Nghiên cứu phát triển kỹ thuật phát hiện chủng vi khuẩn Escherichia coli O157 H7 và tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu

Nghiên cứu phát triển kỹ thuật phát hiện chủng vi khuẩn Escherichia coli O157 H7 và tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu Nghiên cứu phát triển kỹ thuật phát hiện chủng vi khuẩn Escherichia coli O157 H7 và tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu luận văn tốt nghiệp thạc sĩ

i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN ESCHERICHIA COLI TÁI : 62 42 01 21 : PGS - 2014 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ii Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi dƣới hƣớng dẫn PGS TS PGS TS Các số liệu trình bày luận án trung thực Một số kết đƣợc công bố riêng đồng tác giả, phần lại chƣa đƣợc cơng bố cơng trình khác Tơi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm số liệu luận án này! 29 09 năm 2014 Hoàng Phú Hiệp Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iii LỜI CẢM ƠN Trước hết tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới PGS TS Lê Quang Huấn, PGS TS Nguyễn Bích Nhi hướng dẫn, bảo tận tình từ bước tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận án Tơi xin chân thành cảm ơn giúp – thực đề tài luận án Tôi xin cảm ơn Bộ môn Di truyền SHHĐ, Khoa Sinh-KTNN, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện giúp đỡ suốt thời gian học tập, nghiên cứu Tơi xin cảm ơn gia đình bạn bè tơi tạo điều kiện động viên suốt q trình học tập hồn thành luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn!!! Thái Nguyên, ngày 29 tháng 09 năm 2014 Nghiên cứu sinh Hoàng Phú Hiệp Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iv Trang MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 VI KHUẨN E COLI O157:H7 1.1.1 Đặc điểm chung chủng vi khuẩn E coli O157:H7 1.1.2 Độc tố Shiga-like toxin: Bản chất tác hại 1.1.3 Nguyên nhân diễn biến ngộ độc 12 1.1.4 Tình hình ngộ độc thực phẩm vi khuẩn Việt Nam 13 1.2 CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VÀ XÁC ĐỊNH VI KHUẨN E COLI O157:H7 15 1.2.1 Phƣơng pháp PCR dựa ADN 15 1.2.2 Kỹ thuật LAMP 19 1.2.3 Sử dụng kháng thể tái tổ hợp phát E coli O157:H7 20 1.3 KHÁNG THỂ 25 1.3.1 Mảnh kháng thể 27 1.3.2 Kháng thể tái tổ hợp 28 1.3.3 Kỹ thuật biểu lộ phage 30 1.3.4 Tình hình nghiên cứu sử dụng kháng thể Việt Nam 35 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37 2.1 Vật liệu nghiên cứu 37 2.1.1 Sinh phẩm 37 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ v 2.1.2 Hóa chất 37 2.1.3 Các cặp mồi đƣợc sử dụng 38 2.2 Thiết bị 38 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 39 2.3.1 ứu ADN 39 2.3.2 Kỹ thuật bộc lộ thực khuẩn thể (phage display) 45 2.3.3 ứu protein 48 2.3.4 Phƣơng pháp phân tích xử lý số liệu 53 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 54 3.1 XÁC ĐỊNH VI KHUẨN E COLI O157:H7 BẰNG KỸ THUẬT GEN 54 3.1.1 Xác định chủng vi khuẩn E coli O157:H7 kỹ thuật phân tích gen mã hóa 16S rARN 54 3.1.2 Sử dụng đoạn gen Stx1 Stx2 để xác định E coli O157:H7 60 3.1.3 Sử dụng kỹ thuật LAMP xác định vi khuẩn E coli O157:H7 66 NGHIÊN CỨU THU NHẬN KHÁNG THỂ ĐẶC HIỆU ĐỐI VỚI 3.2 VI KHUẨN E COLI O157:H7 VÀ TÁCH DỊNG XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN MÃ HĨA KHÁNG THỂ 72 3.2.1 Sàng lọc kháng thể từ thƣ viện Griffin.1 72 3.2.2 Chọn dòng phage kháng thể đặc hiệu với vi khuẩn E coli O157: H7 75 3.2.3 Nhân gen mã hóa kháng thể PCR 77 3.2.4 Giải trình tự gen mã hoá kháng thể 78 3.3 TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN KHÁNG THỂ TÁI TỔ HỢP 82 3.3.1 82 3.3.2 Thiết kế vector pET28a-TRX biểu gen mã hóa kháng thể 83 3.3.3 Số hóa Trung tâm Học liệu 85 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vi 3.3.4 iểu gen mã hóa kháng thể 86 TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA KHÁNG THỂ 3.4 TÁI TỔ HỢP 89 3.4.1 89 3.4.2 pháp lai blot 92 3.4.3 Kiểm tra hoạt tính kháng thể tái tổ hợp ELISA 94 ạt nano 95 3.4.4 97 98 99 PHỤ LỤC 112 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vii