Nâng cao hiệu suất biểu hiện TEV protease trong vi khuẩn e coli bằng protein dung hợp super folder green fluorescent protein (sfGFP)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT Vũ Thị Hiền NÂNG CAO HIỆU SUẤT BIỂU HIỆN CỦA TEV PROTEASE TRONG VI KHUẨN E.coli BẰNG PROTEIN DUNG HỢP SUPER FOLDER GREEN FLUORESCENT PROTEIN (sfGFP) LUẬN VĂN THẠC SĨ Hà Nội – 2013 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT Vũ Thị Hiền NÂNG CAO HIỆU SUẤT BIỂU HIỆN CỦA TEV PROTEASE TRONG VI KHUẨN E.coli BẰNG PROTEIN DUNG HỢP SUPER FOLDER GREEN FLUORESCENT PROTEIN (sfGFP) Chuyên ngành: Hóa sinh Mã số : 06 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. ĐỒNG VĂN QUYỀN Hà Nội – 2013 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ LỜI CẢM ƠN! Tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc nhất tới TS. Đồng Văn Quyền, Trưởng phòng Phòng Vi sinh vật học phân tử, Viện Công nghệ sinh học- Viện Hàn lâm Khoa học công nghệ Việt Namđã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơnPGS.TS. Đinh Duy Khángvà các cán bộ Phòng Vi sinh vật học phân tử đã động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu đề tài này. Tôi xin cảm ơn các thầy, cô thuộc Viện Công nghệ Sinh học, Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật đã giúp đỡ và chỉ bảo tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu khoa học. Tôi xin cảm ơn lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen, nơi tôi làm việc, đã tạo điều kiện tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thiện luận văn. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Hà Nội, ngày tháng năm 2013 Học viên Vũ Thị Hiền Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC TỪ VIẾT TĂT Stt Từ viết tắt Tên đầy đủ 1 Ala Alanin 2 bp Base pair 3 APS Amonium persulfat 4 Arg Arginin 5 Asn Asparagin 6 Asp Aspartic acid 7 bp Base pair 8 CBB Coomassie brilliant blue 9 Cys Cystein 10 Đc Đƣờng chạy 11 DNA Deoxyribonucleic Acid 12 DTT Dithiothreitol 13 E.coli Escherichia coli 14 EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid 15 EtBr Ethidium bromid 16 Gln Glutamin 17 Glu Acid glutamic 18 Gly Glycin 19 GST Glutathione transferase 20 His Histidin 21 TEV Tobacco Etch Virus 22 TEVp Tobacco Etch Virus protease 23 GFP Green Fluorecent Protein 24 sfGFP Super folder Green Fluorecent Protein 25 sfGFP-TEVp Super folder Green Fluorecent Protein- Tobacco Etch Virus protease Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 26 IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside 27 kDa Kilo Dalton 28 LB Luria Bertani 29 NaOAC Sodium acetate 30 OD Optical Density 31 PCR Polymerase chain reaction 32 PMSF Phenylmethanesunfonylfluoride 33 SDS Sodium dodecyl sulfate 34 TAE Tris- acid acetic – EDTA 35 TEMED N, N, N’, N’- tetramethyl- ethylenediamine 36 v/ v Volume/ volume: thể tích/ thể tích 37 X-gal 5-bromo-4-chloro-3indoly-β-D-galactoside Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 1.1 Chức năng dự đoán của các protein trong TEV. Bảng 2.1 Thành phần phản ứng cắt gen sfGFP-TEVp bằng enzyme giới hạn. Bảng 2.2 Thành phần phản ứng cắt vector pET21(a+) bằng enzyme giới hạn. Bảng 2.3 Thành phần phản ứng gắn gene vào vector biểu hiện. Bảng 2.4 Thành phần và các dung dịch đệm SDS-PAGE. Bảng 2.5 Thành phần phản ứng cắt GP120 tái tổ hợp bằng sfGFP- TEVp. