Chủng vi khuẩn E.coli DH5α cú chứa plasmid pGEX- EltB được nuụi cấy qua đờm trong mụi trường canh thang LB cú chứa 100àg ampicillin để tỏch chiết plasmid nhưở phần phương phỏp sau đú sẽđược biến nạp sang tế bào biểu hiện protein E. coli BL21 và sẽ được kiểm tra lại sự cú măt của đoạn gen EltB trong plasmids của tế bào biếu hiện protein bằng kỹ thuõt PCR (hỡnh 3.7)
1 2 3 4 5 M
Hỡnh 3.7. Sản phẩm kiểm tra biến nạp bằng kỹ thuật PCR.
M: Marker 100 bp; 1: chứng dương; 2-5: Sản phẩm biến nạp plasmid pGEX- EltB vào tế bào biểu hiện E.Coli BL21.
Nhận xột: Sản phẩm thu được ở cỏc giếng từ 2-5 là một băng rừ nột cú kớch thước tương đương với kớch thước ở chứng dương ở giếng số 1 (khoảng
312 bp) và khụng cú sản phẩm phụ. Như vậy chỳng tụi đó biến nạp plasmid pGEX- EltB vào tế bào biểu hiện protein E.Coli BL21 thành cụng.
3.5.2. Biểu hiện protein tỏi tổ hợp EltB
Chủng vi khuẩn E.Coli BL21- pGEX- EltB được nuụi cấy trong mụi trường canh thang LB- ampicillin 100 cho đến khi đạt đến nồng độ OD= 0,5- 0,7 thỡ tiến hành cỏc bước để biểu hiện protein tỏi tổ hợp EltB như ở phần phương phỏp.
Sau khi thu hoạch protein tỏi tổ hợp EltB được phõn tớch bằng điện di trờn gel SDS- polyacrylamide 12% và nhuộm gel bằng Coomasie Blue R250 ta thu được sản phẩm sau:
1 2 3 4 5 6 7
Hỡnh 3.8. Protein tỏi tổ hợp từ vi khuẩn E. coli BL21 mang vector pGEX-LtB.
1: protein trước khi tinh sạch; 2 ữ7: protein đó được tinh sạch từ cột sắc ký ỏi lực ở cỏc phõn đoạn khỏc nhau..
Nhận xột: Ở trong tế bào biểu hiện E. coli BL21Plasmid pGEX-EltB
dưới sự điều khiển của Tac promoter và chất kớch thớch sản xuất protein ITPG. Tại kết quả từ hỡnh 3.8 cho thấy chỳng tụi đó tỏch chiết thành cụng protein tỏi tổ hợp EltB, cú kớch thước 28kDa.
3.5.3. Kiểm tra protein EltB bằng Western blot
Đểđảm bảo chắc chắn đõy cú phải là protein tỏi tổ hợp EltB hay khụng chỳng tụi tiến hành kiểm tra với khỏng thểđặc hiệu khỏng LT của hóng Sigma bằng kỹ thuật Western-blotting
1 2 3 4 5 P
Hỡnh 3.9. Kiểm tra chất lượng protein EltB tỏi tổ hợp bằng kỹ thuật western blotting.
1-4: protein EltB sản xuất trong nghiờn cứu; 5 chứng õm (protein BSA); P: chứng dương EltB (Sigma)
Nhận xột: Kết quả hỡnh 3.9 cho thấy protein tỏi tổ hợp chỳng tụi sản xuất chớnh là độc tố EltB của vi khuẩn ETEC được cú phản ứng đặc hiệu với khỏng thể khỏng LT của hóng Sigma và khi được làm song song với độc tố
EltB chuẩn của hóng Sigma.
Chương 4 BÀN LUẬN
4.1. Khuyếch đại đoạn gen biến nạp EltB bằng kỹ thuật PCR
4.1.1. Thiết kế mồi
Để biểu hiện được protein này thỡ phần quan trọng nhất là phải thiết kế được cỏc đoạn mồi đặc hiệu với cỏc tiờu chớ sau:
• 60 nucleotid đầu tiờn là phần kỵ nước (hydrophobic) được loại bỏ
nhằm giỳp cho protein tỏi tổ hợp EltB trong nghiờn cứu sẽ tan trong nước tốt hơn (khụng bị vún cục hoặc bọc trong cỏc tỳi “inclusion bodies” của tế bào biểu biện E. coli BL21) qua đú sự tổng hợp
EltB cú hiệu suất cao và EltB được tỏch chiết dễ dàng hơn, nhưng vẫn đảm bảo được hoạt tớnh sinh học.
