Nâng cao hiệu suất biểu hiện TEV protease trong vi khuẩn e coli bằng protein dung hợp super folder green fluorescent protein (sfGFP)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT --- Vũ Thị Hiền NÂNG CAO HIỆU SUẤT BIỂU HIỆN CỦA TEV PROTEASE TRONG V

Trang 1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

-

Vũ Thị Hiền

NÂNG CAO HIỆU SUẤT BIỂU HIỆN

CỦA TEV PROTEASE TRONG VI KHUẨN E.coli

BẰNG PROTEIN DUNG HỢP SUPER FOLDER GREEN FLUORESCENT PROTEIN (sfGFP)

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Hà Nội – 2013

Trang 2

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

-

NÂNG CAO HIỆU SUẤT BIỂU HIỆN

CỦA TEV PROTEASE TRONG VI KHUẨN E.coli

BẰNG PROTEIN DUNG HỢP SUPER FOLDER GREEN FLUORESCENT PROTEIN (sfGFP)

Chuyên ngành: Hóa sinh

Mã số : 06 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS ĐỒNG VĂN QUYỀN

Hà Nội – 2013

Trang 3

LỜI CẢM ƠN!

Tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc nhất tới TS Đồng Văn Quyền, Trưởng phòng Phòng Vi sinh vật học phân tử, Viện Công nghệ sinh học- Viện Hàn lâm Khoa học công nghệ Việt Namđã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơnPGS.TS Đinh Duy Khángvà các cán bộ Phòng Vi sinh vật học phân tử đã động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu đề tài này

Tôi xin cảm ơn các thầy, cô thuộc Viện Công nghệ Sinh học, Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật đã giúp đỡ và chỉ bảo tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

khoa học

Tôi xin cảm ơn lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học

và Công nghệ Việt Nam, Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen, nơi tôi làm việc, đã tạo điều kiện tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thiện luận văn

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Hà Nội, ngày tháng năm 2013

Học viên

Trang 4

DANH MỤC TỪ VIẾT TĂT

25 sfGFP-TEVp Super folder Green Fluorecent

Protein-Tobacco Etch Virus protease

Trang 5

35 TEMED N, N, N’, N’- tetramethyl- ethylenediamine

Trang 6

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Chức năng dự đoán của các protein trong TEV

Bảng 2.1 Thành phần phản ứng cắt gen sfGFP-TEVp bằng enzyme

Trang 7

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Quá trình đồng biểu hiện và xử lý sau dịch mã của TEV

Hình 1.2 Cấu trúc không gian của TEV protease

Hình 1.3 Cấu trúc không gian của GFP

Hình 1.4 Đỉnh kích thích huỳnh quang (nét liền) và đỉnh huỳnh

quang phát ra (nét đứt) của GFP tự nhiên từ A victoria

Hình 2.1 Sơ đồ minh họa các bước trong nghiên cứu biểu hiện và

tinh sạch sfGFP-TEVp

Hình 2.2 Sơ đồ minh họa quá trình loại bỏ đuôi TRX khỏi protein

dung hợp GP120- TRX nhờ sfGFP-TEV protease

Hình 2.3 Sơ đồ thể hiện quá trình thiết kế vector biểu hiện chứa

gene mã hóa sfGFP-TEVp

Hình 3.1 Sơ đồ thể hiện quá trình thiết kế vector biểu hiện chứa

gene mã hóa sfGFP-TEVp

Hình 3.2 Điện di sản phẩm PCR khuếch đại genesfGFP-TEV

protease Hình 3.3 Điện di plasmid và sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bởi

Nde I và Xho I.

Hình 3.5 Kết quả biểu hiện sfGFP-TEVprotease

Hình 3.6 Kết quả biểu hiện sfGFP-TEV protease ở các nhiệt độ

khác nhau Hình 3.7 Kết quả xác định trạng thái tồn tại của protein sfGFP-

TEVp khi biểu hiện ở các nhiệt độ khác nhau

Hình 3.8 Kết quả biểu hiện sfGFP-TEVp ở các thời gian cảm ứng

khác nhau Hình 3.9 Kết quả biểu hiện sfGFP-TEVp ở các nồng độ IPTG

Trang 8

Hình 3.10 Kết quả tinh sạch sfGFP-TEVp tái tổ hợp

Hình 3.11 Điện di đồ kết quả kiểm tra hoạt tính của sfGFP-TEV

Trang 9

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Đại cương về Protease 3

1.1.1 Khái niệm protease 3

1.1.2 Phân loại protease 3

1.2 TEV protease 6

1.2.1 Giới thiệu chung về Tobacco Etch Virus 6

1.2.2 Nguồn gốc, phân loại và vai trò của TEV protease trong đời sống của virus 7

1.2.4 Cấu trúc của TEV protease 8

1.2.5 Cơ chất đặc hiệu và điều kiện hoạt động 9

1.2.6 Ưu điểm và hạn chế của TEV protease 11

1.2.7 Tình hình nghiên cứu TEV protease tái tổ hợp trong và ngoài nước 11

1.3 Tổng quan về Green Fluorecent Protein (GFP) 13

1.3.1 Đặc điểm cơ bản của GFP 13

1.3.2 Super folder GFP và các biến thể khác của GFP 15

1.4 ện TEVp 17

1.4.1 Hệ thống biểu hiện E.coli 17

1.4.2 Vector biểu hiện pET 17

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Vật liệu 19

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 19

2.1.2 Hoá chất và sinh phẩm 19

2.1.3 Trang thiết bị và máy móc 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 20

2.2.1 Thiết kế vector biểu hiện mang gene mã hóa sfGFP-TEVp 21

2.2.2 Phương pháp cắt bằng enzyme giới hạn 21

2.2.3 Phương pháp điện di DNA trên gel agarose 22

Trang 10

2.2.4 Biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến E.coli 23

2.2.5 Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩnE.coli 24

2.2.6 Phương pháp biểu hiện protein tái tổ hợp trong E coli 25

2.2.7 Phương pháp xác định trạng thái tồn tại của TEVp 25

2.2.8 Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide 26

2.2.9 Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng cột Probond Nickel- Chelating Resin 27 2.4.11 Định lượng protein bằng phương pháp Bradford 28

2.2.11 Phương pháp thử hoạt tính của sfGFP-TEV protease 29

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 Thiết kế vector biểu hiện psfGFP-TEVp 31

