CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Hình 2.1: Sơ đồ minh họa các bước trong nghiên cứu biểu hiện và tinh sạch sfGFP-TEVp.
Kiểm tra hoạt tính của sfGFP-TEVp tái tổ hợp
Tinh sạch sfGFP-TEVp tái tổ hợp Biểu hiện lƣợng lớn sfGFP-TEVp tái tổ
hợp
Xác định trạng thái và tối ƣu hóa điều kiện biểu hiện của sfGFP-TEVp
Biểu hiện sfGFP-TEVp trong vi khuẩn E.coli chủng BL21 (DE3) star
ế vector biểu hiện pET21(a+) mang genesfGFP-TEVp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
2.2.1. Thiết kế vector biểu hiện mang gene mã hóa sfGFP-TEVp
Gene mã hoá cho sfGFP-TEVp được thiết kế bằng cách sử dụng phương pháp PCR overlap extension. Đầu tiên, hai đoạn gene sfGFP và TEVp đƣợc khuếch đại từ psfGFP và pTEVp bằng hai cặp mồi :
GFP-F_NdeI:5’-CTCACATATGGTGAGCAAGG-3’
GFP-R: 5’-CCATGCCGCCGCCCTTGTACAGCTC-3 TEVp-F: 5’-GGCGGCGGCATGGGAGAAAGCTTG-3’
TEVp-R_XhoI: 5’- TATGACTCGAGTAACACTCATGAGTTG-3’
Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch trộn đều vào nhau 1:1 5 àl cho phản ứng PCR
, : 940 -
940C-30 giây, 500C-50 giây, 720 - 30 giây.Tiếp theo, cặp mồi -
- - : 940 -
940C-30 giây, 550C-50 giây, 720 - 30 giây, 720 - để tạo ra sản phẩm là đoạn gene sfGFP-TEVp.
Sản phẩm PCR đƣợc xử lý bằng hai enzymeNdeI và XhoI, chèn vào vector pET21a(+) đã được xử lý bằng hai enzyme tương ứng tạo ra plasmide biểu hiện psfGFP-TEVp. Quá trình ghép nối đƣợc thực hiện nhờT4 DNA ligase và ủ ở 14ºC trong 16 giờ. Các dòng plasmid tái tổ hợp mang gene mã hoá sfGFP-TEVp đƣợc chọn lọc bằng cách cắt kiểm tra với NdeI và XhoItrước khi biến nạp vào
E.coli BL21DE3 .
2.2.2. Phương pháp cắt bằng enzyme giới hạn
Bảng 2.1: Thành phần phản ứng cắt gene sfGFP-TEVpvà vector pET21(a+) bằng enzyme giới hạn
Thành phần Thể tớch (àl)
Đệm cho enzyme hoạt động 1,0
sfGFP-TEVp 2,0
Nde I 0,2
Xho I 0,2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
H2O 6,6
Tổng thể tích 10
Hỗn hợp phản ứng đƣợc trộn đều, ủ ở 370C 4 giờ.
Bảng 2.2: Thành phần phản ứng gắn gene vào vector biểu hiện Thành phần Thể tớch (àl)
Nước khử ion vô trùng
Dung dịch đệm của T4 DNA ligase 1
Vector pET21a(+) 5
T4 DNA ligase 1
Gene sfGFP-TEVp 3
Tổng thể tích 10
thực hiện 140C/16 giờ.
2.2.3. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose
Nguyên tắc: Các đoạn DNA mang điện tích âm nên di chuyển trong điện trường từ cực âm sang cực dương. Trên bả
. Nhuộm DNA bằng ethidium bromid để quan sát DNA dưới đèn tử ngoại 254 nm.