• Đoạn mồi được thiết kế với cỏc enzym giới hạn: XhoI và BamHI là
cỏc enzym dễ cắt, khụng cú trong trỡnh tự gen EltB của ETEC và là cỏc enzym cắt duy nhất ở vị trớ MCS (multiple cloning site) của vector pGEX.
• Cho thờm cỏc nucleotid vào đầu của cỏc đoạn mồi để tạo điểm bỏm cho cỏc enzym và sẽ hiệu suất cắt của cỏc enzym sẽđược tốt hơn. Sau đú, qui trỡnh khuyếch đại đoạn gen EltB được xõy dựng và tối ưu húa. Kết quả thu được ở hỡnh 3.1 cho thấy DNA tỏch được đạt yờu cầu, gồm một băng rừ nột kớch thước 312bp tương đương kớch thước của gene EltB, khụng cú sản phẩm phụ chứng tỏ cặp mồi chỳng tụi thiết kế là thành cụng.
4.1.2. Tỏch chiết DNA khuụn mẫu từ chủng ETEC
Việc thu nhận DNA từ tế bào vi khuẩn được tiến hành thụng qua nhiều bước. Cỏc giai đoạn cơ bản của tỏch chiết DNA bao gồm: (1) Phỏ màng tế
bào và màng nhõn, (2) Loại protein, (3) Tủa DNA. DNA khuụn mẫu của chủng ETEC sau khi tỏch chiết được kiểm tra độ tinh sạch bằng mỏy quang phổ Narodrop. Cỏc protein cú mức hấp thụ cao nhất ở bước súng 280nm, nhưng cũng hấp thụ ỏnh sỏng ở bước súng 260 nm như cỏc acid nucleic. Do
đú, giỏ trị thật của nồng độ acid nucleic bị sai lệch. Một dung dịch acid nucleic đạt tiờu chuẩn về độ sạch (khụng tạp nhiễm protein) khi tỷ số
OD260nm/OD280nm nằm trong khoảng 1,8-2. Ở nghiờn cứu này, dung dịch DNA tỏch chiết cú nồng độ 192ng/àl với tỷ lệ OD260/OD280 = 1,79. Như vậy cú thể
núi rằng quy trỡnh tỏch chiết được ỏp dụng trong nghiờn cứu này là tối ưu và sản phẩm đó đạt chất lượng đảm bảo cho cỏc quy trỡnh tiếp theo.
4.1.3. Thực hiện phản ứng PCR
Nhiều chu trỡnh nhiệt khỏc nhau đó được thử nghiệm với cỏc thành phần phản ứng đó nờu ở phần phương phỏp và cuối cựng đưa ra được một chu trỡnh tối ưu đó được ấn định ỏp dụng để cú sản phẩm PCR đảm bảo chất lượng. Trong nghiờn cứu này, sản phẩm PCR khuyếch đại đoạn gen EltB được điện di cho kết quả là một băng rừ nột cú kớch thước khoảng 312bp tương đương kớch thước của gen EltB, khụng bịđứt gẫy, khụng cú sản phẩm phụ.
4.2. Nuụi cấy và tinh sạch plasmid pGEX
4.2.1. Lựa chọn vector tỏch dũng
E.coli chớnh là một trong những vật chủđược sử dụng nhiều nhất để biểu hiện protein tỏi tổ hợp invitro. Tuy nhiờn khú khăn chớnh là việc giữ được hoạt tớnh của cỏc protein sau khi biểu hiện bởi E.coli. Cú rất nhiều hệ vector
được sử dụng cho tỏch dũng và biểu hiện protein tỏi tổ hợp bởi E.coli như TA vector, pDriver vector, Teasy vector, pET vector...Một vector tỏch dũng cần cú những đặc điểm sau: (1) Cú khả năng cài gắn cỏc đoạn DNA ngoại lai. (2) Cú kớch thước nhỏ để xõm nhập vào tế bào chủ. (3) Cú thể tỏi bản độc lập khụng phục thuộc vào bộ gen vật chủ. (4) Cú chứa gen chỉ thị, chọn lọc (gen khỏng khỏng sinh, gen chỉ thị màu…)
Trong nghiờn cứu này pGEX được lựa chọn vỡ vector này đó và đang
được sử dụng rộng rói nhất cho biểu hiện protein tỏi tổ hợp bởi E.coli và cú
đầy đủ cỏc đặc điểm của một vector tỏch dũng như: cú kớch thước nhỏ, dễ
tỏch chiết và cú gen khỏng ampicilline là một khỏng sinh thụng dụng rẻ tiền, mua dễ dàng (giảm giỏ thành nghiờn cứu). Sử dụng gen điều khiển tac promoter để tổng hợp protein EltB hiệu suất cao, dễ tỏch chiết qua cột GST (Glutathione S- Transferase).