3.2 Kiểm tra khung đọc của gene sfGFP-TEVp trong vector pET21(a+) 34

3.3 Kết quả biểu hiện sfGFP-TEVp trong E coli BL21 (DE3) Star™ 35

3.4 Tối ưu hoá các điều kiện biểu hiện 36

3.3.1 Ảnh hưởngcủa nhiệt độ nuôi cấy 37

3.3.2 Ảnh hưởng củ 39

3.3.3 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 39

3.5 Kết quả tinh chế sfGFP-TEVp 41

3.6 -TEVp 43

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

Trang 11

MỞ ĐẦU

protein không thể biểu hiện hoặc biểu hiện ở dạng không có hoạt tính/chức năng sinh học mong muốn, thậm chí còn gây độc cho vật chủ biểu hiện Do , biểu hiện protein dung hợp hiện đang được sử dụng rộng rãi nhằm nâng cao hiệu suất biểu hiện, ngăn ngừa sự phân hủy, tăng tính tan và tạo điều kiện

được sử dụng là Glutathione G-trans (GST), Thioredoxin (Trx), NusA, Maltose binding protein (MBP), Histidin (His) Tuy nhiên, các đuôi dung hợp này có thể gây trở ngại cho việc nghiên cứu về cấu trúc chức năng của protein đích Do đó, trong nhiều trường hợp việc loại bỏ đuôi dung hợp là cần thiết Các protease như enterokinase, thrombin, yếu tố Xa [9] cũng như rhinovirus 3C của người và TEVprotease được sử dụng để cắt đuôi dung hợp ra khỏi protein đích.Trong số các protease TEV protease (TEVp) là nổi bật nhất nhờ tính đặc hiệu cao,

hoạt động ở nhiệt độ thấp (dưới 4oC) nên protein đích không bị thuỷ phân Với những , TEVp được sử dụng rộng rãi hơn các protease khác

Trên thị trường hiện loại TEVp, được cung cấp bởi rất nhiều hãng khác nhau nhưng với giá thành cao và đều phải nhập ng Việc chủ động tạo ra nguồn TEVp có hoạt tính cao, giá thành rẻ phục vụ cho các nghiên cứu là vấn đề rất cần thiết

E.coli Tuy nhiên,trở ngại khi

biểu hiện TEVp trong E.colilà hiệu suất biểu hiện và độ tan kém Vì vậy,để giải quyết vấn đề nàycác nhà nghiên cứu đã đột biến của TEVp, biểu hiện ở nhiệt độ thấp hoặc dung hợp với các protein dung hợp khác Protein huỳnh quang xanh(Green fluorescent protein, GFP)đang được ứng dụng rộng rãi bởi một số nổi bật như dễ dàng phát hiện khi biểu hiện, tinh sạch và các ứng dụng khác nhờ sự hiện diện của huỳnh quang.Super folder Green Fluorescent Protein (sfGFP),

Trang 12

hiệu suất biểu hiện TEVprotease trong vi khuẩn E.coli bằng protein dung hợp super folder Green Fluorescent Protein (sfGFP)” nhằm

Đề tài đƣợc thực hiện tại Phòng Vi sinh vật học Phân tử, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Trang 13

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cương về protease

1.1.1 Khái niệm protease

Protease (còn gọi là proteinase hoặc peptidase) là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide (-CO-NH-) của chuỗi polypeptide Quá trình này cần thiết cho sự tổng hợp, kiểm soát kích thước, thành phần, hình dạng của các phân tử protein và cuối cùng là phân hủy chúng Protease chiếm khoảng 2% trong genome của người và 1-5% trong genome của côn trùng Protease điều hòa hầu hết các quá trình sinh lý thông qua việc kích hoạt tổng hợp, luân chuyển của protein, tham gia vào việc điều hòa trong thụ thai, sinh sản, tiêu hóa, tăng trưởng, trưởng thành, lão hóa, và thậm chí cả cái chết của các sinh vật Protease cũng thiết yếu trong virus, vi khuẩn và ký sinh trùng để nhân sao chép và lây lan các bệnh truyền nhiễm, trong tất cả các côn trùng, sinh vật và động vật để truyền bệnh hiệu quả Do vai trò quan trọng quy định trong vòng đời của các sinh vật, protease đã trở thành mục tiêu quan trọng cho nghiên cứu y tế và phát triển thuốc [18] và có nhiều ứng dụng trong công nghệ thực phẩm Do đó, nhu cầu về protease/enzyme ngày càng tăng do hiệu quả của chúng đem lại Năm 1995, ước tính ngành công nghiệp enzyme thế giới thu được 1 tỷ USD, năm 2005 khoảng 1,7-2 tỷ USD Châu Âu sản xuất 60% tổng số enzyme trên thế giới, số còn lại do Mỹ và Nhật Bản sản xuất

1.1.2 Phân loại protease

Protease được phân chia thành hai loại dựa theo vị trí hoạt động [16, 32]:

Exopeptidase: xúc tác phản ứng thủy phân liên kết peptide từ đầu amino hay cacboxyl của protein và tiếp tục hoạt động này đến khi phân cắt hết mạch peptide [14, 16] Dựa vào vị trí tác động trên mạ

[16]:

- Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một aminoacid, một dipeptide hoặc một tripeptide

- Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide

Trang 14

Endopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide đặc hiệu nằm giữa 2 amino acid bên trong của protein hay peptide [14, 16] Vị trí không gian của các amino acid tạo thành vị trí xúc tác được bảo tồn trong tự nhiên của các protease và cung cấp cách phân loại chúng thành 4 nhóm [16, 34]:

- Serin proteinase hay alkaline protease: là nhữ –OH của gốc serine đóng vai trò xúc tác trong trung tâm hoạt động Những enzyme này chứa

bộ ba xúc tác là His, Ser, Asp chịu trách nhiệm phân cắt, bộ ba này cố định chính xác trong không gian 3 chiều bằng các khung alpha- carbon của protease Yếu tố Ser thường không phản ứng và hoạt động như 1 nucleophile suốt quá trình xúc tác bằng cách nhường 1 điện tử cho nhóm cacbonyl cacbon của liên kết peptide để phân hủy Một acyl Ser được hình thành và một proton được nhường để giải phóng một nhóm amino nhờ yếu tố His ở trung tâm hoạt động Acyl enzyme sau đó được phân giải, sản phẩm acid cacboxylic sau đó được giải phóng và trung tâm hoạt động sau