: Agarose 1% (1g agarose pha trong 100 ml dung dịch đệ 50X (60,5 g Tris base; 14,3ml axit axetic; 25ml EDTA 0,5M, pH 8,0), 10mg/ml EtBr (ethidium bromide), đệ
ịnh mức bằng H2 1ml).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Tiến hành
- Đổ gel, lắp thiết bị
- Nhỏ các giọt mẫu vào các giếng theo đúng thứ tự. Mỗi giếng tối đa ~ 15 l - Đậy nắp đặt 100V, 40mA rồi cho chạy điện di đợi gel chạy đến 2/3 bản thì dừng lại
- Nhuộm gel: cho bản điện di ra khỏi máy rồi bỏ bản gel khỏi bản điện di vào dung dịch nhuộm, để ngập bản gel. Thời gian nhuộm từ 5-15 phút tùy từng bản gel
- Soi bản gel dưới tia cực tím
2.2.4. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến E.coli Nguyên tắc
Để biến nạp DNA plasmid vào tế bào vi khuẩn, tế bào đƣợc xử lý bằng CaCl2 để tăng khả năng tiếp nhận DNA ngoại lai. Tạo hỗn hợp vi khuẩn với DNA plasmid trong điều kiện lạnh sau đó đƣa hỗn hợp vào tình trạng nhiệt độ cao. Ngay lập tức đƣa hỗn hợp vào nhiệt độ lạnh. Sự thay đổi nhiệt độ đột ngột giúp DNA plasmid xâm nhập vào trong tế bào vi khuẩn. Vi khuẩn sau đó đƣợc tiếp tục nuôi cấy và nhân lên trong nhiệt độ và môi trường thích hợp, DNA plasmid cũng sao chép và phân chia theo sự phân chia của tế bào chủ. Hỗn hợp này đƣợc chuyển vào đĩa petri chứa môi trường có bổ sung kháng sinh chọn lọc.
ật chủ
:
E. coli đ ỷ lệ
1:100, lắc ở 370 (v/p), cho đế 600nm 0,6-1. Sau
khi ly tâm ở 5000v/p trong 5 phút, cặn tế bào đƣợc rửa lần 1 bằng 1ml CaCl2
100mM ở 40C. Tiếp tục ly tâm ở 5000 v/p trong 5 phút để thu tế bào, rửa tế bào lần 2 trong 500 l CaCl2 100mM.Tiếp tục ly tâm ở 5000 v/p trong 5 phút để thu tế bào, hòa cặn tế bào trong 50 l CaCl2 100mM,
.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
:
Để biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến, bổ sung1-2
100ml 420
250 370C
trong 100 l-150 100
μg/ml, X-Gal 40 àg/ml, IPTG rồi ủ 370C qua đờm.
2.2.5. Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩnE.coli
Các tế bào vi khuẩn E. colimang plasmid sau khi nuôi cấy đến pha dừng sẽ bị dung giải khi xử lý với dung dịch chứa SDS và NaOH. Trong đó, SDS sẽ làm biến tính protein, phá vỡ màng tế bào, NaOH (nằm trong dung dịch II) sẽ làm biến tính DNA của hệ gene và DNA plasmid. Sau đó, hỗn hợp đƣợc trung hoà pH bằng acetic acid (nằm trong dung dịch III). Khi dung dịch đã đƣợc trung hoà thì DNA plasmid vòng sẽ đƣợc hồi tính nhanh chóng, hòa tan vào trong dung dịch và đƣợc tủa lại bằng ethanol. Ngƣợc lại, DNA genome và các protein khác bị kết tủa bởi sự có mặt của potassium acetate (nằm trong dung dịch III) và sẽ đƣợc loại bỏ bằng ly tâm.