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang Hình 1.1 Quá trình đồng biểu hiện và xử lý sau dịch mã của TEV Hình 1.2 Cấu trúc không gian của TEV protease Hình 1.3 Cấu trúc không gian của GFP Hình 1.4 Đỉnh kích thích huỳnh quang (nét liền) và đỉnh huỳnh quang phát ra (nét đứt) của GFP tự nhiên từ A. victoria Hình 2.1 Sơ đồ minh họa các bƣớc trong nghiên cứu biểu hiện và tinh sạch sfGFP-TEVp. Hình 2.2 Sơ đồ minh họa quá trình loại bỏ đuôi TRX khỏi protein dung hợp GP120- TRX nhờ sfGFP-TEV protease. Hình 2.3 Sơ đồ thể hiện quá trình thiết kế vector biểu hiện chứa gene mã hóa sfGFP-TEVp. Hình 3.1 Sơ đồ thể hiện quá trình thiết kế vector biểu hiện chứa gene mã hóa sfGFP-TEVp. Hình 3.2 Điện di sản phẩm PCR khuếch đại genesfGFP-TEV protease Hình 3.3 Điện di plasmid và sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bởi Nde I và Xho I. Hình 3.4 sfGFP-TEVp Hình 3.5 Kết quả biểu hiện sfGFP-TEVprotease Hình 3.6 Kết quả biểu hiện sfGFP-TEV protease ở các nhiệt độ khác nhau Hình 3.7 Kết quả xác định trạng thái tồn tại của protein sfGFP- TEVp khi biểu hiện ở các nhiệt độ khác nhau. Hình 3.8 Kết quả biểu hiện sfGFP-TEVp ở các thời gian cảm ứng khác nhau Hình 3.9 Kết quả biểu hiện sfGFP-TEVp ở các nồng độ IPTG Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Hình 3.10 Kết quả tinh sạch sfGFP-TEVp tái tổ hợp Hình 3.11 Điện di đồ kết quả kiểm tra hoạt tính của sfGFP-TEV. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Đại cƣơng về Protease 3 1.1.1. Khái niệm protease 3 1.1.2. Phân loại protease 3 1.2. TEV protease 6 1.2.1. Giới thiệu chung về Tobacco Etch Virus 6 1.2.2. Nguồn gốc, phân loại và vai trò của TEV protease trong đời sống của virus. 7 1.2.4. Cấu trúc của TEV protease 8 1.2.5. Cơ chất đặc hiệu và điều kiện hoạt động 9 1.2.6. Ưu điểm và hạn chế của TEV protease 11 1.2.7. Tình hình nghiên cứu TEV protease tái tổ hợp trong và ngoài nước 11 1.3. Tổng quan về Green Fluorecent Protein (GFP) 13 1.3.1. Đặc điểm cơ bản của GFP 13 1.3.2. Super folder GFP và các biến thể khác của GFP 15 1.4. ện TEVp 17 1.4.1. Hệ thống biểu hiện E.coli 17 1.4.2. Vector biểu hiện pET 17 CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1. Vật liệu 19 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 19 2.1.2. Hoá chất và sinh phẩm 19 2.1.3. Trang thiết bị và máy móc 20 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 20 2.2.1. Thiết kế vector biểu hiện mang gene mã hóa sfGFP-TEVp 21 2.2.2. Phương pháp cắt bằng enzyme giới hạn 21 2.2.3. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose 22 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 2.2.4. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến E.coli 23 2.2.5. Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩnE.coli 24 2.2.6. Phương pháp biểu hiện protein tái tổ hợp trong E. coli 25 2.2.7. Phương pháp xác định trạng thái tồn tại của TEVp 25 2.2.8. Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide 26 2.2.9. Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng cột Probond Nickel- Chelating Resin 27 2.4.11. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford 28 2.2.11. Phương pháp thử hoạt tính của sfGFP-TEV protease 29 CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1. Thiết kế vector biểu hiện psfGFP-TEVp 31 3.2. Kiểm tra khung đọc của gene sfGFP-TEVp trong vector pET21(a+) 34 3.3. Kết quả biểu hiện sfGFP-TEVp trong E. coli BL21 (DE3) Star™ 35 3.4. Tối ƣu hoá các điều kiện biểu hiện 36 3.3.1 Ảnh hưởngcủa nhiệt độ nuôi cấy 37 3.3.2. Ảnh hưởng củ 39 3.3.3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 39 3.5. Kết quả tinh chế sfGFP-TEVp 41 3.6. -TEVp 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 [...]... nhờ sự hiện diện của huỳnh quang .Super folder Green Fluorescent Protein (sfGFP), một loại GFP ả ấp cuộn mạnh tăng độ hòa tan, độ bền vàgấp cuộn của protein Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, hiệu suất biểu hiện Nâng cao TEVprotease trong vi khuẩn E. coli bằng protein dung hợp super folder Green Fluorescent Protein (sfGFP) nhằm TEV protease Đề... đƣợc phân loại theo EC (Enzyme Commission) số: 3.4.22.44 Phân tích phân loại này nhƣ sau: Enzymes 3 Hydrolases 3.4 Hoạt động ở liên kết peptide (peptidases) 3.4.22 Cysteine endopeptidases 3.4.22.44 Endopeptidase thể vùi trong nhân (NIa) TEV protease TEV protease đóng vai trò chính trong vi c phân giải protein trong quá trình xử lý protein sau dịch mã, xử lý polyprotein gốc thành các