đó được tái tạo [16] Nhóm này bao gồm hai lớp nhỏ là chymotrypsin và subtilisin Trypsin là họ lớn nhất, bao gồm cả enzyme của động vật có vú và vi khuẩn Một số

ví dụ phổ biến là enzyme tiêu hóa ở tuyến tụy như trypsin, chymotrypsin, elastase, cũng như các enzyme đông máu thrombin, plasmin, và nhiều enzyme bổ sung Ngược lại, họ subtilisin chỉ được tìm thấy trong vi khuẩn như subtilisin Carlsberg, subtilisin BPN [31] Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm, tối

ưu ở pH 7 và 11và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng

trực tiếp tham gia phản ứng xúc tác Cystein protease có một bộ đôi xúc tác bao gồm His và Cys tương tác với nhau Trong suốt quá trình phân giải protein, nhóm sulhydryt của yếu tố Cys hoạt động như 1 nucleophile bắt đầu tấn công nhóm

cacbonyl cacbon của liên kết peptide để phân giải Trong quá trình này, vòng

Imidazole của His ở trung tâm hoạt động rút bớt 1 proton ở nhóm sulfhydryl do đó làm cho nó càng mang tính nucleophile Một acyl enzyme được hình thành nhờ cacboxyl cacbon của cơ chất và nhóm sulfhydryl của Cys ở trung tâm hoạt động Việc giải phóng nhóm amino là nhờ vào His ở trung tâm hoạt động Nhóm cacboxyl

Trang 15

cacbon sau đó được phân giải từ nhóm thiol của protease và các yếu tố, trung tâm hoạt động được phục hồi [16]

Cystein proteasebao gồm các protease thực vật như papain, bromelin, ficin, enzyme của một số động vật có vú như lysosomal cathepsins, calpains cytosolic (kích hoạt canxi) cũng như các protease một số ký sinh Các cystein proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng [34]

- Aspartic proteinase: cũng được gọi là protease - axit, có 2 Asp ở trung tâm hoạt động Nhóm ᵞ-cacboxyl của Aspactat trong trung tâm hoạt động tham gia vào phản ứng xúc tác Hầu hết các aspartic protease thuộc nhóm pepsin Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin Các enzyme này hoạt động chủ yếu trong phạm vi pH acid 2-4 Rennin là một ngoại lệ hoạt động trong phạm vi pH từ 5,5 đến 7,5

- Metallo protease: trong trung tâm hoạt động thường có các cation hóa trị 2 trực tiếp tham gia phản ứng xúc tác Yếu tố His và Glu được cho là những amino acid cần thiết Trình tự nhận biết của protease này là -His-X-X-Glu-His- (X là amino acid bất kỳ) hoặc His-Glu-X-X-His Glu có thể nhường 1 điện tử cho nhóm cacbonyl cacbon của liên kết peptide trong suố

ợc tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn Các metallo proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính

và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA [16]

Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:

Protease acid: pH 2-4 có nhiều ở tế bào động vật, nấm men, nhưng ít thấy ở vi khuẩn

Protease trung tính có pH 7-8 như papain từ quả đu đủ, bromelain từ quả dứa,

ficin từ Ficus sp là những protease có nguồn gốc từ động vật Những protease này

là cystein protease, papain là protease ổn định với nhiệt độ nhất Vi khuẩn

Clostridium histolyticum sản xuất ra enzyme clostripain và Streptococcus spp sản

xuất ra enzyme streptopain, đều là cystein protease

Protease kiềm có pH 9-11

Trang 16

1.2 TEV protease

1.2.1 Giới thiệu chung về Tobacco Etch Virus

Tobacco Etch Virus (TEV) là virus gây bệnh ở thực vật thuộc chi Potyvirus,

họ Potyviridae, phân nhóm IV picornavirus [21, 35] TEV là virus RNA sợi đơn dương, không có vỏ bao bọc [5], hình dạng khúc khuỷu với chiều dài 730 nm, đường kính 12- 13 nm [39] Virus trưởng thành bao gồm xấp xỉ 2000 bản sao của protein capsid (CP) trong có chứa sợi RNA đơn dương không phân đoạn [5, 34] Hệ gene của TEV là phân tử RNA chứa 9596 nucleotide [15] liên kết cộng hóa trị với protein được mã hóa trong virus (VPg) ở đầu 5’ và 1 đuôi poly A ở đầu 3’[13], tỷ lệ phần trăm nucleotide là (20,1% C; 30,075% A; 22,8% G, và 27,1% U, hàm lượng phospho (0,46% ± 0,02 %) [11, 22] Tương tự như các virus sợi RNA đơn dương khác, hệ gene virus chứa 1 khung đọc mở mã hóa cho 1 polyprotein với trọng lượng phân tử

346 kDa [10, 22], polyprotein này được phân cắt bởi 3 protease của chính nó và protease của tế bào chủ [5, 20, 37] tạo ra các protein khác của virus Ba protease của virus xúc tác cho quá trình biến đổi sau dịch mã là P1, HC-Pro và NIa [21, 22] Protein chiếm 95% trọng lượng hạt virus TEV [11] Các phân tích đột biến và hóa sinh cho thấy hầu hết các protein đều có chức năng trực tiếp hoặc gián tiếp trong quá trình sao chép hệ gene của virus [22, 39]

Bảng 1.1: Chức năng dự đoán của các protein trong TEV

- Lây nhiễm từ tế bào này sang tế bào khác (dự đoán)

- Lây nhiễm vào rệp trung gian truyền dẫn

M Protein Không rõ, có thể vai trò trong việc nhân lên của virus

Helicase/NTP

ase

- Sao chép hệ gene (RNA helicase)

- Kích thích hoạt động của ATPase

- Lây nhiễm từ tế bào này sang tế bào khác (dự đoán)

Trang 17

- Tham gia vào truyền vector

- Lây nhiễm từ tế bào này sang tế bào khác (dự đoán) NIa-VPg Nhân bản hệ gene (Primer khởi tổng hợp RNA)

NIa-Pro Protease chính

NIB Sao chép bộ gene (RNA phụ thuộc RNA polymerase [RdRp]) 6K Chưa rõ, nhưng có thể vai trò sao chép RNA

Chữ viết tắt: P1: protein 1; HC-Pro:helper component-proteinase; CP: capsid

protein; NIa-VPg: Nucleotide inclusion a- viral protein virus genome

1.2.2 Nguồn gốc, phân loại và vai trò của TEV protease trong đời sống của virus

Hệ gene của TEV chứa một khung đọc mở (ORF), được dịch mã thành 1 polyprotein, sau đó trải qua quá trình sửa chữa sau dịch mã và phân cắt bởi 3 protease của virus là P1, HC- pro và NIa để tạo ra các protein khác nhau của virus (hình 1.1) P1 và HC- pro chỉ xúc tác cho 1 phản ứng tự phân giải protein ở đầu cacboxyl tương ứng của nó trong khi NIa xúc tác cho 7 hoặc 8 sự phân cắt còn lại trong suốt quá trình tự phân giải [21], TEV NIa protease (hoặc còn gọi là TEV protease) là vùng xúc tác 27kDa của NIa protease [37]

