử dụng cho tỏch dũng và biểu hiện protein tỏi tổ hợp bởi E.coli như TA vector, pDriver vector, Teasy vector, pET vector...
* Vector tỏch dũng.
Vector tỏch dũng là một phõn tử DNA cú kớch thước nhỏ cho phộp cài một đoạn DNA ngoại lai vào nhằm mục đớch nhõn đoạn DNA ngoại lai lờn với số lượng lớn
Cỏc đặc điểm cần cú của một vector tỏch dũng: • Cú khả năng cài gắn cỏc đoạn DNA ngoại lai • Cú kớch thước nhỏđể xõm nhập vào tế bào chủ
• Cú thể tỏi bản độc lập khụng phục thuộc vào bộ gen vật chủ
• Cú chứa gen chỉ thị, chọn lọc (gen khỏng khỏng sinh, gen chỉ thị
màu…)
Hệ vector pGEX là một trong những hệ vector được sử dụng rộng rói nhất cho biểu hiện protein tỏi tổ hợp bởi E.coli.
*Cơ chế phõn tử của biến nạp ở vi khuẩn .
Cơ chế biến nạp chủ yếu bao gồm việc vi khuẩn thể nhận tiếp nhận DNA của thể cho (gọi là đoạn ngoại lai, exogenote) và sau đú DNA này cú thể trao đổi với đoạn DNA tương đồng của thể nhận (gọi là đoạn nội tại,
endogenote) bằng trao đổi chộo. Những tế bào cú khả năng tiếp nhận DNA gọi là cỏc tế bào khả biến (competent). Tế bào vi khuẩn nhận đoạn ngoại lai lỳc đú cú bộ gen ở trạng thỏi lưỡng bội một phần (merodiploid) hay hợp tử
chuyển chỉ một phần vật chất di truyền như thế được gọi là sự giao nạp hay
tiếp hợp từng phần (meromixis).
Tương tự như trong tiếp hợp và tải nạp, để lập bản đồ di truyền bằng biến nạp cần cú cỏc tế bào thể cho và thể nhận cú cỏc kiểu gen khỏc nhau. Về
mặt thực nghiệm, DNA được tỏch ra từ cỏc tế bào thể cho, sau đú được đưa vào quần thể cỏc thể bào thể nhận. Cỏc tế bào thể nhận sẽ tiếp nhận cỏc đoạn DNA một cỏch ngẫu nhiờn. Khụng phải tất cả cỏc loài vi khuẩn đều cú khả (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
năng tiếp nhận DNA. Ngay cả những loài cú khả năng này cũng chỉ cú thể
tiếp nhận được DNA ở những pha sinh trưởng nhất định và trong mụi trường nuụi cấy cụ thể. Cỏc loài Streptoccocus pneumoniae (tức Diplococcus) và Bacillus subtilis tương đối dễ dàng trở thành khả biến hơn, trong khi E. coli phải mất đi hai loại enzym exonuclease và phải được nuụi cấy trong mụi trường cú nồng độ cao của calcium chloride để làm cho màng tế bào của nú cú thể thấm được DNA. Do vậy để lập bản đồ gene ở E. coli người ta ưa dựng tiếp hợp và tải nạp hơn. Tuy nhiờn, trong cụng nghệ DNA tỏi tổ hợp, biến nạp
E. coli là một khõu rất quan trọng.
Để biến nạp cú thể xảy ra với hiệu quả cao ở vi khuẩn, chẳng hạn B. subtilis, DNA biến nạp phải cú mạch kộp và phõn tử lượng tương đối cao (1.106 dalton). Khi DNA xuyờn qua màng tế bào của vi khuẩn khả biến thỡ một trong cỏc sợi của DNA bị phõn huỷ. Sau đú sợi đơn DNA chuyển sang cú thể trao đổi với nhiễm sắc thể thể nhận ở vựng tương đồng. Sự kiện này cú thể
phỏt hiện được nhờ những khỏc biệt di truyền thớch hợp giữa cỏc tế bào thể
cho và thể nhận.
Túm lại, hiệu quả của biến nạp phụ thuộc vào ba yếu tố: (i) Tớnh dung nạp hay khả biến của tế bào thể nhận. (ii) Kớch thước của đoạn DNA được biến nạp. (iii) Nồng độ của DNA.
