GFPlà một protein, đƣợc đặt tên bởi MorinvàHastings[40], chứa 238 amino acid có khối lƣợng phân tử 26,9 kDa và có khả năng phát ra huỳnh quang màu xanh lá khi đƣợc chiếu tia sáng màu xanh da trời[40]. GFP đƣợc phân lập chủ yếu từ sứa Aequorea Victoria hoặc Renilla reniformis.Trong A. victoria có hai loại protein phát quang là Aequorin và GFP. Aequorin khi tương tác với ion Ca2+ sẽ phát ra ánh sáng xanh da trời, còn GFP đƣợc kích thích bởi ánh sáng da trời sẽ phát ra huỳnh quang màu xanh lá.
GFP có cấu trúc dạng ống beta điển hình, bao gồm 11 mạch β đƣợc liên kết với nhau bởi xoắn α và chứa nhóm mang màu (fluorofore) ở trung tâm của ống[38, 40, 41].Ống trụ có đường kính khoảng 30 A0 và chiều dài 40 A0. Khi phân cắt GFP
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
thành những đoạn hexapeptide (đoạn có 6 gốc amino acid), bộ ba amino acid65- 67(Ser-Tyr-Gly) trongtrình tựGFP tự nhiêntạo thànhnhóm mang màuhuỳnh quangp- hydroxybenzylideneimidazolinone. Đây là cấu trúc thường gặp trong tự nhiên, tuy nhiên chỉ khi bộ ba amino acid nằm ở trung tâm của cấu trúc ống beta (nhƣ trong cấu trúc của GFP), bộ ba này mới dẫn đến khả năng phát huỳnh quang.Cấu trúc dạng ống beta này khó bị biến tính bởi nhiệt độ, pH hay các chất gây biến tính.GFP bền ở nhiệt độ 780C, pH 5- 12 hay trong đệm có nồng độ ure đậm đặc 6M[27].
Hình 1.3 :Cấu trúc không gian của GFP
Quá trình thành thục của GFP diễn ra như sau: trong môi trường thuỷ phân, xảy ra phản ứng giữa gốc carboxyl của Ser65 và gốc amino của Gly67, dẫn đến sự hình thành hệ thống vòng imidazol-5-one heterocyclic nitrogen. Quá trình oxi hoá tiếp sau đó tạo liên kết giữa vòng Imidazol với Tyr66 và do đó tạo thành protein có hoạt tính.
GFP t nhiên từ A. victoria tồn tại ở hai trạng thái : dạng proton hoá (dạng trội) và dạng không proton hoá (hiếm gặp hơn), tương ứng có hai đỉnh kích thích:đỉnh chính ở bước sóng 395nm và đỉnh phụ có bước sóng 475nm. Dưới ánh sáng kích thích, GFP phát ra ánh sáng có bước sóng 509nm, tương ứng với ánh sáng màu xanh lá trong phổ ánh sáng nhìn thấy, ngay cả khi kích thích dưới ánh sáng UV, GFP vẫn có khả năng phát huỳnh quang.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 1.4.Đỉnh kích thích huỳnh quang (nét liền) và đỉnh huỳnh quang phát ra (nét đứt) của GFP tự nhiên từ A. victoria.
1.3.2. Super folder GFP và các biến thể khác của GFP
GFP tự nhiên có một vài nhƣợc điểm nhƣ phổ kích thích lƣỡng cực, kém bền với ánh sáng và cuộn gấp kém ở 370C. Tuy nhiên, với tiềm năng ứng dụng to lớn, nhiều biến GFP đã đƣợc tạo ra nhằm mục đích cải thiện tính hòa tan, độ bền và gấp cuộn của protein bằng cách dung hợp với các protein khác.
Biến thể của GFP đƣợc nghiên cứu đầu tiên vào năm 1996 bởi Willem Stemmer bằng kỹ thuật DNA shuffting [42] với mục tiêu cải thiện toàn bộ tế bào huỳnh quang trong E.colikhi biểu hiện GFP. Sau 3 chu kỳ DNA shuffting và lựa chọn dựa trên cường độ huỳnh quang với sự kích thích của tia cực tímcho thấy huỳnh quang tăng gấp 45 lần so với clontech pGFP thương mại. Tuy nhiên, đặc tính quang phổ cũng nhƣ tỷ lệ thành thục không thay đổi(T1/2 = 95 phút ở 37oC trong toàn bộ tế bào). Đột biến GFP cycle 3 so với GFP ban đầu là 3 amino acid kỵ nước được thay thế bằng3 amino acid ưa nước. Vì vậy, cường độ huỳnh quang được cải thiện có thể do giảm tập hợp protein có bề mặt kỵ nước và làm tăng độ hòa tan của GFP.