TEV protease được phân loại theo EC (Enzyme Commission) số: 3.4.22.44 Phân tích phân loại này như sau:

Enzymes

3 Hydrolases

3.4 Hoạt động ở liên kết peptide (peptidases)

3.4.22 Cysteine endopeptidases

3.4.22.44 Endopeptidase thể vùi trong nhân (NIa) TEV protease

TEV protease đóng vai trò chính trong việc phân giải protein trong quá trình

xử lý protein sau dịch mã, xử lý polyprotein gốc thành các protein chức năng, đồng thời cũng đóng vai trò trong việc nhân bản hệ gene của virus [16, 19]

Trang 18

Hình 1.1: Quá trình đồng biểu hiện và xử lý sau dịch mã của TEV

1.2.4 Cấu trúc của TEV protease

TEV NIa protease (TEV protease) là vùng xúc tác 27kDa 1.2) của NIa protease trưởng thành [39] NIa protease trưởng thành có khối lượng 49 kDa và xảy

ra quá trình tự phân cắt để tạo ra một protein liên kết với RNA của virus (VPg 21 kDa) và TEV NIa protease TEV protease gồm 234 amino acid ứng với amino acid

189 - 424 của protease trưởng thành [19]

Hình 1.2: Cấu trúc không gian của TEV protease

TEV protease là protease cystein có cấu trúc tương tự như các serin protease như trypsin hay chymotrypsin nhưng có chứa 1 cystein thiol thay vì serin hydroxyl

Trang 19

trong trung tâm hoạt động [13, 19] Enzyme này thuộc họ peptidase C4, có khối lượng phân tử khoảng 25-27 kDa [6, 39], có chức năng và cấu trúc tương đồng với proteases 3C picornavirus

Cấu trúc tinh thể của TEV protease cho thấy enzyme này chỉ gồm các tấm β, chứa 2 vùng song song nhưng đối nhau gấp khúc β, tiêu biểu cho các serine protease như trypsin với bộ ba xúc tác His46, Asp81 và Cys151 nằm ở giao điểm giữa 2 vùng [10, 12, 16, 19], bộ ba xúc tác này ứng với vị tríacid amin thứ 234, 269

và 339 trong protease trưởng thành [19] Các thí nghiệm cho thấy, nếu đột biến ở His46 và Cys151 thì TEV protease sẽ không còn hoạt tính, trong khi Asp81 có thể được thay thế bằng Glu nhưng không phải bằng Val, nhưng có 1 ngoại lệ: nếu thay Cys151 bằng Ser TEV protease sẽ giữ lại 1- 2 % hoạt tính của NIa kiểu dại [16] Hình dạng khung cacbon của 2 vùng cấu tạo TEV protease là tương tự nhau với độ lệch góc trung bình là 0,24 Å [19] TEV protease thường có xu hướng tự phân cắt

in vitro, tạo ra một protein có kích thước nhỏ hơn với hoạt tính giảm so với kiểu dại

Sự phân cắt xảy ra ở gần đầu C của TEV sau trình tự 218 tại 1 vị trí nhận biết không đặc trưng [10]

1.2.5 Cơ chất đặc hiệu và điều kiện hoạt động

TEV NIa protease nhận biết và cắt trình tự liên kết gồm 7 amino acid là X-X-Y-X-Q G/ S (trong đó X là amino acid bất kỳ), trình tự được tìm thấy phổ biến nhất là ENLYFQ G/S (Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln Gly/Ser) [10, 13, 24, 30] Trình tự này được đánh số từ P6- P1 P’1; các amino acid ở P6, P3, Pl, và P’l là trình tự bảo thủ và quan trọng quyết định tính đặc hiệu, amino acid ở các vị trí khác

E-có vai trò điều khiển sự phân cắt [13, 30] Kapust và các cộng sự [24] cho thấy, ở vị trí P’l của cơ chất có thể là Gly hoặc Ser và đây cũng là điểm cắt của TEV protease Ông và các cộng sự đã thiết kế 20 loại protein dung hợp khác nhau chứa các trình tự nhận biết của TEV protease chỉ khác nhau ở vị trí P’1, sau đó thực hiện phản ứng cắt với TEV protease từ đó đánh giá tác động của vị trí P’1 đến hiệu quả xúc tác của protease TEV và nhận thấy ảnh hưởng của các amino acid tại vị trí P’1 đến khả năng cắt của TEV protease như sau: \G> S> A> M> C> N> H> Y> K> D> Q> F> T> W> R> L> E> I> V> P Kết quả nghiên cứu còn cho thấy, việc thay thế các

Trang 20

amino acid làm giảm đáng kể hoặc mất hoàn toàn hoạt tính của TEV protease, khi thay đổi amino acid vị trí P5 và P2 có thể tăng hoặc giảm tỷ lệ phân cắt [16].Vai trò

và sự ảnh hưởng của từng amino acid trong trình tự nhận biết trên đến tốc độ (Vmax) và hiệu suất phản ứng của TEVp đã được Tsuchida và cộng sự khảo sát trong một nghiên cứu gần đây Trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu thay thế các vị trí amino acid trong trình tự nhận biết kinh điển của TEVp là Glu – Asn – Leu – Tyr – Phe – Gln – Gly/Ser và nhận thấy: khi thay Phe bằng Leu, Val, Ser và Cys giá trị Vmax của enzyme lần lượt là 73%, 43%, 42%, 25% [37] Trong một nghiên cứu trước đó, Dougherty và cộng sự chỉ ra rằng khi thay Phe bằng Leu, Val, Ser thì tỷ lệ phân cắt cơ chất của TEV protease là 20%, còn khi thay bằng Cys thì tỷ

lệ phân cắt cơ chất không thay đổi Kapust và cộng sự quan sát thấy khi thay Gly bằng Ala, Ser, Ile, Arg thì giá trị Vmax của TEV lần lượt là 96%, 92%, 17%, 11%, còn tỷ lệ phân cắt cơ chất khi thay Gly bằng Ser và Ala là như nhau Trong khi đó khi thay thế Gly bằng Ile và Arg thì tỷ lệ phân cắt cơ chất tương ứng là 60%, 70% [24] Kết quả nghiên cứu của các nhóm trên có sự sai khác nhất định, điều này có thể là do họ sử dụng phương pháp nghiên cứu khác nhau Các tác giả đứng đầu là Suchudia dùng phương pháp huỳnh quang HAFCOM (Homogeneous Assay for Fluorescence Concentrated On Membrane) [31], trong khi đó nhóm của Dougherty

và cộng sự sử dụng phương pháp quét hình ảnh (Scanning of the band in dried polyacrylamid gel), còn Kapust và cộng sự sử dụng phương pháp đánh giá ngay trong hệ thống nội bào (intracellular processing system) để phân tích khả năng phân cắt cơ chất của TEV protease [25]