Cơ chế phõn tử của biến nạp
(i) DNA sợi kộp tế bào vi khuẩn cho S xõm nhập qua màng tế bào vi khuẩn nhận R, với một sợi đơn bị phõn huỷ bởi nuclease.
(ii) DNA thể nhận R biến tớnh ở vựng tương đồng để bắt cặp hay tiếp hợp (synapsis) với đoạn DNA sợi đơn cũn lại của thể cho S. Để cú thể tỏi tổ hợp bỡnh thường ở vi khuẩn cần cú protein được mó hoỏ bởi gen recA+.
(iii) Phõn tử DNA với đoạn lai (heteroduplex) "R-S" tỏi bản tạo ra hai DNA sợi kộp con: một sợi kộp "R-R" và một sợi kộp khỏc cú mang đoạn DNA thể
nhận "S-S", tất cả cú hai sợi đơn giống nhau (homoduplex).
Xỏc định liờn kết gen bằng biến nạp
Trong quỏ trỡnh tỏch chiết DNA để tiến hành biến nạp, nhiễm sắc thể của vi khuẩn thường bị đứt ra thành khoảng 250 đoạn (cỏc phõn tử riờng biệt). Cỏc gen nằm ở những vị trớ khỏc nhau trờn nhiễm sắc thể vi khuẩn khi đú sẽ
bị tỏch rời nhau và được truyền đi trong quỏ trỡnh biến nạp một cỏch độc lập. Vỡ số gen ở vi khuẩn rất lớn mà sốđoạn DNA lại hạn chế nờn khụng loại trừ
cỏc trường hợp hai gen khỏc nhau cựng nằm trờn một đoạn DNA, và vỡ vậy, cựng được chuyển đi. Trờn thực tế những trường hợp như thế đó quan sỏt thấy ở hàng loạt vi khuẩn và gọi là biến nạp liờn kết. Cú thể phỏt hiện được biến nạp liờn kết bằng cỏch xỏc định tần số biến nạp kộp (biến nạp đồng thời hai gen hay đồng biến nạp, cotransformed) và so sỏnh nú với trị số kỳ vọng khi hai gen được truyền đi một cỏch độc lập. Trong thớ nghiệm người ta xỏc
định sự liờn kết gen bằng cỏch phỏt hiện hiệu quả pha loóng DNA. Trong một giới hạn nào đú của nồng độ DNA thỡ tần số biến nạp tỉ lệ tuyến tớnh với nồng
độ DNA. Nếu hai gen nằm trờn cựng một đoạn DNA thỡ sự biến đổi tần số
là do hai đoạn DNA khỏc nhau cựng chui vào tế bào (khụng liờn kết) thỡ
đường cong biến đổi của tần số biến nạp kộp sẽ cú độ dốc rừ rệt hơn so với biến nạp đơn.
1.4.7. Kỹ thuật sắc ký miễn dịch:
Ngày nay kỹ thuật sắc ký miễn dịch (immunochromatographic) đang được sử dụng rất rộng rói trong cỏc nghiờn cứu và chẩn đoỏn như que thử nhanh phỏt hiện khỏng nguyờn bề mặt (HbsAg) của vius viờm gan B, hay que thử nhanh
để phỏt hiện V. cholerae O1 và O139 trong cỏc mẫu bệnh phẩm lõm sàng (Crystal Vc, dipstick)…
Ở nghiờn cứu của chỳng tụi việc thiết kế vector biểu hiện để sản xuất protein tỏi tổ hợp độc tố EltB của ETTEC là một trong những bước đi đầu tiờn cho nghiờn cứu tiếp theo nhằm chế tạo que thử nhanh phỏt hiện độc tố LT của ETEC trong thực phẩm và dựa trờn nguyờn lý của kỹ thuật sắc ký miễn dịch này.
Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.1. Đối tượng nghiờn cứu
2.1.1. Chủng vi khuẩn và plasmid
- Tế bào vi khuẩn khả biến Escherichia coli chủng DH5α sử dụng cho mục đớch tỏch dũng và biểu hiện protein EltB.
- Tế bào biểu hiờn protein BL21. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Chủng ETEC chuẩn KNH 172 0148 mang gen độc tố LT. - Vector biểu hiện pGEX.
