Để có thể sử dụng protein tái tổ hợp phục vụ cho mục đích nghiên cứu tiếp theo, chúng tôi tiến hành tinh sạch protein tái tổ hợp này. Protein tái tổ hợp ở dạng hòa tan được tinh chế theo phương pháp native conditions sử dụng hệ thống tinh
sạ - inh
. Trong quá trình tinh chế, imidazole đƣợc sử dụng nhƣ chất cạnh tranh Ni2+ trong phức hợp Ni2+-histidine của protein tái tổ hợp.
Nhiều protein của chủng chủ có mang histidine nên cũng có ái lực với Ni2+ trên cột.
Tuy nhiên, lực liên kết giữa protein đó với Ni2+ yếu hơn nhiều so với protein tái tổ
hợp vì 6 histidine liền kề ổ hợp đã làm tăng
ái lực với Ni2+ lên nhiều lần. Các protein có ái lực yếu hơn sẽ bị rửa trôi khỏi cột bằng cách tăng dần nồng độ imidazole trong dung dịch rửa cột. Để loại bỏ hiệu quả các protein tạp của chủng vi khuẩn chủ, chúng tôi đã bổ sung imidazole với dải nồng độ từ 20 mM - 60 mM vào đệm rửa. Sau khi rửa cột để loại bỏ các protein tạp nhiễm bám không đặc hiệu, protein tái tổ hợp đƣợc đẩy ra khỏi cột bằng đệm đẩy có chứa 250 mM đến 500mM Imidazole. Các phân đoạn khác nhau sau khi đẩy ra khỏi cột đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel polyacrylamide 12,5%.
kDa 1 2 3 4 5 6 7 8
66 45
54,4kDa
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.10. Kết quả tinh sạch sfGFP-TEVp tái tổ hợp
ĐC 1: thang potein chuẩn; ĐC 2: dịch trước tinh chế; ĐC 3: dịch chảy qua cột; ĐC 4-8: các phân đoạn đẩy ra khỏi cột ở nồng độ 500mM Imidazole;
Kết quả điện di cho thấy sfGFP-TEVp có độ tinh sạch cao, có thể sử dụng cho các mục đích nghiên cứu tiếp theo. Tuy nhiên vẫn còn một lƣợng nhỏ protein tái tổ hợp không bám đƣợc lên cột (Hình 3.10, ĐC 3), có thể do tỷ lệ giữa hạt Resin và protein tái tổ hợp chƣa hợ
c
nồng độ 60 mM Imidazole trong đệm rửa là đủ để loại bỏ đƣợc hầu hết các protein
tạ - -
ẩ 250 mM ở các phân đoạn
thu đƣợc hầ , không xuất hiệ
. Khi tăng dần nồng độ Imidazole lên từ 350mM đến 450mM, quan sát thấy ở các phân đoạn xuất hiệ
. Kiểm tra bằng điệ - ất hiện băng
protein tái tổ hợ ). Tuy nhiên
khi quan sát hạt Resin trên cột tinh chế thấy màu xanh rất rõ chứng tỏ protein tái tổ hợp vẫn chƣa đƣợc đẩy hoàn toàn. Tiếp tục tăng nồng độ Imidazole trong đệm đẩy lên 500 mM, thu các phân đoạ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
. Kiểm tra bằng điệ
- -
. Các phân đoạn protein tinh sạch đƣợc thẩm tích trong đệm thẩm tích (50 mM Tris–HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA) ở 40C, sau đó định lƣợng bằng
phương pháp Braford 100ml dịch nuôi
cấy ợng 930 àg/ml, cao không dung hợp.
3.6. -TEVp
-
ổ hợp TRX-GP120 của virus HIV làm cơ chất để kiểm tra hoạt tính của sfGFP-TEVp. Theo thiết kế GP120 đƣợc biểu hiện dưới dạng dung hợp vớ
ị trí cắt của TEVp. GP120 đƣợc tinh chế
Kit tinh sạch protein của hãng Invitrogen, sau đó đƣợc thẩm tích loại muối và Imidazole. Phản ứng cắt thực hiện ở 170C ở một dải thời gian tương ứng là: 1, 4, 6,
12 và 24 giờ ể 12,5% trong điều
kiện biến tính.
Hình 3.11 thể hiện hoạt tính của sfGFP-TEVp ở các thờ t khác nhau.