4.2.2. Biến nạp đoạn gen EltB vào vector pGEX
Nhờ đặc tớnh của cỏc enzym cắt giới hạn (restriction enzyme) là cú vị
trớ nhận biết điểm cắt DNA đặc hiệu, nờn enzym XhoI và BamHI cú thể cắt sản phẩm PCR thành cỏc đầu dớnh XhoI và BamHI ở đầu 5’ và 3’. Đồng thời,
XhoI và BamHI cũng tạo đầu dớnh 5’ và 3’ khi xử lý với vector. Tớnh bổ sung giữa những phần nhụ ra (overhang) và cỏc trỡnh tự bổ sung cho phộp gen EltB cú thể hũa nhập với vector thành vector tỏi tổ hợp một cỏch dễ dàng dưới tỏc dụng của enzym DNA ligase.
Vector tỏi tổ hợp này cú khả năng phõn chia độc lập trong tế bào chủ
E.coli tạo thuận lợi cho việc chọn lọc và tỏch dũng vector chứa gen EltB trong mụi trường chứa khỏng sinh ampicillin và cỏc chất cảm ứng.
Sử dụng kỹ thuật PCR để kiểm tra đoạn gen đó biến nạp vào vector. Ở
hỡnh 3.4 cho thấy cỏc giếng số 1-6, 7-12, 14 cú sản phẩm PCR là một băng rừ nột, kớch thước khoảng 312 bp tương đương kớch thước ở giếng cú chứng
dương đó được đỏnh dấu, chứng tỏ đoạn gen EltB đó được biến nạp vào vector pGEX thành cụng.
Kỹ thuật cắt enzym giới hạn tiếp tục được sử dụng để kiểm tra kớch thước của vector tỏch dũng và kớch thước của đoạn gen EltB sau biến nạp. Kết quả ở hỡnh 3.5 cho thấy sản phẩm cắt enzym sau khi điện di trờn gel agarose cho 1 băng cú kớch thước 312 bp tương tương kớch thước của gen EltB và một băng cú kớch thước khoảng 4900 bp tương đương kớch thước của vector pGEX. Điều đú chứng tỏ sự biến nạp gen EltB vào vector pGEX đó thành cụng.
Gen EltB sau khi biến nạp được tiến hành giải trỡnh tự gen trờn mỏy đọc trỡnh tự gen ABI (Applied Biosystem). Kết quả thu được ở hỡnh 3.6 sau khi so sỏnh với ngõn hang Genebank cho thấy độ tương đồng là 100%. Điều này chứng tỏđoạn gen thu được khụng bị đột biến đảm bảo cho bước biểu hiện protein tỏi tổ hợp tiếp theo.
Như vậy, qua kết quả kiểm tra sự cú mặt của đoạn gen EltB trong vector pGEX bằng 3 phương phỏp PCR, enzym cắt giới hạn và giải trỡnh tự gen chứng minh rằng việc tỏch dũng đoạn gen EltB độc tố khụng chịu nhiệt LT của ETEC đó thành cụng.
4.3. Biểu hiện Protein tỏi tổ hợp EltB.
4.3.1. Biến nạp vector tỏi tổ hợp vào tế bào E.coli khả biến bằng sốc nhiệt
Đõy là phương phỏp kinh điển được sử dụng phổ biến để biến nạp DNA plasmid vào tế bào E.coli. Cỏc tế bào được ủ trong dung dịch CaCl2 để trở
thành tế bào khả biến giỳp cho chỳng dễ tiếp nhận DNA plasmid. DNA plasmid được đưa vào tế bào bằng cỏch sốc nhiệt nhanh (40-60 giõy), cỏc tế
trờn đĩa agar chứa mụi trường LB với khỏng sinh thớch hợp. Mỗi khuẩn lạc trờn đĩa khỏng sinh đại diện cho một thể biến nạp đơn.
