Nâng cao hiệu suất biểu hiện TEV protease trong vi khuẩn e coli bằng protein dung hợp super folder green fluorescent protein sfGFP

Nâng cao hiệu suất biểu hiện TEV protease trong vi khuẩn E coli bằng protein dung hợp super folder Green Fluorescent Protein sfGFP Nâng cao hiệu suất biểu hiện TEV protease trong vi khuẩn E coli bằng protein dung hợp super folder Green Fluorescent Protein sfGFP Nâng cao hiệu suất biểu hiện TEV protease trong vi khuẩn E coli bằng protein dung hợp super folder Green Fluorescent Protein sfGFP Nâng cao hiệu suất biểu hiện TEV protease trong vi khuẩn E coli bằng protein dung hợp super folder Green Fluorescent Protein sfGFP Nâng cao hiệu suất biểu hiện TEV protease trong vi khuẩn E coli bằng protein dung hợp super folder Green Fluorescent Protein sfGFP

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT Vũ Thị Hiền NÂNG CAO HIỆU SUẤT BIỂU HIỆN CỦA TEV PROTEASE TRONG VI KHUẨN E.coli BẰNG PROTEIN DUNG HỢP SUPER FOLDER GREEN FLUORESCENT PROTEIN (sfGFP) LUẬN VĂN THẠC SĨ Hà Nội – 2013 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT Vũ Thị Hiền NÂNG CAO HIỆU SUẤT BIỂU HIỆN CỦA TEV PROTEASE TRONG VI KHUẨN E.coli BẰNG PROTEIN DUNG HỢP SUPER FOLDER GREEN FLUORESCENT PROTEIN (sfGFP) Chuyên ngành: Hóa sinh Mã số : 06 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS ĐỒNG VĂN QUYỀN Hà Nội – 2013 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ LỜI CẢM ƠN! Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới TS Đồng Văn Quyền, Trưởng phòng Phòng Vi sinh vật học phân tử, Viện Công nghệ sinh học- Viện Hàn lâm Khoa học công nghệ Việt Namđã tận tình hướng dẫn giúp đỡ tơi suốt q trình thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơnPGS.TS Đinh Duy Khángvà cán Phòng Vi sinh vật học phân tử động viên, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình nghiên cứu đề tài Tôi xin cảm ơn thầy, cô thuộc Viện Công nghệ Sinh học, Viện Sinh thái tài nguyên sinh vật giúp đỡ bảo trình học tập nghiên cứu khoa học Tôi xin cảm ơn lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, Phịng thí nghiệm trọng điểm cơng nghệ gen, nơi làm việc, tạo điều kiện suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thiện luận văn Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè giúp đỡ động viên tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày tháng năm 2013 Học viên Vũ Thị Hiền Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC TỪ VIẾT TĂT Tên đầy đủ Stt Từ viết tắt Ala Alanin bp Base pair APS Amonium persulfat Arg Arginin Asn Asparagin Asp Aspartic acid bp CBB Coomassie brilliant blue Cys Cystein 10 Đc Đƣờng chạy 11 DNA Deoxyribonucleic Acid 12 DTT Dithiothreitol 13 E.coli Escherichia coli 14 EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid 15 EtBr Ethidium bromid 16 Gln Glutamin 17 Glu Acid glutamic 18 Gly Glycin 19 GST Glutathione transferase 20 His Histidin 21 TEV Tobacco Etch Virus 22 TEVp Tobacco Etch Virus protease 23 GFP 24 sfGFP Super folder Green Fluorecent Protein 25 sfGFP-TEVp Super folder Green Fluorecent Protein- Base pair Green Fluorecent Protein Tobacco Etch Virus protease Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 26 IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside 27 kDa Kilo Dalton 28 LB Luria Bertani 