TEV protease được cho là hoạt động tối ưu ở dung dịch có thành phần: 50

mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,5 mM EDTA và 1mm DTT.Tuy nhiên, enzyme này có thể hoạt động ở dải pH khá rộng từ 4- 9 trong nhiều loại đệm khác nhau (phosphat, MES và acetate) và hoạt động không hiệu quả nếu thêm glycerol hoặc sorbitol với

tỷ lệ dưới 40% (v/v) TEV proteinase thể hiện nhiều đặc tính của picornaviral và comoviral proteinases như bị ức chế hoạt động bởi Zn2+

, iodoacetamide, và ethylmaleimide, trong khi hầu hết các chất ức chế protease khác không có hiệu lực

N-ở nồng độ tác dụng thông thường [15], ví dụ như PMSF và AEBSF (1mM), TLCK (1mM), Bestatin (1mg/ml), pepstatin A (1mM), EDTA (1mM), và E-64

Trang 21

(3mg/ml) Kẽm ức chế hoạt động của enzyme ở nồng độ 5mM hoặc cao hơn [18,

23, 29]

1.2.6 Ưu điểm và hạn chế của TEV protease

TEV protease có tính đặc hiệu cơ chất cao và hoạt động được trong môi trường pH rộng (4-9) và lực liên kết ion mạnh nên có tính linh hoạt cao hơn các protease khác Enzyme này hoạt động trên một phạm vi nhiệt độ rộng từ 40C- 370C [14, 27] Nhiệt độ hoạt động tối thích là 340C [27], tuy nhiên ở 40C TEV protease vẫn hoạt động tốt với đầy đủ hoạt tính Điều này làm giảm sự phân giải protein của protein đích [39], đặc biệt với các protein phụ thuộc nghiêm ngặt vào nhiệt độ, dễ bị phân hủy ở nhiệt độ cao [9] Các TEV protease tái tổ hợp duy trì hoạt động cao trong nhiều hệ dung dịch đệm trong sắc ký và chịu được nồng độ cao của chất bổ sung thường được sử dụng trong tinh chế protein, chẳng hạn như ethylene glycol, EGTA, Triton X-100, Tween-20, NP-40, chaps, urê, SDS, guanidine hydrochloride

và β-mercaptoethanol [24, 29]

Nhiều nghiên cứu cho thấy, TEV protease nhận biết và cắt chính bản thân

nó, hay nói cách khác là tự phân cắt để tạo thành một protease ngắn hơn với hoạt tính giảm đi rất nhiều [24, 30] Đặc tính này gây khó khăn cho quá trình tinh sạch

để tách các sản phẩm bị cắt ngắn ra khỏi các protease hoàn chỉnh cũng như ra khỏi sản phẩm phân cắt của protein đích Hơn nữa, sự mất hoặc giảm hoạt tính trong việc bảo quản các enzyme là một lo ngại đáng kể Việc biểu hiện TEV protease trong

E.coli gặp phải trở ngại như năng suất thấp và dạng hòa tan ít [9, 26] Trong thực tế,

TEV protease tái tổ hợp thường hòa tan ở nồng độ dưới 1mg/ml và duy trì đặc tính

ở 50% (v/v) glycerol [9] Để cắt cơ chất hiệu quả, vị trí nhận biết của TEV protease trên phân tử protein đích cần Gly hoặc Ser ở vị trí P’1 Do đó, nếu protein dung hợp hay đuôi ái lực gắn với protein đích ở đầu N thì sau khi bị loại bỏ bởi TEV protease, các protein đích thường sẽ giữ lại Ser hoặc Gly ngoại lai (ở vị trí P’1) tại đầu N của

nó, và trong một số trường hợp điều này có thể ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của protein đích [25]

1.2.7 Tình hình nghiên cứu TEV protease tái tổ hợp trong và ngoài nước

Do tính đặc hiệu cơ chất cao và tầm quan trọng của enzyme này trong nghiên cứu y học, sinh học nên TEV protease được nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới

Trang 22

quan tâm nghiên cứu Một trong các hướng tiếp cận chủ yếu là sử dụng công nghệ DNA tái tổ hợp cho phép tạo TEVp tái tổ hợp (rTEVp) để có thể sản xuất lượng lớn

- Năm 1995, Parks và cộng sự đã tách dòng và biểu hiện toàn bộ gene mã hóa

TEVp với kích thước 27 kDa trong E.coli chủng (BL21) sử dụng vector biểu hiện

pLysS Tuy nhiên, rTEVp sau khi tinh sạch bị cắt mất 24 amino acid đầu C và có hoạt tính thấp [30]

- Năm 2002, nhóm nghiên cứu đứng đầu là Kapustđã thay thế amino acid Ser ở vị trí 219 thành Val trong phân tử TEVp và nhận thấy dạng đột biến có cấu trúc bền vững hơn và hoạt tính cao hơn so với enzyme dạng dại [25]

- Năm 2002, Stols và cộng sự sử dụng vector biểu hiện pMCSG7 để biểu hiện TEVp.Trong hệ thống này, TEVp được chèn vào sau trình tự dẫn đường và một đoạn gene mã hóa cho 6 Histidin tại đầu N Kết quả là rTEVp được biểu hiện mạnh, vẫn có hoạt tính sinh học và bước đầu nhóm nghiên cứu đã tinh chế được rTEVp bằng cột sắc ký ái lực Ni – Resin [36]

- Năm 2007, Fang và cộng sự sử dụng phương pháp đồng biểu hiện(co-expression)

TEVp và chaperon trong E.coli và biểu hiện ở nhiệt độ thấp Kết quả thu được rất

khả quan, rTEVp được biểu hiện nhiều ở dạng hòa tan và có hoạt tính sinh học cao [27]

