ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) là kỹ thuật miễn dịch
được sử dụng tương đối rộng rói để xỏc định cỏc độc tố LT và ST của ETEC cũng như dựng để phỏt hiện nhanh cỏc chủng E. coli khỏc thuộc nhúm EPEC và EHEC [35].
Kỹ thuật ELISA dựa trờn nguyờn lý: Khỏng nguyờn (KN) + Khỏng thể
(KT) + khỏng thể gắn enzym + chất phỏt triển màu mà qua đú chỳng ta cú thể
phỏt hiện được. Kỹ thuật này bao gồm cỏc bước như sau:
(1) Khỏng nguyờn - antigen chưa biết được gắn trờn một bề mặt.
(2) Ủ khỏng thể phỏt hiện - (detection antibody) biết trước được ủ trong giếng để phỏt hiện khỏng nguyờn qua bề mặt đú. Khỏng thể này được gắn kết với enzym.
(3) Ủ khỏng thể thứ 2 hay cũn gọi là khỏng thể cộng hợp (conjugate antibody) cú gắn enzym.
(4) Cơ chất (substrate); enzym sẽ biến đổi cơ chất này và chỳng ta cú thể
xỏc định được qua sự tạo màu của phức hợp KN+ KT+KT gắn enzym. Với nguyờn lý trờn, ELISA giỳp xỏc định được sự cú mặt hay khụng cú mặt của KN trong mẫu nghiờn cứu.
1.4.4.1. ELISA giỏn tiếp (indirect ELISA)
Kỹ thuật này bao gồm cỏc bước như sau:
(1) Gắn KN đó biết lờn bề mặt cứng (giếng ELISA). KN sẽđược cốđịnh trờn bề mặt. Nồng độ của cỏc mẫu khỏng nguyờn này dựng để thiết lập đường chuẩn cho việc tớnh nồng độ của khỏng nguyờn trong cỏc mẫu chưa biết.
(2) Nhỏ cỏc mẫu KN chưa biết cần phỏt hiện vào cỏc giếng khỏc. KN chưa biết được hũa tan trong cựng một loại dung dịch đệm giống cỏc mẫu KN chuẩn (thường là đệm PBS).
interacting protein) như albumin huyết thanh bờ (bovine serum albumin) hay casein vào tất cả cỏc mẫu (kể cả mẫu chuẩn), do cỏc protein này cú tỏc dụng bịt lại cỏc lỗ trống của giếng ELISA cũn lại sau khi gắn khỏng nguyờn qua đú sẽ
ngăn cản sự hấp phụ của cỏc khỏng thể lờn bề mặt của giếng để trỏnh tạo ra hiện tượng dương tớnh giả.
(4) Nhỏ khỏng thể phỏt hiện (khỏng thể thứ nhất) vào tất cả cỏc giếng của đĩa. KT sẽ kết hợp với cỏc KN đó được cố định mà khụng kết hợp với protein của được sử dụng để bịt cỏc khoảng trống của giếng.
(5) Thờm KT thứ hai cú gắn enzym (secondary antibody), để tạo thành phức hợp KN+KT+KT gắn enzym (bước này cú thể được bỏ qua nếu khỏng thể dựng để phỏt hiện KN đó gắn với enzym).
(6) Rửa đĩa, để loại bỏ cỏc khỏng thể gắn enzym cũn thừa.
(7) Thờm cơ chất, enzyme sẽ làm biến đổi cơ chất làm sản sinh tớn hiệu huỳnh quang hay tớn hiệu điện húa học (enzym cú tỏc dụng như yếu tố
khuyếch đại, tạo màu).
Nhược điểm cơ bản: Bước cốđịnh KN khụng cú tớnh đặc hiệu nờn bất kỳ protein nào cũng gắn với bề mặt đĩa vỡ vậy KT (cú nồng độ thấp) phải cạnh tranh với cỏc protein khỏc trong huyết thanh khi gắn kết với bề mặt của đĩa. Sandwich ELISA hạn chếđược nhược điểm này.