29 NaOAC Sodium acetate 30 OD Optical Density 31 PCR Polymerase chain reaction 32 PMSF 33 SDS Sodium dodecyl sulfate 34 TAE Tris- acid acetic – EDTA 35 TEMED 36 v/ v 37 X-gal Số hóa Trung tâm Học liệu Phenylmethanesunfonylfluoride N, N, N’, N’- tetramethyl- ethylenediamine Volume/ volume: thể tích/ thể tích 5-bromo-4-chloro-3indoly-β-D-galactoside http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 1.1 Chức dự đoán protein TEV Bảng 2.1 Thành phần phản ứng cắt gen sfGFP-TEVp enzyme giới hạn Bảng 2.2 Thành phần phản ứng cắt vector pET21(a+) enzyme giới hạn Bảng 2.3 Thành phần phản ứng gắn gene vào vector biểu Bảng 2.4 Thành phần dung dịch đệm SDS-PAGE Bảng 2.5 Thành phần phản ứng cắt GP120 tái tổ hợp sfGFPTEVp Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Hình 1.1 Quá trình đồng biểu xử lý sau dịch mã TEV Hình 1.2 Cấu trúc khơng gian TEV protease Hình 1.3 Cấu trúc khơng gian GFP Hình 1.4 Đỉnh kích thích huỳnh quang (nét liền) đỉnh huỳnh quang phát (nét đứt) GFP tự nhiên từ A victoria Hình 2.1 Sơ đồ minh họa bƣớc nghiên cứu biểu tinh sfGFP-TEVp Hình 2.2 Sơ đồ minh họa trình loại bỏ đuôi TRX khỏi protein dung hợp GP120- TRX nhờ sfGFP-TEV protease Hình 2.3 Sơ đồ thể trình thiết kế vector biểu chứa gene mã hóa sfGFP-TEVp Hình 3.1 Sơ đồ thể trình thiết kế vector biểu chứa gene mã hóa sfGFP-TEVp Hình 3.2 Điện di sản phẩm PCR khuếch đại genesfGFP-TEV protease Hình 3.3 Điện di plasmid sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp Nde I Xho I Hình 3.4 sfGFP-TEVp Hình 3.5 Kết biểu sfGFP-TEVprotease Hình 3.6 Kết biểu sfGFP-TEV protease nhiệt độ khác Hình 3.7 Kết xác định trạng thái tồn protein sfGFPTEVp biểu nhiệt độ khác Hình 3.8 Kết biểu sfGFP-TEVp thời gian cảm ứng khác Hình 3.9 Kết biểu sfGFP-TEVp nồng độ IPTG Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Trang Hình 3.10 Kết tinh sfGFP-TEVp tái tổ hợp Hình 3.11 Điện di đồ kết kiểm tra hoạt tính sfGFP-TEV Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỤC LỤC MỞ ĐẦU .1 CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU Đại cƣơng Protease 1.1 1.1.1 Khái niệm protease 1.1.2 Phân loại protease 1.2 TEV protease 1.2.1 Giới thiệu chung Tobacco Etch Virus 1.2.2 Nguồn gốc, phân loại vai trò TEV protease đời sống virus 1.2.4 Cấu trúc TEV protease 1.2.5 Cơ chất đặc hiệu điều kiện hoạt động 1.2.6 Ưu điểm hạn chế TEV protease 11 1.2.7 Tình hình nghiên cứu TEV protease tái tổ hợp nước .11 1.3 Tổng quan Green Fluorecent Protein (GFP) 13 1.3.1 Đặc điểm GFP 13 1.3.2 Super folder GFP biến thể khác GFP 15 ện TEVp 17 1.4 1.4.1 Hệ thống biểu E.coli 17 1.4.2 Vector biểu pET 17 CHƢƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Vật liệu 19 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu .19 2.1.2 Hoá chất sinh phẩm .19 2.1.3 Trang thiết bị máy móc 20 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu .20 2.2.1 Thiết kế vector biểu mang gene mã hóa sfGFP-TEVp .21 2.2.2 Phương pháp cắt enzyme giới hạn 21 2.2.3 Phương pháp điện di DNA gel agarose 22 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 2.2.4 Biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến E.coli 23 2.2.5 Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩnE.coli 24 2.2.6 Phương pháp biểu protein tái tổ hợp E coli 25 2.2.7 Phương pháp xác