tách chiết và chuyển hoá chlorophyll a từ vi khuẩn

MỤC LỤC 1.5.2 Quá trình t ng h p pyrol (porphobinogen)ổ ợ 25 1.5.3 Quá trình óng vòng c a 4 vòng pyrol (tetrapyrol)đ ủ 27 1.5.4 a ion Mg2+ v o h th ng vòngĐư à ệ ố 28 CÁC KÍ HIỆU VIẾT TẮT TRONG BÀI LUẬN VĂN PS : Hệ thống quang hợp IR : Phổ hồng ngoại UV – VIS : Phổ tử ngoại và khả kiến MS : Phổ khối lượng 1 H – NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H. MPP : Metylpheophobide a PP : Pheophytin a ATP : Adenosin Triphotphat NADP : Nicotinamit Adenin Dinucleotitphotphat LHC : Ánh sáng thu hoạch phức hợp DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ BẢNG Bảng 1.1: Thành phần của các chlorophyll khác nhau Error: Reference source not found Bảng 3.1: Bảng dữ liệu phổ 1 H – NMR của Pheophytin a. Error: Reference source not found Bảng 3.2: Bảng dữ liệu phổ 1 H – NMR của metylpheophobide a Error: Reference source not found Bảng 3.3: Bảng dữ liệu phổ 1 H – NMR của chlorin e 6 - trimethylester Error: Reference source not found HÌNH 1.5.2 Quá trình t ng h p pyrol (porphobinogen)ổ ợ 25 1.5.3 Quá trình óng vòng c a 4 vòng pyrol (tetrapyrol)đ ủ 27 1.5.4 a ion Mg2+ v o h th ng vòngĐư à ệ ố 28 MỞ ĐẦU Đã hơn thế kỷ nay, các nhà khoa học rất quan tâm tới việc chiết tách các sắc tố từ lá xanh của thực vật bậc cao. Cách đây hơn 100 năm các nhà hóa học đã tách được chất màu xanh từ lá và gọi chúng là Chlorophyll. Vào năm 1913, Richard Willstatter, nhà hóa học ngườI Đức đã chỉ ra rằng tất cả các năng lượng sống đều nhờ mặt trời. Cây xanh có một cách nào đó để giữ năng lượng mặt trời. Tới năm 1919, ông đã giải thích được chức năng của chất giữ năng lượng mặt trời chính là chất được gọi là Chlorophyll. Thực vật bậc cao có lá xanh đã tự mình hấp thụ được năng lượng tia bức xạ và chuyển hóa thành năng lượng dự trữ trong cơ thể. Chlorophyll giữ vai trò vô cùng quan trọng trong quá trình quang hợp, là chất đầu tiên nhận năng lượng ánh sáng cho hệ quang hợp. Chlorophyll hấp thụ ánh sáng chuyển về dạng năng lượng ATP, trong quá trình này xảy ra các phản ứng chuyển dịch electron (phản ứng oxy hóa khử) tạo thành các sản phẩm oxy hóa và khử. Chlorophyll có những ứng dụng khác nhau trong y học, công nghiệp. Trong y học, chlorophyll được chú ý nhiều như một thành phần cơ bản cho khẩu phần ăn kiêng chữa bệnh và như là chất chữa bệnh. Thí dụ chlorophyllin dẫn xuất kim loại của chlorophyll, có tiềm năng phòng chống các chất gây ung thư từ thức ăn bị thiu mốc như hydrocarbon mạch vòng, aflatoxin. Chlorophyll và các dẫn xuất còn được sử dụng như là chất cảm thụ ánh sáng để diệt các tế bào ung thư và chống virus, chất kháng bổ thể, chất chữa vết thương và khử mùi hôi. Chlorophyll ức chế phát triển của vi khuẩn, kích thích việc phục hồi các mô đã bị hư hại và bảo vệ con người khỏi các chất gây ung thư. Chlorophyll còn giúp cho tiêu hóa tốt và làm cho da thêm đẹp… 1 Đã có những công trình nghiên cứu khả năng chữa bệnh của các hợp chất với chlorophyll để chữa, tiêu diệt tế bào ung thư tủy, virus leukemia, u ác tính (malignant melanoma). Chlorophyll còn có