Mười năm sau đó (2006), các superfolder GFP(sfGFP) được thiết kế bởi phòng thí nghiệm của Geoffrey Waldo với mục đích tạo ra một protein có ít xu hướng gấp cuộn sai khi dung hợp với một protein gấp cuộn kém trong E.coli. Sử dụng một GFP folding reporter (frGFP) chứa đột biến cycle 3 và EGFP dung hợp với một protein gấp cuộn kém-H subunit ferritin, protein này không hòa tan khi biểu hiện trong E.coli. Sau nhiều lần đột biến và sàng lọc huỳnh quang thu đƣợc sfGFP với cường độ huỳnh quang mạnh chứa 6 đột biến mới. Ferritin-sfGFP được tìm thấy có cường độ huỳnh quang gấp 50 lần so với protein dung hợp ban đầu. Khi biểu hiện riêng rẽ, tế bào biểu hiện sfGFP có cường độ sáng gấp hai lần so với frGFP, đặc biệt là phổ kích thích và phát xạ, QY và EC tương tự nhau ở cả hai protein.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Tỷ lệ gấp cuộn đƣợc đo bởi việc biến tính protein bằng Urea. Sau đó rửa Urea và đo thời gian nó mang biến thể GFP và thu huỳnh quang. Trong vài trường hợp, mặc dù hai protein thu đƣợc hiệu suất 95% trong vòng 4 phút, sfGFP nhanh hơn 3,5 lần so với tỷ lệ ban đầu. sfGFP cũng đƣợc xử lý với urea ở nồng độ cao, và thu được cường độ huỳnh quang cao hơn so với một loạt các protein dung hợp khác nhau với các đặc điểm khác nhau (mức độ biểu hiện, khả năng hòa tan…).
Năm 2007, nhóm của David Liu sử dụng sfGFP trong một nỗ lực để tạo ra một protein GFP mới có độ hòa tan cao.Họ đã thay thế nhiều amino acid trung tính ở phía ngoài của protein với các amino acid kiềm hoặc axit để tạo ra một biến thể (scGFP) GFP(+36) và GFP (-30).scGFP này có độ hòa tan cao, có khả năng chống lại sự biến tính ngay cả khi đun sôi protein ở 100oC. Các đặc tính quang phổ của scGFP tương tự như GFP và sfGFP.
Năm 2008, Fisher & DeLisa tạo ra một biến thể của GFP là superfast GFP.
Nhờ việc nghiên cứu cơ chế kiểm soát bài tiết protein của tế bào, họ đã sàng lọc và tạo ra biến thể gấp cuộn mới. Trong chu chất, GFP dường như không phát huỳnh quang. Nếu protein gấp cuộn đủ nhanh, cơ chế kiểm soát chất lƣợng ngăn cản sự tiết của nó dẫn đến protein còn nằm trong tế bào chất. Đột biến GFP ban đầu của họ là GFPmut2, một biến thể mà trước đây đã được tối ưu hóa để phân tích FACS, chứa các đột biến S65A/V68L/S72A nên sau nhiều vòng lựa chọn, họ thu đƣợc một dòng đặt tên là superfastGFP. Đột biến điểm S65T, trong đó Ser65 đƣợc thay thế bằng Threonine, Alanine, Cysteine hay Leucine, cải thiện đáng kể đặc điểm quang phổ của GFP(18). Đột biến này làm mất đi đỉnh hấp phụ ở 395nm, thay vào đó đỉnh 475 nm trở thành đỉnh hấp phụ chính.Đột biến này rất đƣợc quan tâm do protein mới có phổ hấp phụ phù hợp với đặc điểm quang phổ của hệ thống lọc FITC (Fluorescein isothiocyanate), làm tăng tính ứng dụng của protein này trong nghiên cứu. Đột biến này khi đƣợc kết hợp với các đột biến ở các vị trí gần nhân fluorophore khác nhƣ V68L hay S72A sẽ làm tăng tính bền của phổ huỳnh quang.
GFP đƣợc sử dụng chủ yếu trong phòng thí nghiệm là EGFP, GFP cải tiến.
EGFP do đột biến điểm F64L ở GFP, làm tăng khả năng cuộn gấp của protein ở 370C, tăng khả năng hấp phụ ánh sáng kích thích và phát huỳnh quang, đồng thời