- Năm 2007, các tác giả khác đã nghiên cứu kết hợp nhiều phương pháp như cắt bỏ amino acid từ vị trí 238-242 tại đầu C, dung hợp TEVp với MBP (Maltose binding protein), GST (Gluthadione S Transferase), thay đổi vector biểu hiện, thay đổi vật

chủ biểu hiện nhằm cải thiện khả năng biểu hiện và độ hòa tan của rTEVp.Nghiên

cứu này cho thấy, việc loại bỏ 4 amino acid đầu C kết hợp với môi trường tự cảm ứng biểu hiện (auto-induction medium), không bổ sung chất cảm ứng IPTG, làm tăng tính hòa tan và hoạt tính của rTEVp Việc dung hợp với GST cũng làm tăng

đáng kể mức độ biểu hiện của rTEVp [32]

- Cũng vào năm 2007, một nhóm nghiên cứu khác đứng đầu là Cabrita đã sử dụng phần mềm PoPMuSiC để phân tích trình tự và cấu trúc của TEVp và tìm ra một số amino acid đóng vai trò quan trọng quyết định mức độ biểu hiện, độ hòa tan và hoạt

tính của rTEVp khi biểu hiện ở E.coli Chứng minh bằng thực nghiệm, nhóm

Trang 23

nghiên cứu cho thấy, khi thay thế một số amino acid như Lys ở vị trí 45 thành Phe (Lys45Phe), và Ser ở vị trí 135 thành Gly (Ser135Gly) làm tăng độ hòa tan của rTEVp lên 6 lần, đặc biệt khi thay thế cùng lúc 2 amino acid là Lys56Val/Ser135Gly độ hòa tan của rTEVp tăng lên trên 40 lần so với dạng dại [7, 9]

- Năm 2009, ba nhà nhà khoa học gồm Tropea, Cherry và Waugh đã làm tăng khả

năng hòa tan của rTEVp biểu hiện ở E.coli bằng cách dung hợp với MBP và thay

thế Ser ở vị trí 219 thành Val [23]

- Năm 2011, Miladi và cộng sự đã nghiên cứu dung hợp TEVp với Streptag II

(Streptag II-TEVp) và biểu hiện protein dung hợp trong E.coli ở điều kiện nhiệt độ

thấp [6] Hệ thống Streptag được ứng dụng rộng rãi trong việc sản xuất, tinh sạch các protein tái tổ hợp Kết quả cho thấy việc dung hợp với Streptag II làm tăng đáng

kể về độ hòa tan của TEVp, protein tái tổ được tinh sạch bằng sắc ký ái lực tactin với hiệu quả lên đến 99% Hiệu quả của việc tinh sạch bằng phương pháp Streptag đã được Lichty và cộng sự khẳng định vào năm 2005.Nghiên cứu của Miladi và cộng sự cũng cho thấy Streptag II-TEVp vẫn giữ được hoạt tính enyme tương tự 6xHis-TEVp [6]

Strep-Cho đến nay chúng tôi chưa tìm thấy công bố nào về nghiên cứu biểu hiện và tinh sạch TEVp tái tổ hợp tại Việt Nam

1.3 Tổng quan về Green Fluorecent Protein (GFP)

1.3.1 Đặc điểm cơ bản của GFP

GFPlà một protein, được đặt tên bởi MorinvàHastings[40], chứa 238 amino acid có khối lượng phân tử 26,9 kDa và có khả năng phát ra huỳnh quang màu xanh

lá khi được chiếu tia sáng màu xanh da trời[40] GFP được phân lập chủ yếu từ sứa

Aequorea Victoria hoặc Renilla reniformis.Trong A victoria có hai loại protein

phát quang là Aequorin và GFP Aequorin khi tương tác với ion Ca2+ sẽ phát ra ánh sáng xanh da trời, còn GFP được kích thích bởi ánh sáng da trời sẽ phát ra huỳnh quang màu xanh lá

GFP có cấu trúc dạng ống beta điển hình, bao gồm 11 mạch β được liên kết với nhau bởi xoắn α và chứa nhóm mang màu (fluorofore) ở trung tâm của ống[38,

40, 41].Ống trụ có đường kính khoảng 30 A0 và chiều dài 40 A0 Khi phân cắt GFP

Trang 24

thành những đoạn hexapeptide (đoạn có 6 gốc amino acid), bộ ba amino 67(Ser-Tyr-Gly) trongtrình tựGFP tự nhiêntạo thànhnhóm mang màuhuỳnh quangp-hydroxybenzylideneimidazolinone Đây là cấu trúc thường gặp trong tự nhiên, tuy nhiên chỉ khi bộ ba amino acid nằm ở trung tâm của cấu trúc ống beta (như trong cấu trúc của GFP), bộ ba này mới dẫn đến khả năng phát huỳnh quang.Cấu trúc dạng ống beta này khó bị biến tính bởi nhiệt độ, pH hay các chất gây biến tính.GFP bền ở nhiệt độ 780C, pH 5- 12 hay trong đệm có nồng độ ure đậm đặc 6M[27]

acid65-Hình 1.3 :Cấu trúc không gian của GFP

Quá trình thành thục của GFP diễn ra như sau: trong môi trường thuỷ phân, xảy ra phản ứng giữa gốc carboxyl của Ser65 và gốc amino của Gly67, dẫn đến sự hình thành hệ thống vòng imidazol-5-one heterocyclic nitrogen Quá trình oxi hoá tiếp sau đó tạo liên kết giữa vòng Imidazol với Tyr66 và do đó tạo thành protein có hoạt tính

GFP t nhiên từ A victoria tồn tại ở hai trạng thái : dạng proton hoá (dạng

trội) và dạng không proton hoá (hiếm gặp hơn), tương ứng có hai đỉnh kích thích:đỉnh chính ở bước sóng 395nm và đỉnh phụ có bước sóng 475nm Dưới ánh sáng kích thích, GFP phát ra ánh sáng có bước sóng 509nm, tương ứng với ánh sáng màu xanh lá trong phổ ánh sáng nhìn thấy, ngay cả khi kích thích dưới ánh sáng