THUẬT NGỮ VIẾT TẮT EtBr Nghĩa tiếng Anh Base pair Centers for Disease Control and Prevention Complementarity Determining Region Colony forming unit Dideoxynucleotide triphosphat Deoxyribonucleic Acid Deoxynucleotide triphosphat Escherichia coli Ethylene Diamine Tetra acetic Acid Enterohaemorrhagic E coli Enzyme-linked immunosorbent assay Ethidium Bromide FDA Food and Drug Administration Ký hiệu bp CDC CDR Cfu ddNTP ADN dNTP E coli EDTA EHEC ELISA HRP HC HUS Horseradish peroxidase Hemorrhagic Colitis Hemolytic Uremic Syndrome Isopropyl--DIPTG Thiogalactopyranoside Kb Kilo base pair kDa Kilo Dalton Loop-mediated Isothermal LAMP Amplification LB Lauria Bertani mAb Monoclonal antibody OD Optical Density PBS Phosphate buffer saline PCR Polymerase Chain Reaction PEG Polyethylene Glycol rARN Ribosomal RNA SDS Sodium Dodecyl Sulphate SDS- Polyacrylamide gel SDS-PAGE electrophoresis Shiga-like toxin producing STEC Escherichia coli TAE Tris - Acetate – EDTA TE Tris – EDTA N, N, N’, N’- Tetramethyl TEMED ethylenediamine v/p VH Variable heavy Số hóa Trung tâm Học liệu Nghĩa tiếng Việt Cặp base Trung tâm Kiểm sốt Phịng chống Dịch bệnh Mỹ Vùng định tính bổ trợ Đơn vị khuẩn lạc Dideoxynucleotide triphosphat Deoxyribonucleic Acid Deoxynucleotide triphosphat Escherichia coli Ethylene Diamine Tetra acetic Acid E coli gây xuất huyết ruột Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme Ethidium Bromide Cục quản lý Thực phẩm Dƣợc phẩm Hoa Kỳ Horseradish peroxidase Xuất huyết ruột Hội chứng dung huyết suy thận Isopropyl--D-Thiogalactopyranoside Kilo base pair Kilo Dalton Phƣơng pháp khuếch đại đẳng nhiệt đặc hiệu Lauria Bertani kháng thể đơn dòng Mật độ quang Phosphate buffer saline Phản ứng chuỗi polymerase Polyethylene Glycol Ribosomal RNA Sodium Dodecyl Sulphate SDS- Polyacrylamide gel electrophoresis Shiga-like toxin producing Escherichia coli Tris - Acetate – EDTA Tris – EDTA N, N, N’, N’- Tetramethyl ethylenediamine Vòng/phút Vùng biến đổi chuỗi nặng http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iv viii VL Variable light Số hóa Trung tâm Học liệu Vùng biến đổi chuỗi nhẹ http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vix Số hiệu bảng 1.1 Tên bảng Trang hông số hệ gen vi khuẩn E coli O157:H7 06 1.2 Đặc điểm mảnh kháng thể 27 2.1 Trình tự cặp mồi sử dụng nghiên cứu 36 2.2 Thành phần phản ứng PCR 39 2.3 Thành phần phản ứng xử lý ADN enzme giới hạn 41 2.4 Thành phần phản ứng nối ghép 41 2.5 Thành phần chu trình nhiệt phản ứng LAMP 43 2.6 Thành phần gel polyacrylamide 47 3.1 3.2 3.3 3.4 Kết so sánh trình tự gen HQ658163 với trình tự gen 16S rARN từ GenBank Kết so sánh trình tự gen Stx1 với trình tự gen Stx1 từ GenBank Kết so sánh trình tự gen Stx2 với trình tự gen Stx2 từ GenBank Kết phản ứng ELISA xác định độ nhạy kháng thể tái tổ hợp kháng thể chuẩn Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 56 61 62 90 vi x Số hiệu hình Tên hình Trang 1.1 Hình ảnh vi khuẩn E coli O157:H7 kính hiển vi điện tử 03 1.2 Hình ảnh vi khuẩn E coli O157:H7 mơi trƣờng có MUG 05 1.3 Bản đồ 05 1.4 Cấu trúc độc tố Shiga-like toxin 07 1.5 Nguyên lý gây chết tế bào Shiga-like toxin 08 1.6 Nguyên lý gây bệnh E coli O157:H7 12 1.7 Cấu trúc chung số loại kháng thể 25 1.8 Sơ đồ cấu tạo mảnh kháng thể đơn chuỗi 26 3.1 Sơ đồ bƣớc nghiên cứu luận án 52 3.2 Hình ảnh điện di tách ADN tổng số 3.3 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen mã hóa 16S rARN 53 3.4 Hình ảnh điện di kiểm tra kết tách chiết ADN plasmid 54 3.5 Hình ảnh điện di kiểm tra ADN plasmid enzyme giới hạn BamHI 55 (genome) vi khuẩn E coli O157:H7 ẩn E coli O157:H7 53 Sơ đồ hình thể mối quan hệ E coli O157:H7 với chủng khác đƣợc xây dựng sở so sánh trình tự gen 16S ARN chủng 3.6 E coli O157:H7 nghiên cứu (mã số HQ658163) chủng khác 57 Ngân hàng Gen 3.7 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen Stx1 Stx2 58 3.8 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen Stx1 với cặp mồi vector pJET 59 3.9 