E.coli BL21 (DE3) là chủng vi khuẩn biểu hiện gen thường được sử
dụng khi biểu hiện 1 protein lạ và là vật chủ phự hợp cho biểu hiện protein khi dựng vector biểu hiện cú chứa promoter tac như vector pGEX. Hơn nữa chủng vi khuẩn E.coli BL21 (DE3) đó được biến đổi để tăng cường khả năng biểu hiện protein ngoại lai. Bởi vậy đõy là chủng phự hợp với đối tượng và mục đớch nghiờn cứu của đề tài.
Tế bào E.coli BL21 (DE3) khụng cú khả năng khỏng khỏng sinh ampicillin nờn sau khi biến nạp và nuụi cấy trải trờn mụi trường LB đặc cú bổ
sung ampicillin 100mg/l sẽ cú cỏc trường hợp sau xảy ra: (1) Cỏc tế bào khụng chứa vector tỏi tổ hợp sẽ khụng mọc được trờn mụi trường cú chứa khỏng sinh ampicillin. (2) Cỏc tế bào cú chứa vector tỏi tổ hợp EltB- pGEX mang gen mó húa cho EltB và cú gen khỏng khỏng sinh nờn mọc được trờn mụi trường chọn lọc. Trong nghiờn cứu này, khả năng chắc chắn đảm bảo cho sự biến nạp được plasmid pGEX- EltB vào tế bào E.coli BL21 dựa vào mụi trường chọn lọc cú ampicilline để lựa chọn khuẩn lạc cú vector pGEX-EltB, vỡ tế bào E. coli BL21 chỉ mọc được khi mang gen khỏng khỏng sinh của pGEX; sau đú kiểm tra cỏc tế bào biến nạp bằng kỹ thuõt PCR, kết quảở hỡnh 3.7 cho thấy sản phẩm thu được ở cỏc giếng từ 2-5 là một băng rừ nột cú kớch thước tương đương với kớch thước ở chứng dương ở giếng số 1 (khoảng 312 bp). Như vậy chỳng tụi đó biến nạp plasmid pGEX- EltB vào tế bào biểu hiện protein E.Coli BL21 thành cụng.
4.3.2. Kiểm tra sự biểu hiện của protein tỏi tổ hợp EltB
Gen EltB trong vector biểu hiện hoạt động dưới sự điều khiển của tac promoter và được kiểm soỏt chặt chẽ bởi chất cảm ứng IPTG (isopropyl-β-D- thiogalactoside) cú trong mụi trường. Do đú để nghiờn cứu sự biểu hiện của protein tỏi tổ hợp, vi khuẩn sau khi biến nạp thành cụng được nuụi cấy trong mụi trường LB lỏng cú khỏng sinh ampicillin và chất cảm ứng IPTG.
Trong nghiờn cứu này, để sự biểu hiện protein tỏi tổ hợp EltB hiệu quả
hơn chỳng tụi đó sử dụng chất cảm ứng ITPG để kớch thớch sự tổng hợp protein qua đú sẽ sinh được nhiều protein hơn. Sử dụng kớt chuẩn tỏch chiết protein GST(Glutathione S- Transferase) để tỏch. Protein sau tỏch chiết được rửa nhiều nhằm loại bỏ tối đa cỏc protein khụng phải EltB ra khỏi sản phẩm. Protein EltB thu được sẽ cú độ tinh sạch cao. Kết quả kiểm tra trờn hỡnh 3.8 cho thấy chỳng tụi đó tỏch chiết thành cụng protein tỏi tổ hợp EltB.
4.4. Kiểm tra mức độ biểu hiện protein EltB bằng Western blot
Kiểm tra mức độ biểu hiện của protein EltB bằng kỹ thuật Western- blotting với khỏng thểđặc hiệu khỏng LT của hóng Sigma song song với EtlB chuẩn, mục đớch là xem protein trong nghiờn cứu cú đỳng là EltB hay khụng. Kết quả ở hỡnh 3.9 cho thấy protein chỳng tụi tổng hợp được chớnh là protein
EltB tương đương với chứng dương của hóng Sigma.