2.1.2. Húa chất, mỏy múc và thiết bị
* Húa chất:
- Dung dịch tỏch chiết DNA: TE (Tris- EDTA). - Dung dịch CaCl2 0,1M.
- Taq DNA polymerase. - Bigdye PCR.
- Ligation kit (Promega). - Nước khử ion.
- Khỏng sinh ampicillin (Sigma).
- Enzym cắt giới hạn (BamHI và XhoI). - Thạch điện di Agarose.
- Ethidium bromide. -Acrylamide (Sigma). -Bis-acrylamide (Sigma).
-Đệm resolving Gel (1.5M Tris-HCl, pH8.8). -Đệm Stacking Gel (0.5M Tris-HCl, pH6.8). -10% SDS (Invitrogen). -10% APS (Sigma). -TEMED (Sigma). -Dung dịch điện di 5X Electrode (pH 8.3). Tris base 15g Glycine 72g SDS 5g H20 cất vừa đủ 1000ml - Dung dịch nhuộm protein: Xanh Coomassie. - Acetic acid.
- Dung dich rửa gel SDS (40% Methanol, 10% acetic acid). - Skill milk (Sigma).
- Tween 20 (Sigma).
- Đệm PBS 1X cho kỹ thuật chuyểnmàng và làm kỹ thuật western- blotting…..
- Detection kit cho western-blotting (Amersham). - Phim cho western blotting (Amersham).
- Khỏng thể thỏđặc hiệu khỏng LT (Sigma). - Khỏng thể khỏng IgG thỏ gắn Enzyme (Sigma).
* Mỏy múc và thiết bị
- Mỏy PCR System 9700 (Applied Biosystem, Mỹ). - Mỏy đọc trỡnh tự gen ABI (Applied Biosystem). - Mỏy điện di ngang Mupid (Nhật Bản).
- Mỏy điện di đứng (BioRad).
- Mỏy soi gel và chụp ảnh tựđộng: Chemidoc EQ- Bio-Rad (Mỹ). - Mỏy Vortex (Mimishaker, IKA, CHLB Đức.
- Mỏy ly tõm lạnh Beckman (USA) và mỏy ly tõm để bàn Eppendorf (Đức). - Mỏy đo nồng độ DNA và độđục vi khuẩn Eppendorf (Đức).
- Tủ lạnh sõu -30oC và -80oC (SANYO), tủấm. - Lũ vi súng (SamSung). - Lũ hấp ướt: ALP (Nhật Bản). - Pipet định mức, đầu cụn cỏc loại, ống PCR, ống eppendorf loại 1,5ml, 0,2 ml, ống Falcon, găng tay, giấy thấm. 2.1.3. Mụi trường và đệm
- Mụi trường LB (Luria- Bertani) lỏng: Tryptone: 10g Nacl: 10g Yeast: 5g H2O: vừa đủ 1000ml Khử trựng 121o C/20 phỳt - Mụi trường thạch LB: 200ml LB đặc
4g agarose→ mụi trường LB đặc 2% Khử trựng 121o C/20 phỳt
2.1.4. Cặp mồi sử dụng
Cặp mồi sử dụng trong nghiờn cứu này để tạo cỏc điểm cắt của hai enzym giới hạn là XhoI- R và BamHI – F ở hai đầu đoạn gen mó hoỏ cho protein EltB cú trỡnh tự như sau:
5’- CGCGGATCCGGAGCTCCTCAGTCTATTA- 3’ EltB BamHI-F 5’- CCGCTCGAGGTTTTCCATACTGATTGCCG- 3’ EltB XhoI-R
2.2. Phương phỏp nghiờn cứu
2.2.1 Sơđồ nghiờn cứu
Hỡnh 2.1. Sơđồ cỏc bước tiến hành nghiờn cứu 2.2.2. Cỏc phương phỏp tiến hành nghiờn cứu
2.2.2.1. Khuếch đại đoạn gen nạp EltB bằng kỹ thuật PCR (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
● Tỏch chiết DNA khuụn mẫu từ chủng ETEC.