1.4.4.2. ELISA kẹp chả (Sandwich ELISA)
Phương phỏp được sử dụng để phỏt hiện KN trong mẫu nghiờn cứu và bao gồm cỏc bước cơ bản sau (quy trỡnh cú thể được thay đổi trong nhiều trường hợp) theo nguyờn lý khỏng nguyờn cần phỏt hiện sẽđược kẹp vào giữa hai khỏng thể tao phức hợp: KT+KN+KT cú gắn Enzyme. Cỏc bước của kỹ
thuật này cú thể túm tắt như sau:
(2) Phủ bản bằng bằng cỏc dung dịch protein khụng tương tỏc (non- interacting protein) như albumin huyết thanh bờ (bovine serum albumin) hay casein.
(3) Nhỏ cỏc mẫu chứa khỏng KN cần xỏc định
(4) Rửa đĩa, khỏng KN khụng được gắn kết sẽ bị rửa trụi (5) Thờm cỏc KT đặc hiệu cho KN cần chẩn đoỏn
(6) Thờm KT thứ cấp đó được gắn với enzym (KT thứ cấp đặc hiệu cho KT sơ cấp ở bước 5)
(7) Rửa đĩa, phần khụng gắn kết sẽ bị rửa trụi.
(8) Thờm cơ chất. Enzym sẽ biến đổi cơ chất tạo màu, phỏt quang hay tớn hiệu húa điện. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(9) Đo cường độ ỏnh sỏng, tớn hiệu huỳng quang, tớn hiệu điện húa... qua đú xỏc định sự cú mặt và hàm lượng KT.
Hỡnh 1.3. Cỏc bước trong Sandwich ELISA.
(1) Phủđĩa bằng KT; (2) Thờm mẫu cần xỏc định KN. KN (nếu cú) sẽ gắn với KT; (3) khỏng thể dựng để phỏt hiện được thờm vào và kết hợp với KN; (4)
Thờm KT thứ cấp liờn kết với enzym, KT thứ cấp sẽ gắn với KT dựng để phỏt hiện; (5) Thờm cơ chất, Enzym sẽ làm biến đổi cơ chất và phỏt tớn hiệu cú thể
phỏt hiện và đo được.
1.4.4.3. ELISA cạnh tranh (compartative ELISA)
(1) "Ủ" KT khụng được đỏnh dấu với KN.
(2) Nhỏ hỗn hợp này vào cỏc giếng của vi phiếm cú chứa KN.
(3) Rửa đĩa, KT khụng được gắn kết sẽ bị rửa trụi. Lượng KN càng lớn, lượng KT gắn thành cụng với KN trong đĩa càng thấp do "cạnh tranh".
(4) Thờm KT thứ cấp (KT của KT ở bước 1). KT thứ cấp gắn với enzym. (5) Thờm cơ chất. Lượng enzym cũn dư sẽ giải phúng tớn hiệu huỳnh quang hay tớn hiệu màu.
Trong phương phỏp này, hàm lượng KN gốc càng cao, tớn hiệu sản sinh càng yếu.
Một số trường hợp, enzym được gắn với KN chứ khụng phải KT. Hiện nay ở hầu hết cỏc phũng thớ nghiệm VSATTP ở Việt nam chưa phỏt hiện được độc tố khụng chịu nhiệt LT của E.coli trong thực phẩm. Tại viện dinh dưỡng quốc gia đó cú một đề tài nghiờn cứu sử dụng kỹ thuật ELISA để phỏt hiện độc tố LT trong thực phẩm, tuy nhiờn do kỹ thuật này cũn tương đối phức tạp, tốn nhiều thời gian hơn so với que thử nhanh và giỏ thành cao nờn vẫn chưa được ỏp dụng rộng rói tại Việt Nam.