Ta thấy ở đường chạy 3 đến 7 lượng cơ chất còn lại chưa bị cắt tỷ lệ nghịch theo thời gian xúc tác tăng (1, 4, 6, 12 và 24 giờ). Ở thời gian xúc tác 24 giờ hầu nhƣ
toàn bộ GP120-TRX bị cắ 120 (36 kDa).
Nồng độ có thể do enzyme bị
phân hủy.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
A B
Hình 3.11. Điện di đồ kết quả kiểm tra hoạt tính của sfGFP-TEVp
(A). ĐC 1: thang protein chuẩn; ĐC 2: GP120 tái tổ hợp; ĐC 3-7: GP120 tái tổ hợp được cắt bởi sfGFP-TEVp sau 1, 4, 6, 12 và 24 giờ. (B). ĐC 1: thang protein chuẩn; ĐC 2: GP120 tái tổ hợp; ĐC 3: GP120 tái tổ hợp được cắt của TEVp sau 24 giờ.
ỏ có độ hoà tan thấp.
sfGFP-TEVp có hoạt tính xúc tác tương đương TEVp. Sau 24 giờ ủ ở 170C, hầu hết GP120-TRX bị cắt bởi sfGFP-TEVp, trong khi đó TEVp cắt gần nhƣ hoàn toàn (hình 3.11).
Trong nghiên cứu này, chúng tôi cũng thử tiến hành tìm điều kiện bảo quản tốt nhất cho sfGFP-TEVp. Kết quả sơ bộ ban đầu cho thấy, khi bảo quản ở 40C trong khoảng một tuần, TEVp không bền vững, bị kết tủa và hoạ . Trong khi đó, sau mộ 40C sfGFP-TEVp không bị kết tủa và vẫn giữ đƣợc 60% hoạt tính. Điều này chứng tỏ sfGFP-TEVp có tính ổn định hơn so vớ
).
ở các điều kiện khác nhau.
, sfGFP không nhữ , tăng tính tan mà còn tăng độ bền, ổn định củ . Một số
ại không
sfGFP-TEVp
GP120-TRX
GP120 TRX
36 kDa
22 kDa 14 kDa
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
bền, dễ -
ứng dụ .
Bên cạnh đó đặc tính phát huỳnh quang của sfGFP cung cấp một phương
pháp đị ợp mộ , có
thể nhìn thấ ờ máy đo quang phổ
Histag giúp sfGFP dễ ột Ni-
NTA sau khi thực hiện phản ứng cắt. Trong tự nhiên, tiến hoá cho thấy đƣợc sức
mạnh của nó trong việc dung hợ ể tạo ra một
protein/enzyme mới với đặc tính nổi bật. Với thiết kế hợp lý, chúng ta có thể tận dụng lợi thế của những protein có sẵn để cải thiện đặc điểm của một số enzyme.
Nhƣ trong nghiên cứ , chúng tôi cho thấy đuôi sfGFP cải thiện đáng kể sự hoà tan, mức độ biểu hiện và sự ổn định của TEVp, điều này rất quan trọng trong việc sản suất lƣợng lớ ử dụng trong nghiên cứu.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận
Thiết kế thành công vector biểu hiện pET21a(+) mang gene mã hóa cho sfGFP-TEVpvà biểu hiện thành công protein dung hợpsfGFP- TEV protease trong vi khuẩn E. coli chủng BL21 (DE3) Star™.
Đã tối ƣu hóa đƣợc các điều kiện biểu hiện để nâng cao hiệu suất biểu hiện và thu hồi protein tái tổ hợp. rsfGFP-TEVp biểu hiện
ở 250C thời 12 giờ 1 mM chất cảm ứng IPTG.
Đã tinh sạch đƣợc protein sfGFP-TEV protease tái tổ hợp bằng cột sắc ký ái lực Probond Nickel-Chelating Resin độ sạch cao v nồng độ 930àg/ml.
sfGFP-TEVp sau tinh sạch vẫn giữ được hoạt tính sinh học tương đương TEVp.
2. Kiến nghị
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Tiếp tục nghiên cứu tối ƣu điều kiệnhoạt động của sfGFP-TEVp nhƣ đệm, tỷ lệ của enzyme/cơ chất trong phản ứng cắt. Đồng thời tiến hành kiểm
tra tính ổn định củasfGFP-TEVp .
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/