Trong khuụn khổ của đề tài này những nghiờn cứu được thực hiện nhằm bước đầu biểu hiện protein tiểu đơn vị B độc tố khụng chịu nhiệt LT của ETEC trờn E.coli.
Trong nghiờn cứu tiếp theo chỳng tụi sẽ phải tối ưu húa cỏc điều kiện
để tế bào biểu hiện tổng hợp được EltB tỏi tổ hợp tốt nhất như: Tối ưu nhiệt
độ cảm ứng; Tối ưu nồng độ chất cảm ứng và thời gian cảm ứng trờn gen
này (khả năng gắn protein lờn thụ thể GM-1 của ruột non, khả năng sinh khỏng thể khỏng độc tố LT trờn mụ hỡnh động vật….)
Cỏc bệnh liờn quan đến thực phẩm hiện nay vẫn là một mối nguy cơ
chớnh tỏc động đến sức khỏe của con người ở trờn thế giới. Trong đú vi khuẩn
E.coli sinh độc tố (ETEC) là một trong những nguyờn nhõn gõy bệnh tiờu
chảy quan trọng cho trẻ em và khỏch du lịch. Việc biểu hiện thành cụng protein tỏi tổ hợp EltB trong nghiờn cứu này là tiền đề cho nghiờn cứu tiếp theo nhằm mục đớch sản xuất bộ que thử nhanh chẩn đoỏn độc tố khụng chịu nhiệt (LT) của ETEC trờn một số nhúm thực phẩm. Đõy là một bước đi quan trọng nhằm gúp phần nõng cao chất lượng của cỏc phũng xột nghiệm thực phẩm, qua đú sẽ gúp phần kiểm soỏt ATVSTP, giảm chi phớ xó hội thụng qua việc ngăn ngừa cỏc vụ ngộ độc thực phẩm do ETEC và nõng cao năng lực kiểm soỏt ATVSTP của cỏc cơ quan chức năng.
KẾT LUẬN
Từ những kết quả thu được cho phộp chỳng tụi rỳt ra một số kết luận sau: 1. Đó thiết kế thành cụng vector biểu hiện pGEX mang đoạn gen EltB. - Khuyếch đại được đoạn gen EltB đặc hiệu với kớch thước 312 bp.
- Đưa được đoạn gen EltB vào vector biểu hiện pGEX, kiểm tra bằng 3 phương phỏp PCR, cắt enzym giới hạn, giải trỡnh tự gen.
2. Đó biểu hiện và tinh sạch thành cụng protein tỏi tổ hợp EltB cú kớch
thước 28 kDa trờn tế bào E.coli BL21, kiểm tra bằng điện di trờn gel polyacrylamid và western blot.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
I. TIẾNG VIỆT
1. Alf.A.Lindberg, (1998). Những tiến bộ mới trong miễn dịch dự phũng
cỏc bệnh nhiễm khuẩn đường ruột. Hội thảo cỏc bệnh nhiễm khuẩn
đường ruột và đường thở- Hà Nội 18-21/3/1998: Tr. 60-64.
2. Phựng Khắc Cam (1995), “Bệnh tiờu chảy do Escherichia coli”, Sổ tay
kiểm soỏt cỏc bệnh truyền nhiễm, Nhà xuất bản y học tr.190-200.
3. Nguyễn Hữu Dũng (2005), Hội nhập kinh tế quốc tế và vấn đềđổi mới
cụng tỏc quản lý thực phẩm ở Việt Nam. Cục An toàn vệ sinh thực
phẩm- www.vfa.gov.vn.
4. Hồ Huỳnh Thựy Dương (1998).Phương phỏp PCR. Sinh học phõn tử,
Nhà xuất bản giỏo dục, tr. 190- 199.
5. Đinh Thị Bớch Hằng.(2002). Tỡm hiểu tỡnh trạng ụ nhiễm vi khuẩn của
một số loại thức ăn đường phố tại phường Thắng Lợi,thành phố Buụn
Ma Thuột.Luận văn thạc sĩ, trường đại học y Hà Nội. Tr. 10-12
6. Nguyễn Thị Hiền và cs(2005), Tỡnh hỡnh ụ nhiễm vi khuẩn và nhận
thức vệ sinh an toàn thực phẩm ở người kinh doanh thức ăn đường
phố. Cục An toàn vệ sinh thực phẩm- www.vfa.gov.vn.