định trạng thái tồn TEVp 25 2.2.8 Phương pháp điện di protein gel polyacrylamide 26 2.2.9 Tinh protein tái tổ hợp cột Probond Nickel- Chelating Resin 27 2.4.11 Định lượng protein phương pháp Bradford 28 2.2.11 Phương pháp thử hoạt tính sfGFP-TEV protease 29 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 Thiết kế vector biểu psfGFP-TEVp .31 3.2 Kiểm tra khung đọc gene sfGFP-TEVp vector pET21(a+) .34 3.3 Kết biểu sfGFP-TEVp E coli BL21 (DE3) Star™ .35 3.4 Tối ƣu hoá điều kiện biểu 36 3.3.1 Ảnh hưởngcủa nhiệt độ nuôi cấy .37 3.3.2 Ảnh hưởng củ .39 3.3.3 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy 39 3.5 Kết tinh chế sfGFP-TEVp 41 3.6 -TEVp 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO .47 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Hình 3.5 Kết biểu sfGFP-TEVprotease A Quan sát mắt thườ ẫu không cảm ứ ẫu cảm ứng với IPTG B Kết điện di: ĐC 1: thang protein chuẩn; ĐC 2: mẫu không cảm ứng; ĐC 3: mẫu cảm ứng IPTG với nồng độ cuối 1mM Với hình thành cách tự nhiên từ motiftri-peptide trongcấu trúccơ bản, GFP tạo nên ƣ cókhả phát huỳnh quang.Ƣu điểm đƣợc thể tất vi sinh vật Nhờ có gắn dung hợp sfGFP phát huỳnh quang màu xanh lá, dƣới ánh sáng thƣờng ta quan sát đƣợc mẫu sau cảm ứ (hình 3.5A) Kết điệ 3.5B) cho thấy mẫu sau cảm ứng IPTG (ĐC 3) xuất băng protein khác biệ xấp xỉ 54 kDa, tƣơng đƣơng với kích thƣớc sfGFP-TEV protease theo tính tốn lý thuyết, mẫu khơng đƣợc cảm ứng khơng xuất băng protein này(ĐC 2) Điều chứng tỏ protein tái tổ hợp sfGFP-TEV protease đƣợc biểu thành công tế bào E.coli BL21 StarTM (DE3) 3.4 Tối ƣu hoá điều kiện biểu Trƣớc biểu lƣợng lớn để thu nhận protein tái tổ hợp phục vụ cho nghiên cứu tiếp theo, tiến hành khảo sát số điều kiện nuôi cấy nhằm tìm điều kiện biểu tối ƣu tạo lƣợng sfGFP-TEVp trạng thái hòa tan với hàm lƣợng cao nhấ ểu E.coli tồn trạng thái hoà tan thể vùi tuỳ thuộc vào điều kiện cảm ứng hay giai đoạn sinh trƣởng tế bào Vì vậy, nghiên cứu này, chúng Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ểu nhƣ nhiệt độ nuôi cấy, nồng độ tiến hành tố chất cảm ứ ời gian cảm ứng 3.3.1 Ảnh hưởngcủa nhiệt độnuôi cấy Nhiệt độ yếu tố quan trọng ảnh hƣởng đến sinh trƣởng phát triển tế bào vật chủ chứa plasmid tái tổ hợp.Bên cạnh đó, ảnh hƣởng đến tính ổn định plasmid tế bào, hiệu suất chất lƣợng protein tái tổ hợp Nhiệt độ cao khả đào thải plasmid chủng chủ lớn, đồng thời làm cho mRNA dễ bị phá hủy Một số protein ngoại lai đƣợc tổng hợp tốt 370C tốc độ sinh trƣởng chủng chủ đạt tối đa Tuy nhiên, tế bào phát triển mạnh protein tái tổ hợp đƣợc tổng hợp liên tục phần protein đóng gói ụ dạng thể khơng kị ọ Ở nhiệt độ thấp hơn, tốc độ sinh trƣởng tế bào chậm nên protein tái tổ hợp đƣợc tổng hợpcũng chậm hơn.Vì để cóthời gian đóng gói gấp cuộn xác tạo protein dạng hồ tan có hoạt tính cao,E.coli sinh trƣởng dải nhiệt độ từ 4- 370C Để tìm nhiệt độ tối ƣubiểu protein ngoại lai dạng hịa tan, chúng tơi ni chủng E coli BL21 (DE3) Star™ mang vector psfGFP-TEVở nhiệt độ 370C, 300C, 250 180C tƣơng ứng sau sau 3, 5, 12 24 cảm ứng, kết đƣợc thể ởhình 3.6 kDa 66 54,4 kDa 45 35 25 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Hình 3.6 Kết biểu sfGFP-TEV protease nhiệt độ khác ĐC 1: thang protein chuẩn; ĐC 2,4,6,8: mẫu không cảm ứng nhiệt độ 37 