UV, GFP vẫn có khả năng phát huỳnh quang

Trang 25

Hình 1.4.Đỉnh kích thích huỳnh quang (nét liền) và đỉnh huỳnh quang phát ra

(nét đứt) của GFP tự nhiên từ A victoria

1.3.2 Super folder GFP và các biến thể khác của GFP

GFP tự nhiên có một vài nhược điểm như phổ kích thích lưỡng cực, kém bền với ánh sáng và cuộn gấp kém ở 370C Tuy nhiên, với tiềm năng ứng dụng to lớn, nhiều biến GFP đã được tạo ra nhằm mục đích cải thiện tính hòa tan, độ bền

và gấp cuộn của protein bằng cách dung hợp với các protein khác

Biến thể của GFP được nghiên cứu đầu tiên vào năm 1996 bởi Willem Stemmer bằng kỹ thuật DNA shuffting [42] với mục tiêu cải thiện toàn bộ tế bào

huỳnh quang trong E.colikhi biểu hiện GFP Sau 3 chu kỳ DNA shuffting và lựa

chọn dựa trên cường độ huỳnh quang với sự kích thích của tia cực tímcho thấy huỳnh quang tăng gấp 45 lần so với clontech pGFP thương mại Tuy nhiên, đặc tính quang phổ cũng như tỷ lệ thành thục không thay đổi(T1/2 = 95 phút ở 37oC trong toàn bộ tế bào) Đột biến GFP cycle 3 so với GFP ban đầu là 3 amino acid kỵ nước được thay thế bằng3 amino acid ưa nước Vì vậy, cường độ huỳnh quang được cải thiện có thể do giảm tập hợp protein có bề mặt kỵ nước và làm tăng độ hòa tan của GFP

Mười năm sau đó (2006), các superfolder GFP(sfGFP) được thiết kế bởi phòng thí nghiệm của Geoffrey Waldo với mục đích tạo ra một protein có ít xu

hướng gấp cuộn sai khi dung hợp với một protein gấp cuộn kém trong E.coli Sử

dụng một GFP folding reporter (frGFP) chứa đột biến cycle 3 và EGFP dung hợp với một protein gấp cuộn kém-H subunit ferritin, protein này không hòa tan khi biểu

hiện trong E.coli Sau nhiều lần đột biến và sàng lọc huỳnh quang thu được sfGFP

với cường độ huỳnh quang mạnh chứa 6 đột biến mới Ferritin-sfGFP được tìm thấy

có cường độ huỳnh quang gấp 50 lần so với protein dung hợp ban đầu Khi biểu hiện riêng rẽ, tế bào biểu hiện sfGFP có cường độ sáng gấp hai lần so với frGFP, đặc biệt là phổ kích thích và phát xạ, QY và EC tương tự nhau ở cả hai protein

Trang 26

Tỷ lệ gấp cuộn được đo bởi việc biến tính protein bằng Urea Sau đó rửa Urea và đo thời gian nó mang biến thể GFP và thu huỳnh quang Trong vài trường hợp, mặc dù hai protein thu được hiệu suất 95% trong vòng 4 phút, sfGFP nhanh hơn 3,5 lần so với tỷ lệ ban đầu sfGFP cũng được xử lý với urea ở nồng độ cao, và thu được cường độ huỳnh quang cao hơn so với một loạt các protein dung hợp khác nhau với các đặc điểm khác nhau (mức độ biểu hiện, khả năng hòa tan…)

Năm 2007, nhóm của David Liu sử dụng sfGFP trong một nỗ lực để tạo ra một protein GFP mới có độ hòa tan cao.Họ đã thay thế nhiều amino acid trung tính

ở phía ngoài của protein với các amino acid kiềm hoặc axit để tạo ra một biến thể (scGFP) GFP(+36) và GFP (-30).scGFP này có độ hòa tan cao, có khả năng chống lại sự biến tính ngay cả khi đun sôi protein ở 100oC Các đặc tính quang phổ của scGFP tương tự như GFP và sfGFP

Năm 2008, Fisher & DeLisa tạo ra một biến thể của GFP là superfast GFP Nhờ việc nghiên cứu cơ chế kiểm soát bài tiết protein của tế bào, họ đã sàng lọc và tạo ra biến thể gấp cuộn mới Trong chu chất, GFP dường như không phát huỳnh quang Nếu protein gấp cuộn đủ nhanh, cơ chế kiểm soát chất lượng ngăn cản sự tiết của nó dẫn đến protein còn nằm trong tế bào chất Đột biến GFP ban đầu của họ

là GFPmut2, một biến thể mà trước đây đã được tối ưu hóa để phân tích FACS, chứa các đột biến S65A/V68L/S72A nên sau nhiều vòng lựa chọn, họ thu được một dòng đặt tên là superfastGFP Đột biến điểm S65T, trong đó Ser65 được thay thế bằng Threonine, Alanine, Cysteine hay Leucine, cải thiện đáng kể đặc điểm quang phổ của GFP(18) Đột biến này làm mất đi đỉnh hấp phụ ở 395nm, thay vào đó đỉnh

475 nm trở thành đỉnh hấp phụ chính.Đột biến này rất được quan tâm do protein mới có phổ hấp phụ phù hợp với đặc điểm quang phổ của hệ thống lọc FITC (Fluorescein isothiocyanate), làm tăng tính ứng dụng của protein này trong nghiên cứu Đột biến này khi được kết hợp với các đột biến ở các vị trí gần nhân fluorophore khác như V68L hay S72A sẽ làm tăng tính bền của phổ huỳnh quang

GFP được sử dụng chủ yếu trong phòng thí nghiệm là EGFP, GFP cải tiến EGFP do đột biến điểm F64L ở GFP, làm tăng khả năng cuộn gấp của protein ở

370C, tăng khả năng hấp phụ ánh sáng kích thích và phát huỳnh quang, đồng thời

Trang 27

làm tăng độ bền của protein, ngay cả khi được dung hợp với một cấu trúc peptide khác Hai đỉnh hấp phụ và phát quang của EGFP lần lượt là 490nm và 509nm

Nhiều đột biến khác trong vùng fluorophore tạo ra các protein phát huỳnh quang ở các màu khác nhau như màu vàng (YFP), màu xanh lam (CFP) Protein YFP do đột biến T203Y, liên quan đến tương tác tĩnh điện giữa Tyr thay thế và nhân fluorophore YFP có đầy đủ tính chất và cấu trúc giống GFP, nhưng bước sóng kích thích và bước sóng phát ra tương ứng là 514nm và 527nm

1.4.1 Hệ thống biểu hiện E.coli

E.coli là loài vi khuẩn Gram âm, có một nhiễm sắc thể riêng lẻ nằm ở nhân tế

bào, với chiều dài 4600bp mã hóa cho khoảng 300 loại protein khác nhau E.coli đã được nghiên cứu rất kỹ về mặt sinh học ở mức độ phân tử.E.coli phân chia tế bào

rất nhanh, trung bình cứ 22 phútlại nhân bản một lần Đặc biệt, quá trình phiên mã

và quá trình dịch mã luôn đi đôi với nhau.Ở E.coli không có hiện tượng sửa chữa

sợi RNA thông tin sau khi phiên mã, các sợi RNA thông tin mới tổng hợp được sử

dụng ngay vào quá trình dịch mã Chính vì vậy,E.coli có thể được coi là một trong

những tế bào vật chủ đơn giản nhất, sử dụng rất hữu hiệu trong quá trình tách dòng và biểu hiện gene tái tổ hợp