Quy trình
DNA plasmid sau khi biến nạp vào chủng E. coli DH5α, cấy chuyển 1 khuẩn lạc riêng rẽ vào ống nghiệm chứa 5 ml môi trường LB có bổ sung ampicillin (100μg/ml), nuôi lắc ở 200 vòng/phút qua đêm với nhiệt độ 37ºC. Hút 1ml dịch nuôi cấy vào ống eppendorf 1,5 ml, ly tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút và thu tế bào. Hũa tan tế bào thu đƣợc với 150 àl dung dịch I bằng vortex. Tiếp tục bổ sung 150 àl dung dịch II, đảo đều nhẹ nhàng để trỏnh đứt góy DNA. Bổ sung tiếp 150 àl dung dịch III, đảo đều nhẹ nhàng và nhanh. Tủa protein sẽ xuất hiện và có màu trắng đục. Bổ sung tiếp 450 àl chloroform/isoamylalcohol (24:1), đảo nhẹ để cỏc protein nhỏ hòa tan vào dịch có phenol. Sau đó, ly tâm với tốc độ12.000 vòng/phút trong 15 phút. Dùng pipet nhẹ nhàng hút dung dịch lớp trên và chuyển sang ống eppendorf mới loại 1,5 ml. Bổ sung 0,1 lần thể tích gồm NaOAC 3M, pH 5,2 (40 μl) và 2,5 lần thể tích ethanol 100% (1 ml), tủa DNA plasmid ở nhiệt độ -25ºC trong 2 giờ. Sau khi ly tâm thu tủa ở 13000 vòng/phút trong 20 phút, cặn tế bào đƣợc rử
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
70% và tiếp tục ly tâm 13.000 vòng/ phút, thu cặn. Cuối cùng cặn
đƣợc làm kh 30μl TE có bổ sung RNase (100μg/l), ủ ở
bể 37ºC trong 2 giờ để .
2.2.6. Phương pháp biểu hiện protein tái tổ hợp trong E. coli
Chủng tế bào vi khuẩn E.coli BL21 Star™ (DE3) mang plasmid tái tổ hợp được hoạt hóa trong môi trường LB lỏng có bổ sung Ampicillin (100 g/ml) ở 370C qua đêm.Dịch hoạt hoá được cấy chuyển với tỉ lệ 2% trong môi trường LB có bổ sung Ampicillin ở 370C. Khi OD đạt 0,6-1 (sau khoảng 2 – 3 giờ)tế bào đƣợc cảm ứng kích thích sinh tổng hợp protein tái tổ hợp bằng cách bổ sung IPTG với nồng độ thích hợp, nuôi ở nhiệt độ thích hợp trong khoảng thời gian thích hợp để tạo ra TEV protease ở trạng thái hòa tan nhiều nhất.Dịch tế bào sẽ đƣợc thu ở các thời điểm, nhiệt độ và nồng độ IPTG khác nhau để khảo sát điều kiện tối ƣu. Tế bào thu đƣợc sẽ tiến hành ly tâm ở 6000 v/p trong 5 phút và đƣợc hòa đều vào trong 40 l H20 khử ion vô trùng có bổ sung thêm 10 l đệm SDS 5X. Hỗn hợp đƣợc ủ ở 100oC trong 10 phút để phá vỡ tế bào và biến tính protein, sau đó ly tâm 4000 v/p trong thời gian 5 phút để loại xác tế bào và hút dịch nổi trên kiểm tra khả năng sinh protein ngoại lai bằng điện di SDS-PAGE.
Để tối ƣu mức độ biểu hiện protein tái tổ hợp, một số điều kiện nuôi cấy đƣợc thay đổi: nhiệt độ (20, 25, 30 và 37 C), nồng độ IPTG (0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 1,2;
1,5mM) và thời gian thu mẫu sau cảm ứng (5, 8, 12, 24 và 30 giờ).Sau một thời gian nuôi cấy trong môi trường cảm ứng, thu tế bào và kiểm tra sự biểu hiện của protein tái tổ hợp bằng cách điện di trên gel polyacrylamide.
2.2.7. Phương pháp xác định trạng thái tồn tại của TEVp
Sau khi được biến nạp vào tế bào E. coli, dưới sự cảm ứng của IPTG các tế bào vi khuẩn sẽ tăng cường quá trình tổng hợp protein ngoại lai, các protein này có thể có trạng thái tồn tại khác nhau tùy vào các điều kiện biểu hiện khác nhau nhƣ:
nhiệt độ biểu hiện, nồng độ chất cảm ứng, thời gian cảm ứng. Việc xác định trạng thái tồn tại của protein có ý nghĩa quan trọng trong việc lựa chọn phương pháp tinh chế protein phù hợp.
