Nhờ đặc tớnh của cỏc enzym cắt giới hạn (restriction enzyme) là cú vị
trớ nhận biết điểm cắt DNA đặc hiệu, nờn enzym XhoI và BamHI cú thể cắt sản phẩm PCR thành cỏc đầu dớnh XhoI và BamHI ở đầu 5’ và 3’. Đồng thời,
XhoI và BamHI cũng tạo đầu dớnh 5’ và 3’ khi xử lý với vector. Tớnh bổ sung giữa những phần nhụ ra (overhang) và cỏc trỡnh tự bổ sung cho phộp gen EltB cú thể hũa nhập với vector thành vector tỏi tổ hợp một cỏch dễ dàng dưới tỏc dụng của enzym DNA ligase.
Vector tỏi tổ hợp này cú khả năng phõn chia độc lập trong tế bào chủ
E.coli tạo thuận lợi cho việc chọn lọc và tỏch dũng vector chứa gen EltB trong mụi trường chứa khỏng sinh ampicillin và cỏc chất cảm ứng.
Sử dụng kỹ thuật PCR để kiểm tra đoạn gen đó biến nạp vào vector. Ở
hỡnh 3.4 cho thấy cỏc giếng số 1-6, 7-12, 14 cú sản phẩm PCR là một băng rừ nột, kớch thước khoảng 312 bp tương đương kớch thước ở giếng cú chứng
dương đó được đỏnh dấu, chứng tỏ đoạn gen EltB đó được biến nạp vào vector pGEX thành cụng.
Kỹ thuật cắt enzym giới hạn tiếp tục được sử dụng để kiểm tra kớch thước của vector tỏch dũng và kớch thước của đoạn gen EltB sau biến nạp. Kết quả ở hỡnh 3.5 cho thấy sản phẩm cắt enzym sau khi điện di trờn gel agarose cho 1 băng cú kớch thước 312 bp tương tương kớch thước của gen EltB và một băng cú kớch thước khoảng 4900 bp tương đương kớch thước của vector pGEX. Điều đú chứng tỏ sự biến nạp gen EltB vào vector pGEX đó thành cụng.
Gen EltB sau khi biến nạp được tiến hành giải trỡnh tự gen trờn mỏy đọc trỡnh tự gen ABI (Applied Biosystem). Kết quả thu được ở hỡnh 3.6 sau khi so sỏnh với ngõn hang Genebank cho thấy độ tương đồng là 100%. Điều này chứng tỏđoạn gen thu được khụng bị đột biến đảm bảo cho bước biểu hiện protein tỏi tổ hợp tiếp theo.
Như vậy, qua kết quả kiểm tra sự cú mặt của đoạn gen EltB trong vector pGEX bằng 3 phương phỏp PCR, enzym cắt giới hạn và giải trỡnh tự gen chứng minh rằng việc tỏch dũng đoạn gen EltB độc tố khụng chịu nhiệt LT của ETEC đó thành cụng.