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen Stx2 với cặp mồi vector pJET 60 3.10 Vị trí trình tự cặp mồi FIP/BIP 64 3.11 Hình ảnh điện di tách chiết ADN tổng số 64 3.12 Hình ảnh điện di sản phẩm phản ứng LAMP 65 3.13 Hình ảnh điện di sản phẩm LAMP xác định hàm lƣợng ADN 66 3.14 Sản phẩm LAMP nhuộm 68 SYBR Green I Khả gắn kết hỗn hợp phage thu đƣợc sau vòng sàng lọc 3.15 3.16 71 với dòng tế bào E coli O157:H7 Sơ đồ nguyên lý kỹ thuật ELISA dùng xác định độ nhạy phage Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 72 108 76 Rincon V., Corredor A., Martinez-Gutierrez M and Castellanos J E (2005), "Fluorometric cell-ELISA for quantifying rabies infection and heparin inhibition", J Virol Methods, 127(1), pp 33-39 77 Romanov V I (2003), "Phage display selection and evaluation of cancer drug targets", Curr Cancer Drug Targets, 3(2), pp 119-129 78 Roovers R C., Laeremans T., Huang L., De Taeye S., Verkleij A.J., Revets H., de Haard H J and van Bergen en Henegouwen P M (2007), "Efficient inhibition of EGFR signaling and of tumour growth by antagonistic antiEFGR Nanobodies", Cancer Immunol Immunother., 56(3), pp 303-317 79 Roovers R.C., van der Linden E., Zijlema H., de Bruine A., Arends J W and Hoogenboom H R (2001), "Evidence for a bias toward intracellular antigens in the local humoral anti-tumor immune response of a colorectal cancer patient revealed by phage display", Int J Cancer, 93(6), pp 832-840 80 Rozemuller H., Chowdhury P S., Pastan I and Kreitman R J (2001), "Isolation of new anti-CD30 scFvs from DNA-immunized mice by phage display and biologic activity of recombinant immunotoxins produced by fusion with truncated pseudomonas exotoxin", Int J Cancer, 92(6), pp 861-870 81 Sahilah A M., Aisah H N., Noraida I and Azuhairi A A (2010), "Detection of Shiga Toxin and (Stx1 and Stx2) Genes in Escherichia coli O157:H7 Isolated from Retail Beef in Malaysia by Multiplex Polymerase Chain Reaction (PCR)", Sains Malaysiana, 39(1), pp 57- 63 82 Sainath R S., Mohan K V and Atreya C D (2013), "A peptide derived from phage display library exhibits antibacterial activity against E coli and Pseudomonas aeruginosa", PLoS One, 8(2), pp e56081 83 Sambrook J and Russel D.W (2001), Molecular cloning: A laboratory manual 3rd ed., NY 84 Sanchez S., Martınez R., Garcıa A., Vidal D., Blanco J., Blanco M., Blanco J E., Mora A., Herrera-Leon S., Echeita A., Alonso J M and Rey J (2010), Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 109 "Detection and characterisation of O157:H7 and non-O157 Shiga toxinproducing Escherichia coli in wild boars", Vet Microbiol., 143(2-4), pp 420–423 85 Scott J K and Smith G P (1990), "Searching for peptide ligands with an epitope library", Science, 249(4967), pp 386-390 86 Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R (1977), “DNA sequencing with chainterminating inhibitors”, PNAS, 74 (12), pp 5463-5467 87 Siegler R L., Obrig T G., Pysher T J., Tesh V L., Denkers N D and Taylor F B (2003), "Response to Shiga toxin and in a baboon model of hemolytic uremic syndrome.", Pediatr Nephrol., 18(2), pp 92-96 88 Skinner C., McMahon S., Rasooly R., Carter J M and He X (2013), "Purification and characterization of Shiga toxin 2f, an immunologically unrelated subtype of Shiga toxin 2", PLoS One, 8(3), pp e59760 89 Smith C J., Olszewski A M and Mauro S A (2009), "Correlation of shiga toxin gene frequency with commonly used microbial indicators of recreational water quality", Appl Environ Microbiol., 75(2), pp 316-321 90 Smith G.P., Schultz D.A and Ladbury J.E (1993), "A ribonuclease Speptide antagonist discovered with a bacteriophage display library", Gene, 128(1), pp 37-42 91 Sorderlind E., Vergeles M and Borrebaeck C A (1995), "Domain libraries: synthetic diversity for the novo design of antibody V- regions.", Gene, 160(2), pp 269- 272 92 Steinhauer C., Wingren C., Hager A C and Borrebaeck C A (2002), "Single framework recombinant antibody fragments designed for protein chip applications", Biotechniques, Suppl, pp 