o C,30oC, 25 oC, 18oC; ĐC 3,5,7,9: mẫu cảm ứng IPTG với nồng độ cuối 1mM nhiệt độ 37 oC,30oC, 25 oC, 18oC Kết điện di (hình 3.6) cho thấy nhiệt độ ảnh hƣởng lớn tới trình tổng hợp protein ngoại lai tế bào chủ Ở nhiệt độ 370C, hàm lƣợng protein tái tổ hợp đƣợc biểu cao Tuy nhiên, kiểm tra trạng thái biểu hiện, sfGFP-TEVp đƣợc biểu chủ yếu dƣới dạng thể vùi, 300C, 250C, 180 chủ yếu dạng hòa tan 3.7).So 250C, pro ỉ 18o , 2013) Điều , gấp cuộn cao sfGFP tạo điều kiện cho việc cuộn gấ , ngăn cản việc hình thành thể vùi So sánh độ hòa tan sfGFP-TEVp nhiệt độ 300C, 250C, 180C cho thấy, 250C 180C sfGFP-TEVp dạng hịa tan gần nhƣ hồn tồn, cịn 300C cịn khoảng 50% protein dạng khơng hịa tan Tuy nhiên, chọn nhiệt độ 180C tối ƣu để tổng hợp sfGFP-TEVp nhiều thời gian Do đó, chúng tơi chọn nhiệt độ biểu sfGFP-TEVp 250C cho nghiên cứu 250C kDa 180C 300 3C 370 C6 11,6 66 54.4 kDa 45 35 Số25hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ B Hình 3.7 Kết xác định trạng thái tồn sfGFP-TEVp biểu A nhiệt độ khác A: ĐC 1: thang protein chuẩn; ĐC 2,3: mẫ 250 ẫu cảm ứng IPTG ặn, pha 25 0C; ĐC 6,7: mẫ sau cảm ứng 18 ặn, pha 18 0C cảm ứng 30 0C; ĐC B: ĐC 1: thang protein chuẩn; ĐC 2: pha nổi, pha cặn 30 37 ảm ứng pha cặn, pha 370C 3.3.2 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy Thời gian sau cảm ứ ếu tố ảnh hƣởng lớn tới hàm lƣợng trạng thái biểu protein tái tổ hợ khơng đủ thời gian tổng hợ ửa đổi sau dị nhƣ cuộn gấp củ ợ , thời gian nuôi lâu làm tế bào chuyển sang pha suy thoái, giảm lƣợ , tế bào đƣợc cảm ứng 250C, 1mM IPTG tiến hành khả 8, 10, 12 và16 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Hình 3.8.Kết biểu sfGFP-TEVp thời gian cảm ứng khác ĐC 1: thang protein chuẩn; ĐC 2,3: tương ứng mẫu không cảm ứng mẫu cảm ứng sau 4h; ĐC 4,5: tương ứng mẫu không cảm ứng mẫu cảm ứng sau 8h; ĐC 6,7: tương ứng mẫu không cảm ứng mẫu cảm ứng sau 12h; ĐC 8,9: tương ứng mẫu không cảm ứng mẫu cảm ứng sau 16h Kết điện di (Hình 3.8) cho thấy hàm lƣợng protein tái tổ hợp đạt tối đa sau 12 nuôi cấy Chúng tiếp tục khảo sát thêm với 20, 25 sau cảm ứng Kết lƣợng protein tổng số cách rõ rệt (kết khơng nêu đây) Điều đƣợc giải thích thành phần mơi trƣờng bắt đầu cạn kiệt, vi khuẩn không phân chia tiếp bắt đầu bƣớc vào pha suy thoái Vì vậy, chúng tơi lựa chọn thời gian thu hồi protein tái tổ hợp tối ƣu 12 sau cảm ứng IPTG 3.3.3 Ảnh hưởng củ Nồng độ IPTG yếu tố ảnh hƣởng lớn đến suất nhƣ chất lƣợng protein tái tổ hợp đƣợc tạo ra.Nếu nồng độ IPTG thấp, không đủ để kích thích promoter điều khiển biểu protein, nhƣng IPTG nhiều gây ức chế việc tổng hợp protein Để kiểm tra ảnh hƣởng nồng độIPTG đến trình tổng hợp sfGFP-TEVp, nuôi cấy chủng E coli BL21 (DE3) Star™ tái tổ hợp 370C đến OD600 đạ ới nồng độ IPTG khác nhau: 0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 1mM tiếp tục nuôi lắc 250C 12 ằng điện di gel polyacrylamide (hình 3.9 nồng độ IPTG khác có ảnh hƣởng khác tới trình sinh tổng hợp protein tái tổ hợp kDa 66 45 35 Số hóa Trung tâm 29 Học liệu 54,4 kDa http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Hình 3.9 Kết biểu sfGFP-TEVp nồng độ IPTG ĐC 1: thang protein chuẩn; ĐC 2: mẫu không cảm ứng; ĐC 3-7: mẫu cảm ứng nồng độ IPTG tương ứng 0.1, 0.3, 0.5, 0.7, 1mM Kết điện di cho thấy lƣợng protein