Qui trình :
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
1 ml tế bào ,
tế bào trong300àl dung dịch đệm phỏ tế bào Lysis Buffer (Tris-HCl pH 6,8;
500 mM NaCl) lắc đều đến khi tế bào thành dạng huyên phù đều. Sau đó siêu âm nhanh đến khi dịch tế bào trở nên trong, không nhớt. Ly tâm 10000 v/p trong 10 phỳt, thu dịch nổi. 300 àl dung dịch đệm phỏ tế bào Lysis Buffer. Kiểm tra sự có mặt của protein tái tổ hợp trong dịch pha nổi và cặn bằng điện di trên SDS-PAGE.
2.2.8. Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide Nguyên tắc:
Các phân tử protein đƣợc biến tính bởi sodium dodecyl sulphate sẽ mang điện tích âm nên di chuyển trong điện trường từ cực âm sang cực dương. Các protein có trọng lƣợng phân tử khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau trong điện trường. Các protein có trọng lượng phân tử nhỏ sẽ di chuyển nhanh hơn các phân tử protein có trọng lƣợng phân tử lớn hơn trong bản gel polyacrylamide.
Tiến hành:
SDS-PAGE được thực hiện theo phương pháp Laemmli UK với các thiết bị của hãng Bio-Rad. Để phân tách các protein có trọng lƣợng phân tử từ 12-68 kDa trên gel polyacrilamide 12,5% có thành phần nhƣ bảng 2.7
Bảng 2.4: Thành phần và các dung dịch đệm SDS-PAGE
Gel tách Gel cô
H20 1,23 ml H20 0,85 ml
Tris-HCl 3M pH= 8,8 0,625 ml Tris-HCl 1M pH= 6,8 156,25 àl
Acrylamide 2,1 ml Acrylamide 212,5 àl
Glycerol 50% 1 ml Glycerol 50%
SDS 10% 25 àl SDS 10% 6,25 àl
APS 10% 25 àl APS 10% 12,5 àl
Temed 4 àl Temed 1 àl
Protein sau khi đƣợc biến tính bằng đệm xử lý mẫu (sample buffer 6X) và ủ ở 100ºC trong 10 phút tra mẫu vào giếng
và chạy với cường độ dòng điện 40 mA trong thời gian
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
khoảng 40 phút. Khi protein đến cuối bản điện di, gỡ bản gel và nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue (CBB). Sau khi ủ với dung dịch nhuộm gồm (0,1%
(w/v) CBB, 30% (v/v) methanol, 10% (v/v) acetic acid) trong 30 phút, bản gel đƣợc tẩy rửa bằng (30% (v/v) methanol, 10% (v/v) acetic acid) cho đến khi có thể quan sát thấy băng điện di, phân tích kết quả(Laemmli, 1970).
2.2.9. Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng cột Probond Nickel- Chelating Resin Nguyên tắc:
Protein tái tổ hợp đƣợc thiết kế có gắn thêm 6 histidin (6- His) nên dễ dàng đƣợc tinh sạch bằng cột sắc ký ái lực ProBond Nickel-Chelating Resin (Invitrogen).
Phương pháp tinh sạch này dựa vào liên kết giữa ion Ni2+ với vòng imidazol của histidin. Khi có protein mang amino acid histidin đi qua, vòng imidazol của histidin sẽ liên kết với ion kim loại trên cột và giữ protiein lại trên cột. Các protein không có ái lực hoặc có ái lực yếu với ion kim loại trên cột sẽ bị rửa trôi trong quá trình tinh sạch.