- Cấy chủng chuẩn E.coli trờn đĩa thạch LB sau đú ủở 37 oC qua đờm. Khuyếch đại gen EltB bằng
kỹ thuật PCR
Tỏch dũng gen EltB
Đưa gen EltB vào vector biểu hiện pGEX
Kiểm tra vector biểu hiện chứa gen EltB
Biểu hiện protein tỏi tổ hợp
EltB trờn tế bao E.coli BL21
Kiểm tra Protein EltB bằng kỹ biến thuật Western blot
- Sau khi khuẩn lạc mọc, lấy một khuẩn lạc từđĩa thạch LB cấy sang mụi trường LB lỏng, lắc ở 37 oC/180 vũng/phỳt (v/p) trong12giờ.
- Lấy dịch khuẩn đó nuụi qua đờm cho vào ống falcol 5ml, ly tõm 3000 v/p trong 5 phỳt. Thu lấy cặn vi khuẩn ở đỏy ống.
- Thờm vào 900ul dung dịch Trizol + 200ul chloroform: isoamylalcohol, vortex kỹ trong 5 phỳt.
- Ly tõm ở tốc độ 13.000v/p trong 10 phỳt.
- Thu dịch nổi cú chứa DNA vào một ống eppendorf 1,5ml khỏc. - Thờm một thể tớch isopropanol lạnh và đểở -20oC trong 1 giờ. - Ly tõm với tốc độ 13.000v/p trong 10 phỳt, loại bỏ dịch nổi - Thờm vào 1ml ethanol 70%.
- Ly tõm ở tốc độ 13.000v/p trong 5 phỳt, loại bỏ dịch nổi, để khụ. - Hũa cặn DNA trong 20ul TE, giữở nhiệt độ -20oC.
● Thực hiện phản ứng PCR: Phản ứng PCR được tiến hành với cỏc thành phần như sau: Thành phần Thể tớch (àl) Dung dịch đệm (10X) 1 dNTPs 1 Primer BamHI- F 0,5 Primer XhoI- R 0,5
Taq DNA polymerase 0,1
DNA plasmid 1 (200ng/ml)
Nước khử ion vụ trựng 5,9
Chu trỡnh nhiệt của phản ứng PCR: 950 C : 5 phỳt 940C : 30 giõy 640C : 30 giõy 30 chu kỳ 720C : 1 phỳt 720C : 3 phỳt
● Chạy điện di và tinh sạch đoạn gen EltB
- Điện di sản phẩm PCR trờn thạch agarose 1,5% trong 30 phỳt ở hiệu
điện thế 100V, nhuộm gel trong dung dịch Ethidium brommide. Chụp ảnh để
ghi lại kết quảđiện di bằng hệ thống mỏy Genedoc, BioRad.
- Tinh sạch sản phẩm PCR bằng kớt tinh sạch DNA của QIAGEN
2.2.2.2. Nuụi cấy và tinh sạch Plasmid pGEX
- Chủng E. Coli DH5α cú chứa plasmid pGEX được nuụi cấy qua đờm trờn mụi trường canh thang LB cú chứa 100àg ampicillin/lit.
- Lấy huyền dịch khuẩn đó nuụi qua đờm cho vào Eppendorf 2ml, ly tõm 8000 v/p trong 5 phỳt. Thu lấy cặn vi khuẩn ởđỏy ống.
- Thờm 100μl dung dịch Sol I (50 mM glucose, 25 mM Tris-HCl (pH 8), 10 mM EDTA (pH 8)), hoà tan cho cặn tan hoàn toàn.
- Bổ sung 200μl dung dịch Sol II (0,2N NaOH; 1% SDS (trọng lượng/ thể tớch: w/v)), đảo nhẹ. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Thờm 150μl dung dịch Sol III (60 ml CH3COOK 5M; 11,5 ml CH3COOH; 28,5 ml nước), đảo nhẹ rồi đặt trong đỏ 5 phỳt.
- Ly tõm 13000 v/p trong 10 phỳt. Thu dịch nổi.
- Ly tõm 13000 v/p trong 10 phỳt. Chuyển pha trờn sang ống Eppendorf 1.5ml mới.
- Bổ sung dung dịch isopropanol lạnh theo tỷ lệ 1:1, ủ ớt nhất 20 phỳt. - Ly tõm 13000 v/p trong 10 phỳt. Thu kết tủa.
- Rửa kết tủa 2 lần bằng 500μl ethanol 70%, ly tõm 7000 v/p trong 1 phỳt.