tái tổ hợp tổng số thu đƣợc nồng độ mM lớn Vì thế, chúng tơi chọn nồng độ chất cảm ứng IPTG mM cho nghiên cứu 3.5 Kết tinh chế sfGFP-TEVp Để sử dụng protein tái tổ hợp phục vụ cho mục đích nghiên cứu tiếp theo, tiến hành tinh protein tái tổ hợp Protein tái tổ hợp dạng hòa tan đƣợc tinh chế theo phƣơng pháp native conditions sử dụng hệ thống tinh sạ - inh Trong trình tinh chế, imidazole đƣợc sử dụng nhƣ chất cạnh tranh Ni2+ phức hợp Ni2+-histidine protein tái tổ hợp Nhiều protein chủng chủ có mang histidine nên có lực với Ni2+ cột Tuy nhiên, lực liên kết protein với Ni2+ yếu nhiều so với protein tái tổ ổ hợp làm tăng hợp histidine liền kề lực với Ni2+ lên nhiều lần Các protein có lực yếu bị rửa trôi khỏi cột cách tăng dần nồng độ imidazole dung dịch rửa cột Để loại bỏ hiệu protein tạp chủng vi khuẩn chủ, bổ sung imidazole với dải nồng độ từ 20 mM - 60 mM vào đệm rửa Sau rửa cột để loại bỏ protein tạp nhiễm bám không đặc hiệu, protein tái tổ hợp đƣợc đẩy khỏi cột đệm đẩy có chứa 250 mM đến 500mM Imidazole Các phân đoạn khác sau đẩy khỏi cột đƣợc kiểm tra điện di gel polyacrylamide 12,5% liệu3 Số hóa kDa Trung1tâm Học 66 8http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 54,4kDa Hình 3.10 Kết tinh sfGFP-TEVp tái tổ hợp ĐC 1: thang potein chuẩn; ĐC 2: dịch trước tinh chế; ĐC 3: dịch chảy qua cột; ĐC 4-8: phân đoạn đẩy khỏi cột nồng độ 500mM Imidazole; Kết điện di cho thấy sfGFP-TEVp có độ tinh cao, sử dụng cho mục đích nghiên cứu Tuy nhiên lƣợng nhỏ protein tái tổ hợp không bám đƣợc lên cột (Hình 3.10, ĐC 3), tỷ lệ hạt Resin protein tái tổ hợp chƣa hợ c nồng độ 60 mM Imidazole đệm rửa đủ để loại bỏ đƣợc hầu hết protein tạ - - ẩ thu đƣợc hầ 250 mM phân đoạn , không xuất hiệ Khi tăng dần nồng độ Imidazole lên từ 350mM đến 450mM, quan sát thấy phân đoạn xuất hiệ Kiểm tra điệ - protein tái tổ hợ ất băng ) Tuy nhiên quan sát hạt Resin cột tinh chế thấy màu xanh rõ chứng tỏ protein tái tổ hợp chƣa đƣợc đẩy hoàn toàn Tiếp tục tăng nồng độ Imidazole đệm đẩy lên 500 mM, thu phân đoạ Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Kiểm tra điệ - - Các phân đoạn protein tinh đƣợc thẩm tích đệm thẩm tích (50 mM Tris–HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA) 40C, sau định lƣợng phƣơng pháp Braford 100ml dịch ni ợng 930 µg/ml, cao cấy không dung hợp 3.6 -TEVp ổ hợp TRX-GP120 virus HIV làm chất để kiểm tra hoạt tính sfGFP-TEVp Theo thiết kế GP120 đƣợc biểu dƣới dạng dung hợp vớ ị trí cắt TEVp GP120 đƣợc tinh chế Kit tinh protein hãng Invitrogen, sau đƣợc thẩm tích loại muối Imidazole Phản ứng cắt thực 170C dải thời gian tƣơng ứng là: 1, 4, 6, 12 24 ể 12,5% điều kiện biến tính Hình 3.11 thể hoạt tính sfGFP-TEVp thờ t khác Ta thấy đƣờng chạy đến lƣợng chất lại chƣa bị cắt tỷ lệ nghịch theo thời gian xúc tác tăng (1, 4, 6, 12 24 giờ) Ở thời gian xúc tác 24 hầu nhƣ toàn GP120-TRX bị cắ Nồng độ 120 (36 kDa) enzyme bị phân hủy Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ sfGFP-TEVp 36 kDa GP120-TRX 22 kDa GP120 14 kDa TRX A B Hình 3.11 Điện di đồ kết kiểm tra hoạt tính sfGFP-TEVp (A) ĐC 1: thang protein chuẩn; ĐC 2: GP120 tái tổ hợp; ĐC 3-7: GP120 tái tổ hợp cắt sfGFP-TEVp sau 1, 4, 6, 12 24 (B) ĐC 1: thang protein chuẩn; ĐC 2: GP120 tái tổ hợp; ĐC 3: GP120 tái tổ hợp cắt