protein chức năng,... chép bộ gene (RNA phụ thuộc RNA polymerase [RdRp]) 6K Chƣa rõ, nhƣng có thể vai trò sao chép RNA Chữ vi t tắt: P1: protein 1; HC-Pro:helper component-proteinase; CP: capsid protein; NIa-VPg: Nucleotide inclusion a- viral protein virus genome 1.2.2 Nguồn gốc, phân loại và vai trò của TEV protease trong đời sống của virus Hệ gene của TEV chứa một khung đọc mở (ORF), đƣợc dịch mã thành 1 polyprotein, sau... đề rất cần thiết E. coli Tuy nhiên,trở ngại khi và độ tan kém Vì vậy,để biểu hiện TEVp trong E. colilà hiệu suất biểu hiện giải quyết vấn đề nàycác nhà nghiên cứu đã đột biến của TEVp, biểu hiện ở nhiệt độ thấp hoặc dung hợp với các protein dung hợp khác Protein huỳnh quang xanh (Green fluorescent protein, GFP)đang đƣợc ứng dụng rộng rãi bởi một số nổi bật nhƣ dễ dàng phát hiện khi biểu hiện, tinh sạch... của virus (VPg 21 kDa) và TEV NIa protease TEV protease gồm 234 amino acid ứng với amino acid 189 - 424 của protease trƣởng thành [19] Hình 1.2: Cấu trúc không gian của TEV protease TEV protease là protease cystein có cấu trúc tƣơng tự nhƣ các serin protease nhƣ trypsin hay chymotrypsin nhƣng có chứa 1 cystein thiol thay vì serin hydroxyl Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ trong. .. vai trò trong vi c nhân bản hệ gene của virus [16, 19] Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Hình 1.1: Quá trình đồng biểu hiện và xử lý sau dịch mã của TEV 1.2.4 Cấu trúc của TEV protease TEV NIa protease (TEV protease) là vùng xúc tác 27kDa 1.2) của NIa protease trƣởng thành [39] NIa protease trƣởng thành có khối lƣợng 49 kDa và xảy ra quá trình tự phân cắt để tạo ra một protein liên... giảm hoạt tính trong vi c bảo quản các enzyme là một lo ngại đáng kể Vi c biểu hiện TEV protease trong E. coli gặp phải trở ngại nhƣ năng suất thấp và dạng hòa tan ít [9, 26] Trong thực tế, TEV protease tái tổ hợp thƣờng hòa tan ở nồng độ dƣới 1mg/ml và duy trì đặc tính ở 50% (v/v) glycerol [9] Để cắt cơ chất hiệu quả, vị trí nhận biết của TEV protease trên phân tử protein đích cần Gly hoặc Ser ở vị trí... Maltose binding protein (MBP), Histidin (His) Tuy nhiên, các đuôi dung hợp này có thể gây trở ngại cho vi c nghiên cứu về cấu trúc chức năng của protein đích Do đó, trong nhiều trƣờng hợp vi c loại bỏ đuôi dung hợp là cần thiết Các protease nhƣ enterokinase, thrombin, yếu tố Xa [9] cũng nhƣ rhinovirus 3C của ngƣời và TEVprotease đƣợc sử dụng để cắt đuôi dung hợp ra khỏi protein đích .Trong số các protease. .. Lys56Val/Ser135Gly độ hòa tan của rTEVp tăng lên trên 40 lần so với dạng dại [7, 9] - Năm 2009, ba nhà nhà khoa học gồm Tropea, Cherry và Waugh đã làm tăng khả năng hòa tan của rTEVp biểu hiện ở E. coli bằng cách dung hợp với MBP và thay thế Ser ở vị trí 219 thành Val [23] - Năm 2011, Miladi và cộng sự đã nghiên cứu dung hợp TEVp với Streptag II (Streptag II-TEVp) và biểu hiện protein dung hợp trong E. coli. .. Rnase E mất hoạt tính, làm thoái hóa mRNA, qua đó làm tăng tính bền vững cho mRNA Đồng thời, chủng thiếu hụt Lon protease (protease nội bào) và ompT protease (protease màng ngoài tế bào)nênhạn chế sự phân cắt của protease với protein ngoại lai, giúp cho protein ngoại lai ổn định hơn trong tế bào sau khi tổng hợp Thông thƣờng, protein ngoại lai đƣợc biểu hiện tốt trong chủng chủ nhƣng do trong hệ gene E . SINH VẬT Vũ Thị Hiền NÂNG CAO HIỆU SUẤT BIỂU HIỆN CỦA TEV PROTEASE TRONG VI KHUẨN E. coli BẰNG PROTEIN DUNG HỢP SUPER FOLDER GREEN FLUORESCENT PROTEIN (sfGFP) Chuyên ngành: Hóa sinh. transferase 20 His Histidin 21 TEV Tobacco Etch Virus 22 TEVp Tobacco Etch Virus protease 23 GFP Green Fluorecent Protein 24 sfGFP Super folder Green Fluorecent Protein 25 sfGFP-TEVp. sau: Enzymes. 3. Hydrolases. 3.4 Hoạt động ở liên kết peptide (peptidases). 3.4.22 Cysteine endopeptidases. 3.4.22.44 Endopeptidase thể vùi trong nhân (NIa) TEV protease. TEV protease đóng