38-45 93 Sulochana K N and Ge R (2007), "Developing antiangiogenic peptide drugs for angiogenesis-related diseases", Curr Pharm Des., 13(20), pp 2074-2086 94 Tan Duc Nguyen, Thin Thanh Vo and Hung Vu-Khac (2011), "Virulence factors in Escherichia coli isolated from calves with diarrhea in Vietnam", J Vet Sci., 12(2), pp 159- 164 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 110 95 Tjandra J J., Ramadi L and McKenzie I F (1990), "Development of human anti-murine antibody (HAMA) response in patients", Immunol Cell Biol., 68 ( Pt 6), pp 367-376 96 Tordsson J M., Ohlsson L G., Abrahmsén L B., Karlström P J., Lando P A and Brodin T N (2000), "Phage-selected primate antibodies fused to superantigens for immunotherapy of malignant melanoma", Cancer Immunol Immunother, 48(12), pp 691-702 97 Tornetta M., Fisher D., O'Neil K., Geng D., Schantz A., Brigham-Burke M., Lombardo D., Fink D., Knight D., Sweet R and Tsui P (2007), "Isolation of human anti-idiotypic antibodies by phage display for clinical immune response assays", J Immunol Methods, 328(1-2), pp 34-44 98 Wang F., Jiang L and Ge B (2011), "Loop-mediated Isothermal Amplification Assays for Detecting Shiga Toxin-producing Escherichia coli in Ground Beef and Human Stools", J Clin Microbiol., 50(1), pp 91- 97 99 Weisburg W G., Barns S M., Pelletier D A and Lane D J (1991), "16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study", J Bacteriol., 173(2), pp 697-703 100 Winter G., Griffiths A D., Hawkins R E and Hoogenboom H R (1994), "Making antibodies by phage display technology", Annu Rev Immunol., 12, pp 433- 455 101 Woo P C., Lau S K., Teng J L., Tse H and Yuen K Y (2008), "Then and now: use of 16S rDNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria in clinical microbiology laboratories", Clin Microbiol Infect., 14(10), pp 908-934 102 Zhang W., Bielaszewska M., Kuczius T and Karch H (2002), "Identification, characterization, and distribution of a Shiga toxin gen variant (stx(1c) in Escherichia coli strains isolated from humans", J Clin Microbiol., 40(4), pp 1441-1446 TÀI LIỆU INTERNET Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 111 103 abbott (2006), Annual report, http://www.abbott.com/static/content/microsite/annual_report/2006/humira.h tml, ngày 20/9/2010 104 Bộ Y tế (2011), Chiến lƣợc quốc gia an toàn thực phẩm giai đoạn 201120120 tầm nhìn 2030 (Dự thảo 9), http://www.chinhphu.vn/portal/page/portal/chinhphu/congdan/DuThaoVanB an?_piref135_27935_135_27927_27927.mode=detail&_piref135_27935_13 5_27927_27927.id=532, ngày 23/12/2013 105 Feng P., Weagant S.D and Jinneman K (2011), BAM: Diarrheagenic Escherichia coli, http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070 080.htm, ngày 09/09/2012 106 Gwartney A (2011), Escherichia coli showing flagella, http://www.microbeworld.org/component/jlibrary/?view=article&id=6731, ngày 05/11/2010 107 Henahan S (2011), Bad Burger Bacteria Genome, http://www.accessexcellence.org/WN/SUA14/ecoli2001.php, ngày 05/11/2010 108 Schneider K.R., Schneider R.G., Hubbard M.A and Chang A (2013), Preventing Foodborne Illness: E coli O157:H7, http://edis.ifas.ufl.edu/fs097, ngày 05/11/2013 109 Tống Kim Thuần (2012) Nghiên cứu tạo phức hợp kháng thể + hạt nano silica phát quang để phát nhanh vi khuẩn gây bệnh, http://www.vast.ac.vn/khoa-hoc-va-phat-trien/nghien-cuu-co-ban/1092nghien-c-u-t-o-ph-c-h-p-khang-th-h-t-nano-silica-phat-quang-d-phat-hi-nnhanh-vi-khu-n-gay-b-nh, ngày 05/10/2013 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 112 PHỤ LỤC Phụ lục 16S rARN Số hóa Trung tâm Học liệu 16S rARN-F: http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 113 Phụ lục 2: 16S rARN Số hóa Trung tâm Học liệu 16S rARN-R: http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 114 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 115 Phụ lục 3: So sánh trình tự chủng E coli O157:H7 mã số HQ658163 với chủng chủng E coli O157:H7 mã số AB035923 >>EM_PRO:AB035923; AB035923 Escherichia coli O157:H7 yrd (6560 nt) initn: 7419 init1: 7419 opt: 7419 Z-score: 4641.5 bits: 873.6 E(): banded Smith-Waterman score: 7419; 99.4% identity (99.4% similar) in 1500 nt overlap (1-1500:998-2497) 10 Sequen 20 30 AGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCT ::::::::::: :::::::::::::::::: EM_PRO AATTCTTTGAGCATCAAACTTTTAAATTGAAGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCT 970 980 40 990 50 1000 60 1010 70 1020 80 90 Sequen GGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAACGGTAACAGGAAGAAGCTTGCTTCTTTGCTG :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO GGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAACGGTAACAGGAAGAAGCTTGCTTCTTTGCTG 1030 1040 100 1050 110 1060 120 1070 130 1080 140 150 Sequen ACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGAGGGATAACTACT :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO ACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGAGGGATAACTACT 1090 1100 160 1110 170 1120 180 1130 190 1140 200 210 Sequen GGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTC :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO GGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTC 1150 1160 220 1170 230 1180 240 1190 250 1200 260 270 Sequen TTGCCATCGGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGC :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO TTGCCATCGGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGC 1210 1220 280 1230 290 1240 300 1250 310 1260 320 330 Sequen GACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAG :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO GACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAG 1270 1280 1290 Số hóa Trung tâm Học liệu 1300 1310 1320 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 116 340 350 360 370 380 390 Sequen ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCA :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCA 1330 1340 400 1350 410 1360 420 1370 430 1380 440 450 Sequen TGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGGAG :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO TGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGGAG 1390 1400 460 1410 470 1420 480 1430 490 1440 500 510 Sequen TAAAGTTAATACCTTTGCTCATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTG :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO TAAAGTTAATACCTTTGCTCATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTG 1450 1460 520 1470 530 1480 540 1490 550 1500 560 570 Sequen CCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCG :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO CCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCG 1510 1520 580 1530 590 1540 600 1550 610 1560 620 630 Sequen CACGCAGGCGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATC :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO CACGCAGGCGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATC 1570 1580 640 1590 650 1600 660 1610 670 1620 680 690 Sequen TGATACTGGCAAGCTTGAGTCTCGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAAT :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO TGATACTGGCAAGCTTGAGTCTCGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAAT 1630 1640 700 1650 710 1660 720 1670 730 1680 740 750 Sequen GCGTAGAGATCTGGAAGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACGAAGACTGACGCT ::::::::::::::: :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO GCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACGAAGACTGACGCT 1690 1700 760 1710 770 1720 780 1730 790 1740 800 810 Sequen CAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAAC :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO CAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAAC Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 117 1750 1760 820 1770 830 1780 840 1790 850 1800 860 870 Sequen GATGTCGACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCG :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO GATGTCGACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCG 1810 1820 880 1830 890 1840 900 1850 910 1860 920 930 Sequen ACCGCCTGAGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACA :::::::: ::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO ACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACA 1870 1880 940 1890 950 1900 960 1910 970 1920 980 990 Sequen AGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACAT :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO AGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACAT 1930 1940 1000 1950 1010 1960 1020 1970 1030 1980 1040 1050 Sequen CCACAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATG :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO CCACAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATG 1990 2000 1060 2010 1070 2020 1080 2030 1090 2040 1100 1110 Sequen GCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTA :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO GCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTA 2050 2060 1120 2070 1130 2080 1140 2090 1150 2100 1160 1170 Sequen TCCTTTGTTGCCAGCGGTCCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAG :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO TCCTTTGTTGCCAGCGGTCCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAG 2110 2120 1180 2130 1190 2140 1200 2150 1210 2160 1220 1230 Sequen GAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCGTCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTAC ::::::::::::::::::::::: :::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO GAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTAC 2170 2180 1240 2190 1250 2200 1260 2210 1270 2220 1280 1290 Sequen AATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGGGTGG ::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: :: : EM_PRO AATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGCGTCG Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 118 2230 2240 1300 2250 1310 2260 1320 2270 1330 2280 1340 1350 Sequen TAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGGCTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGA :::::::::::::::::::::::::: ::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO TAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGA 2290 2300 1360 2310 1370 2320 1380 2330 1390 2340 1400 1410 Sequen TCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGG :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO TCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGG 2350 2360 1420 2370 1430 2380 1440 2390 1450 2400 1460 1470 Sequen AGTGGGTTGCAAAGGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGAT ::::::::::::: :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO AGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGAT 2410 2420 1480 2430 1490 2440 2450 2460 1500 Sequen TCATGACTGGGGGGAAGTCGTAACAAGGTA :::::::::::: ::::::::::::::::: EM_PRO TCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTA Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 119 Phụ lục 4: Stx1: Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 120 Phụ lục 5: Stx2 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 121 Phụ lục 6: gen mã hóa đoạn kháng thể: Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 122 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ... coli O157: H7 Chính vậy, chúng tơi lựa chọn đề tài: ? ?Nghiên cứu phát triển kỹ thuật phát chủng vi khuẩn Escherichia coli O157: H7 tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu? ?? Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu kỹ. .. Nghiên cứu kỹ thuật phát chủng vi khuẩn E coli O157: H7 tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu với E coli O157: H7 Nội dung nghiên cứu (i) Xác định chủng E coli O157: H7 kỹ thuật di truyền (ii) Tạo dịng gen... Tạo dịng gen mã hóa cho kháng thể đặc hiệu chủng vi khuẩn E coli O157: H7 (iii) Thu nhận xác định độ nhạy, tính đặc hiệu kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu vi khuẩn E coli O157: H7; Số hóa Trung tâm Học