TEVp sau 24 ỏ có độ hồ tan thấp sfGFP-TEVp có hoạt tính xúc tác tƣơng đƣơng TEVp Sau 24 ủ 170C, hầu hết GP120-TRX bị cắt sfGFP-TEVp, TEVp cắt gần nhƣ hồn tồn (hình 3.11) Trong nghiên cứu này, chúng tơi thử tiến hành tìm điều kiện bảo quản tốt cho sfGFP-TEVp Kết sơ ban đầu cho thấy, bảo quản 40C khoảng tuần, TEVp không bền vững, bị kết tủa hoạ 40C sfGFP-TEVp không bị kết tủa Trong đó, sau mộ giữ đƣợc 60% hoạt tính Điều chứng tỏ sfGFP-TEVp có tính ổn định so vớ ) điều kiện khác , sfGFP khơng nhữ , tăng tính tan mà tăng độ bền, ổn định củ Một số ại khơng Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ bền, dễ ứng dụ Bên cạnh đặc tính phát huỳnh quang sfGFP cung cấp phƣơng pháp đị ợp mộ , có máy đo quang phổ thể nhìn thấ ột Ni- Histag giúp sfGFP dễ NTA sau thực phản ứng cắt Trong tự nhiên, tiến hoá cho thấy đƣợc sức ể tạo mạnh việc dung hợ protein/enzyme với đặc tính bật Với thiết kế hợp lý, tận dụng lợi protein có sẵn để cải thiện đặc điểm số enzyme Nhƣ nghiên , cho thấy sfGFP cải thiện đáng kể hồ tan, mức độ biểu ổn định TEVp, điều quan trọng việc sản suất lƣợng lớ dụng nghiên cứu KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Thiết kế thành công vector biểu pET21a(+) mang gene mã hóa cho sfGFP-TEVpvà biểu thành công protein dung hợpsfGFPTEV protease vi khuẩn E coli chủng BL21 (DE3) Star™ Đã tối ƣu hóa đƣợc điều kiện biểu để nâng cao hiệu suất biểu thu hồi protein tái tổ hợp rsfGFP-TEVp biểu 250C thời mM chất cảm ứng IPTG 12 Đã tinh đƣợc protein sfGFP-TEV protease tái tổ hợp cột sắc ký lực Probond Nickel-Chelating Resin cao v nồng độ độ 930µg/ml sfGFP-TEVp sau tinh giữ đƣợc hoạt tính sinh học tƣơng đƣơng TEVp Kiến nghị Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Tiếp tục nghiên cứu tối ƣu điều kiệnhoạt động sfGFP-TEVp nhƣ đệm, tỷ lệ enzyme/cơ chất phản ứng cắt Đồng thời tiến hành kiểm tra tính ổn định củasfGFP-TEVp Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bernard R.Glick, Jack J Pasternak (2007), Công nghệ sinh học phân tử Nguyên lý ứng dụng AND tái tổ hợp, NXB Khoa học Kỹ thuật Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng (2008), Sinh học phân tử, NXB giáo dục (2004), PGS TS Khuất Hữu Thanh (2006), Kỹ thuật gen nguyên lý ứng dụng, NXB Khoa học Kỹ thuật Tiếng Anh Adam CW, (2003) Potyvirus: genome structure, organisation, processing and possible functions of mature Viology down under Miladi B, Bouallagui H, Dridi C, El Marjou A, Boeuf G, Di Martino P, Dufour F, Elm'selmi A, (2011) Reprint of:A new tagged-TEV protease: Construction, optimisation of production,purification and test activity.Protein Expression and Purification 75,5–82 Blommel PG, Brian GF, (2007) A combined approach to improving large- scale production of Tobaco Etch Virus protease.Protein Expression and Purication, 53- 68 Breman LL, (1987) Tobacco etch virus.Plant Pathology Circular 297 Cabrita LD, Gilis D, Robertone AL, Dehouck Y, Rooman M, Bottomley SP, (2007) Enhancing the stability and solubility of TEV protease using in silico design.Protein Science 16, 2360–2367 10 Christine MN, Mark J, Matthew JC, Gillian TU, Roger RG, Luke HC, Yugo T and Snezana D, (2005) Crystal Structure of Tobacco Etch Virus Protease Shows the Protein C Terminus Bound within the Active Site.J Mol Biol 350, 