Tiến hành:
Trước khi tiến hành tinh chế, chúng tôi xác định trạng thái của protein tái tổ hợp để có thể chọn phương pháp tinh chế phù hợp. Protein được biểu hiện lượng lớn và ở dạng hòa tan, do đó được tinh chế theo phương pháp Native Conditions của hệ thống tinh sạch Probond Nicken- Chelating Resin (Invitrogen), Protein sfGFP- TEVp được tinh sạch bằng hệ thống Probond Nickel- Chelating Resin theo hướng dẫn của Invitrogen
Tế bào đƣợc hoà lại trong buffer NPB1x (50 mM Tris–HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10% (v/v) glycerol, 20 mM imidazole). Siêu âm phá tế bào trên đá, ly tâm 3000v/10p loại xác, dịch nổi đƣa lên cột Ni- Chelating Resin (cột đã đƣợc cân bằng trong buffer NPB1x). Rửa cột với buffer NWB 40mM Imidazol. Đẩy với Buffer NEB (NPB1X, 500 mM Imidazole). Nồng độ của protein đƣợc xác định bởi phương pháp Bradford. Protein được thẩm tích trong đệm thẩm tích (50 mM Tris–
HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 10% (v/v glycerol) ở 40C và giữ ở -800C.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
2.4.10. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford
Hàm lượng protein trong các mẫu thí nghiệm được xác định theo phương pháp Bradford. Đồ thị chuẩn đƣợc dựng với albumin huyết thanh bò (BSA) với thang chuẩn từ 0 – 0,7 mg/ml. Chuẩn bị nhƣ sau:
Cân 100 mg BSA pha trong 10ml nước cất 2 lần. Kiểm tra OD280 đạt giá trị 0,66; sau đó dung dịch được pha loãng trong nước cất để đạt nồng độ 1mg BSA/ml.
Từ dung dịch BSA 1 mg/ml pha thành các nồng độ khác nhau để dựng đồ thị chuẩn.
Chuẩn bị dung dịch đo bằng cỏch bổ sung 900 àl Bardford Reagent 1X (0,1 mg/ml Comassie Blue G250; 5% Methanol; 8,5% H3PO4) vào 100àl cỏc dung dịch nồng độ BSA từ 0-0,7mg/ml. Lắc 1 phút, ủ mẫu ở nhiệt độ phòng trong 30 phút sau đó đo OD ở bước sóng 595 nm.
Dựng đồ thị chuẩn: Trục tung là giá trị OD595, trục hoành biểu thị nồng độ protein.
Từ đồ thị chuẩn và giá trị OD của mẫu cần xác định suy ra nồng độ protein trong mẫu
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 OD595
Nồng độ protein (mg/ml) 0,7
0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
2.2.11. Phương pháp thử hoạt tính của sfGFP-TEV protease
Để kiểm tra hoạt tính của sfGFP-TEV protease tái tổ hợp, chúng tôi sử dụng cơ chất là protein GP120 của virus HIV. Protein GP120 đƣợc biểu hiện trong vi khuẩn E.coli BL21 dưới dạng dung hợp với protein TRX và đuôi His-tag (hình 2.2).
Giữa TRX và GP120 của protein dung hợp này là vị trí cắt của TEVp. Hoạt tính của sfGFP-TEVp đƣợc kiểm tra bằng khả năng loại bỏ protein TRX khỏi protein dung hợp TRX- GP120 nhằm thu đƣợc protein GP120 tinh khiết. Quá trình này đƣợc mô tả ở hìn .
Hình 2.2: Sơ đồ minh họa quá trình loại bỏ đuôi TRX khỏi protein dung hợp GP120- TRX nhờ sfGFP-TEV protease
Bảng 2.5: Thành phần phản ứng cắt GP120 tái tổ hợp bằng sfGFP-TEVp
Thành phần Thể tớch (àl)
GP120 tỏi tổ hợp(100 àg) 890 Buffer (50 mM Tris-HCl pH
8.0, 0.5 mM EDTA) 100
DTT 1mM 7,5
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
sfGFP-TEV protease(2àg) 2,5
Tổng thể tích 1000
Phảnứng cắt đƣợc thực hiện ở 170C. Kiểm tra kết quả phản ứng cắt bằng cách điện di trên gel polyacrylamide 12,5%.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/