E.coli BL21 (DE3) Star™ là chủng mang đột biến gene rne (gene mã hóa

Rnase E) làm cho enzyme Rnase E mất hoạt tính, làm thoái hóa mRNA, qua đó làm tăng tính bền vững cho mRNA Đồng thời, chủng thiếu hụt Lon protease (protease nội bào) và ompT protease (protease màng ngoài tế bào)nênhạn chế sự phân cắt của protease với protein ngoại lai, giúp cho protein ngoại lai ổn định hơn trong tế bào sau khi tổng hợp Thông thường, protein ngoại lai được biểu hiện tốt trong chủng

chủ nhưng do trong hệ gene E coli BL21 (DE3) Star™ có chứa gene mã hóa

T7-RNA polymerase, gene này chịu sự kiểm soát của Lac operator, đồng thời trên hệ plasmid pET cũng thiết kế gene ngoại lai dưới sự kiểm soát của T7 promoter và lac operator, gene này chỉ hoạt động khi có mặt chất cảm ứng IPTG

1.4.2 Vector biểu hiện pET

Yêu cầu tối thiểu của một hệ thống biểu hiện có hiệu quả là sự có mặt của một trình tự promotor mạnh và có thể điều chỉnh trước một gene nhân dòng

Trang 28

Promotor mạnh phải có ái lực cao với ARN polymerase, kết quả là vùng nằm sau bên cạnh được phiên mã thường xuyên và liên tục Khả năng điều chỉnh của một promotor tạo cho tế bào và các nhà nghiên cứu có thể kiểm soát mức độ phiên mã một cách chính xác Một loạt các plasmid khai thác độ mạnh của promoter T7 là các pET vector[1].Trong đề tài nghiên cứu này chúng tôi sử dụng vector pET 21a+ để biểu hiện đoạn gene mã hóa sfGFP-TEVp

Vector pET 21a+ có kích thước 5443bp được thiết kế dựa trên cơ sở của vector pBR322, có vị trí của T7 promoter, vùng Lac Operator là vị trí nhận biết và gắn của gene điều hòa giúp cho quá trình điều hòa hoạt động của gene, vùng cắt gắn chứa 12 vị trí cắt của enzyme giới hạn Quá trình biểu hiện của gene đích đuợc kích hoạt bằng cách cung cấp một nguồn T7 ARN polymerase trong tế bào vật chủ T7 ARN polymerase có tính chọn lọc cao và hoạt động mạnh, khi kích hoạt hầu hết các

tế bào vi khuẩn đều tập trung vào biểu hiện gene đích dẫn đến sản phẩm protein tái

tổ hợp được biểu hiện có thể chiếm hơn 50% protein tổng số của tế bào chỉ sau vài giờ cảm ứng.Cũng như các vector khác, pET cũng mang các gene kháng kháng sinh giúp cho việc chọn lọc và duy trì các plasmid trong tế bào vi khuẩn Vector pET 21a+ chứa gene kháng ampicillin.Ngoài ra, việc biểu hiện bằng vector pET 21a+ còn làm cho sản phẩm protein đích được biểu hiện ra sẽ được gắn với một đoạn 6 Histidin do đó có thể dễ dàng tinh sạch các protein liên kết này bằng cột sắc ký ái lực

Trang 29

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Gene mã hóa TEV protease (TEVp) đã được tách dòng trong vector tách

dòng pCR2.1(pTEVp) do phòng Vi sinh vật học phân tử - Viện Công nghệ sinh học

- Viện khoa học và Công nghệ Việt Nam cung cấp.Vector tách dòng mang gene mã hoá sfGFP(pGFP) được cung cấ

2.1.2 Hoá chất và sinh phẩm

Thang DNA chuẩn, thang protein chuẩn, các enzyme giới hạn được cung cấp bởi hãng New England Biolabs, Mỹ; T4 DNA ligase từ Invitrogen, Mỹ Ethidium bromide, IPTG, X-gal, Tris-HCl, glycine, chloroform, iso-amylalcohol, TEMED, PMSF, Tris X100, ethanol, methanol, glycerol, acrylamid, bis-acrylamid, cao nấm men, tryptone, agarbacter, agarose và một số hoá chất khác dùng trong sinh học phân tử mua từ các hãng có uy tín như Sigma, BioLab, BioRad, Merck, Fermentas

Kit tinh sạch plasmid - S.N.A.P.TM, kit tinh sạch protein - Nickel chelating Resin (Invitrogen), bộ kit tách dòng - TA cloning Kit (Invitrogen)

Trang 30

Vector biểu hiện pET21a(+) của Novagen, chủng vi khuẩn E coli BL21

(DE3) Star™ dùng để biểu hiện protein tái tổ hợp

2.1.3 Trang thiết bị và máy móc

Máy PCR,Máy đo quang phổ (Shimadzu, Nhật Bản), máy ly tâm lạnh (Microcentrifuge – Sorvall, Mỹ), tủ nuôi cấy tế bào (Multitron, Đức), máy ổn nhiệt dùng nước (Memmert, Đức), bộ điện di DNA (Mupid, Nhật Bản), máy soi chụp ảnh gel (Bio – Rad), bộ điện di protein (BioRad), máy khuấy trộn vortex (RotoLab, OSI), pipettman các loại (Gilson), lò vi sóng (Sam sung), cân phân tích 10-4g, cân điện tử 10-2

g (Mettler Toledo), máy siêu âm, máy lắc

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Hình 2.1: Sơ đồ minh họa các bước trong nghiên cứu biểu hiện và tinh sạch

sfGFP-TEVp

Kiểm tra hoạt tính của sfGFP-TEVp tái tổ

hợp

Tinh sạch sfGFP-TEVp tái tổ hợp

Biểu hiện lượng lớn sfGFP-TEVp tái tổ

hợp

Xác định trạng thái và tối ưu hóa điều kiện

biểu hiện của sfGFP-TEVp

Biểu hiện sfGFP-TEVp trong vi khuẩn

E.coli chủng BL21 (DE3) star

ế vector biểu hiện pET21(a+) mang

genesfGFP-TEVp

Định dạng
Số trang	60
Dung lượng	3,2 MB