145–155 11 Damirdagh IS, Shepherd RJ, (1970) Some of the Chemical Properties of the Tobacco Etch Virus and Its Protein and Nucleic Acid Components.Virology 40, 8489 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 12 Daniel CG, Sami M, and James AW, (2010) Activation of specific apoptotis caspases with an engineered small-molecule-activated protease.Cell 142, 637–646 13 Polayes DA, Parks TD, Johnston SA, Dougherty WG, (1998) Application of TEV protease in protein production.Methods Mol Med 1998;13:169-83 14 Dengfeng D, (1998) Mammalian and viral protease inhibitors, Sichuan University.A PhD Dissertation 15 Dougherty WG and Semler BL, (1993) Expression of virus-encoded proteinases: functional and structural similarities with cellular enzymes.Microbiol Rev, 57(4):781 16 Dougherty WG, Park TD, Cary SM, Bazan JF, Fletterick RJ, (1989) Characterization of the Catalytic Residues of the Tobacco Etch Virus 49-kDa Proteinase.Virology 172, 302-310 17 Heim R, Cubitt A, TsienR, (1995) Improved green fluorescence.Nature, 373: 663-664 18 Shen HB , Chou KC, (2009) Identification of proteases and their types.Analytical Biochemistry 385, 153–160 19 Pédelacq JD, Cabantous S, Tran T, Terwilliger TC, Waldo G(2006) Engineeringandcharacterizationofasuperfoldergreenfluorescentprotein NatureBiotechnology,24 (1):79–88 20 Jason P, Alexander Z, Artem GE, Joseph ET, Howward KP, Kapust RB, Mi L, Wlodawer A and Waugh DS, (2002) Structural basis for the substrate specificity of tobaco etch virus protease.The journal of biological chemistry 52, 50564- 50572 21 Daro`s JA and Carrington JC, (1997) RNA Binding Activity of NIa Proteinase of Tobacco Etch Potyvirus.Virology 237, 327–336 22 Daro`s JA, Schaad MC, Carringston JC, (1999) Functional Analysis of the Interaction between VPg-Proteinase (NIa) and RNA Polymerase (NIb) of Tobacco Etch Potyvirus, Using Conditional and Suppressor Mutants.Viology 8732–8740 23 Tropea JE, Cherry S, Waugh DS, (2009) Expression and purification of soluble His6 – tagged TEV Methods Mol Biol.498:297-307 24 Kapust RB, Karen MR, David SW, (2002) Processive degradation of nascent polypeptides, triggered by tandem AGA codons, limits the accumulation of Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ recombinant Tobacco Etch Virus Protease in Escherichia coli BL21(DE3).Protein Expression and Purification 24, 61–70 25 Kapust RB, Tozser J, Fox JD, Anderson DE, Cherry S, Copeland TD, and Davis SW, (2001) Tobacco etch virus protease : mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild- type catalytic proficiency.Protein engineering 12, 993- 1000 26 Kapust RB, Tozser J, Copeland TD, and Davis SW., (2002) The P1’ specificity of tobaco etch virus protease Biochemical res commun 294: 949- 955 27 Lei F, Kun-Zhi Jia , Ya-Lan Tang, Ding-Yuan Ma, Mei Yu, Zi-Chun Hua, (2007) An improved strategy for high-level production of TEV protease in Escherichia coli and its purication and characterization.Protein Expression and Purication 51 ,102–109 28 McRae SR, Brown CL, Bushell GR, (2004) Rapid purification of EGFP, EYFP and ECFP with high yield and purity.Protein Expression and purification, 41: 121-127 29 Mohanty AK, Simmons CR, Wiener MC, (2003) Inhibition of tobacco etch virus protease activity by detergents Protein Expression and Purification 27, 109– 114 30 Parks TD, Eric DH, Thomas JW, Daniel JA, William GD, (1995) Expression and purification of a recominant Tobaco Etch Virus Nia proteinase: biochemical analyses of the full- length and a natually occuring truncated proteinase form.Virology 210, 194- 201 31 Patricio CR, (2002) Diffusion of protease inhibitors in the muscle cell, A dissertation submitted to the Graduate Faculty of North Carolina State University 32 Paul GB, Brian GF, (2007) A combined approach to improving large- Scale Production of Tobacco Etch Virus protease.Protein Expression and purification, 51, 53- 68 33 Purcifull DE, Hiebert E, (1982) Tobacco etch virus.Association of applied biologists, 258 34 Phillips G, (2001)Green fluorescent protein- a bright idea for the study of bacterial protein localization.FEMS Microbiol Lett., 204: 9-18 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 35 Scientific Background on the Nobel Prize in Chemistry, (2008) The green fluorescent protein, discovery, expression and development, The Royal Swedish Academy of Sciences 36 Shirou TS, Takashi SH, Taemi YA, Kana NU,Naoya HA, and Takashi Ak, (2010) Application of Homogeneous Assay for Fluorescence Concentratedon Membrane to the Analysis of the Substrate Specificity of Protease Biosci Biotechnol Biochem,74: 869.871 37 Stols L, Gu M, Dieckman L, Raffen R, Collart FR, and Donnelly MI, (2002) A new vector for high- throughput, ligation- independent cloning encoding a tobacco etch virus protease.Protein expression and purification 25: 8- 15 38 Sunita M, Valerian VD, James CC, (1996) Roles of the Sequence Encoding Tobacco Etch Virus Capsis.Viology 4370–4379 39 Tsien R, (1998)The Green fluorescent protein, Annul Rev Biochem 67: 509544 40 XudongW, DiW, Zhisheng L,Wentao C, Xiaojian H, Yu D, (2009) A NovelMethod for High-Level Production of TEV Protease by Superfolder GFP Tag.Journal of Biomedicine and Biotechnology 41 Yang F, Moss LG, Pillips GN, (1996)The molecular structure of green fluorescent protein.Nat Biotechnol 14: 1246- 1251 42 http://greenfluorescentblog.wordpress.com/tag/superfolder/ DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ Bùi Thị Thùy Dƣơng, Đỗ Thị Huế, Vũ Thị Hiền, Mai Thùy Linh, Đồng Văn Quyền (2013), Nghiên cứu tách dòng, biểu tinh chế TEV protease vi khuẩn Escherichia coli Tạp chí cơng nghệ Sinh học Vũ Thị Hiền, Đồng Văn Quyền, (2013), Nghiên cứu nâng cao hiệu suất biểu cuả TEV protease vi khuẩn E.colibằng protein dung hợp super folder green fluorescent protein (sfGFP).Tạp chí cơng nghệ Sinh học Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ... Tobacco Etch Virus 22 TEVp Tobacco Etch Virus protease 23 GFP 24 sfGFP Super folder Green Fluorecent Protein 25 sfGFP- TEVp Super folder Green Fluorecent Protein- Base pair Green Fluorecent Protein. .. trên, hiệu suất biểu ? ?Nâng cao TEVprotease vi khuẩn E. coli protein dung hợp super folder Green Fluorescent Protein (sfGFP) ” nhằm TEV protease Đề tài đƣợc thực Phòng Vi sinh vật học Phân tử, Vi? ??n... NGUYÊN VI? ??N SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT Vũ Thị Hiền NÂNG CAO HIỆU SUẤT BIỂU HIỆN CỦA TEV PROTEASE TRONG VI KHUẨN E. coli BẰNG PROTEIN DUNG HỢP SUPER FOLDER GREEN FLUORESCENT