tác dụng giảm viêm khớp (arthritis), xử lý các u xơ, giảm mùi hôi, giảm đường máu của người bệnh già. Chlorophyll có nhiều loại, chlorophyll (a, b, c, d, …), trong đó chlorophyll a rất phổ biến trong tự nhiên, đó là chất diệp lục trong hệ quang hợp của thực vật bậc cao, tảo biển, và vi khuẩn quang hợp. Tuy nhiên trong thực vật bậc cao hệ thống quang hợp có cấu tạo rất phức tạp và bao gồm nhiều loại chlorophyll khác nhau. Quá trình tách các chlorophyll ra khỏi nhau rất khó khăn và phức tạp. Trong các loại vi khuẩn quang hợp thì vi khuẩn lam có cấu tạo hệ quang hợp đơn giản nên việc phân lập dễ dàng hơn.Vì vậy tôi đã lựa chọn “ Tách chiết và chuyển hoá chlorophyll a từ vi khuẩn cyanobacteria” làm đề tài cho luận văn tốt nghiệp cao học của mình. 2 CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN 1.1 Cấu tạo và tính chất của hệ quang hợp 1.1.1 Cấu tạo và tính chất của hệ quang hợp ở thực vật và vi khuẩn Quang hợp là cơ sở năng lượng của sự sống trên trái đất. Do ánh sáng điện tử chuyển từ sắc tố diệp lục trong các trung tâm phản ứng quang hợp của vi khuẩn và thực vật, cuối cùng hình thức NADPH và ATP được sử dụng để sản xuất carbohydrate (Hình 1.1). Hình 1.1: Việc sử dụng năng lượng bức xạ cho sự tổng hợp của các phân tử hữu cơ Các chất diệp lục có thể được coi là chất quang dẫn nằm trong vùng ánh sáng hấp thụ và trung tâm phản ứng của bộ máy quang hợp. Các chất diệp lục hấp thụ và chuyển đổi quang năng thành hoá năng với hiệu suất cao. 3 Các hệ thống quang hợp (PS) (hình 1.2) phân loại theo cấu trúc của trung tâm phản ứng, bao gồm PSI của vi khuẩn lam, PSII của thực vật bậc cao và PS của vi khuẩn tía, bao gồm bốn thành phần chính là ăng-ten, các trung tâm phản ứng, khu chuyển điện tử và bộ máy cố định carbon. [5,3] Hình 1.2: Các hệ thống quang hợp. [28] Ở trung tâm phản ứng của vi khuẩn tía, tiểu đơn vị protein L và M, gắn các sắc tố hoạt động trong sự phân chia điện tích, là bộ phận có liên quan với nhau bởi đối xứng bậc hai. Trung tâm phản ứng được bao quanh bởi một vòng ánh sáng của các protein thu hoạch (LH1). Các electron được chuyển vào trung tâm phản ứng của một heme-binding cytochrome (cyt). Trong PSII , những protein D1 và D2 có cấu trúc và chức năng tương đồng với các tiểu đơn vị L và M của trung tâm phản ứng ở vi khuẩn và tổ chức các sắc tố hoạt động trong một hình dạng tương tự. Năng lượng ánh 4 sáng được thu thập bởi LHCII và chuyển vào trung tâm phản ứng bởi nhân protein chất diệp lục thu thập các lượng tử ánh sáng, CP43 và CP47, được đặt ở bên cạnh của heterodimer D1-D2 (protein cấu thành từ các polypeptit vốn khác nhau ở các dãy axit amin). Việc phân tách điện tích cho phép các nhóm mangan trên bề mặt lumen ôxi hóa nước và giải phóng oxi vào khí quyển. Trong PS I, các protein PsaA và PsaB tạo thành một heterodimer giống PSII. Mỗi PsaA và PsaB bao gồm một trung tâm phản ứng tương đương với D1 hoặc D2, và một nhân ăng - ten tương đương với CP43 hoặc CP47. Điện tử được lấy từ liên kết thuận nghịch plastocyanin (PC) ở bên trên lumen, và giao cho các cụm sắt sunfua (FeS) ở phía trên stroma , nơi chúng được sử dụng để giảm NADP + tới NADPH [28] . Hệ thống ăng-ten quang (Hình 1.3 và Hình 1.4) được tổ chức để thu thập và cung cấp năng lượng cho một trạng thái kích thích bằng cách kích thích chuyển tới các khu trung tâm phản ứng nơi phản ứng quang hoá diễn ra. Loại đầu tiên của ăng-ten bao gồm một heterodimer của các chuỗi axit amin và hai phân tử chất diệp lục a, b trong khi loại thứ hai của ăng-ten bao gồm một heterodimer của chuỗi axit amin dài cùng với ba phân tử chất diệp lục a, b . Đại đa số các sắc tố như carotenoid (Hình 1.5) trong một sinh vật quang hợp không hoạt động hoá học, nhưng chức năng chủ yếu như một ăng-ten 5 Hình 1.3 : Hệ thống ăng ten của các vi khuẩn tía -một chất màu protein vòng phức hợp. [29] Hệ thống ăng-ten tăng phần hiệu quả của sự hấp thụ qua photon bằng cách tăng số lượng sắc tố nằm ở mỗi phức hợp quang hóa. Cường độ của ánh sáng mặt trời là khá thấp và một phân tử diệp lục duy nhất chỉ hấp thụ một vài photon trong một giây. Bằng cách kết hợp nhiều chất màu vào một đơn vị duy nhất, phản ứng sinh tổng hợp trung tâm và chuỗi vận chuyển điện tử có thể được sử dụng với hiệu quả tối đa. Sự đa dạng nổi bật của ăng-ten phức hợp đã được xác định từ các lớp khác nhau của các sinh vật quang hợp. Kích thích chuyển giao phải được nhanh chóng, đủ để cung cấp kích thích trung tâm phản ứng quang hóa trong một thời gian tương đối ngắn so với các thời gian trạng thái kích thích trong trường hợp không có sự thu thập. Thời gian sống của phức hợp ăng-ten, nơi trung tâm phản ứng được loại bỏ, thường trong khoảng 1-5 ns. Quan sát thời gian trạng thái kích thích của các hệ thống ăng-ten, nơi được kết nối với trung tâm phản ứng này thường trên vài chục pico giây, đó là đủ nhanh để có điều kiện sinh lý hầu như tất cả năng lượng 6 ánh sáng bị giữ lại là tiếp tục sử dụng trong các phản ứng quang hóa. [1,4,7,12,15,26,27,29] Hình 1. 4: Ánh sáng hấp thụ phức hợp II ăng-ten protein của thực vật -một trimer với 14 chất diệp lục và 3 carotenoid cho một tiểu đơn vị protein [15] OH OH O O OH OH OH OH Zeaxanthin Violaxanthin Lutein ß-Carotene Hình 1.5: Carotenoids của trung tâm phản ứng. 7 [...]... c a các hợp chất được đo trên máy UV-2450 c a Nhật với dung môi THF ( trihyđrofuran), tại khoa Hoá học trường đại học khoa học tự nhiên - Đại học quốc gia Hà Nội 32 2.3 Nội dung nghiên cứu 2.3.1 Nội dung 1 Nghiên cứu quá trình chiết tách liên tục chlorophyll a từ vi khuẩn lam và thực hiện phản ứng chuyển h a chlorophyll a thành pheophytin a và metylpheophobide a 2.3.1.1 Tách chiết và chuyển hoá chlorophyll. .. Succinyl-CoA CH CoA-SH Pyridoxal-P 2 Enzyme CH2 H COOH ALA O CH2 CH2 O CH2NH2 NH-Pyridoxal-P COOH CH2 COOH Enzyme CH2 O NH-Pyridoxal-P H CO2 H Hình 1.14: Sinh tổng hợp 5-aminolevulinic axit từ glycine và succinyl-CoA  Sinh tổng hợp 5-aminolevulinic axit từ axit glutamic Sử dụng glutamic axit được gọi là lối đi C5 Cách này là đặc trưng c a thực vật bậc cao, rêu, vi khuẩn lam, và nhiều vi khuẩn khác... chlorophyll a thành Pheophytin a (PP) Hình 2.1: Chuyển hoá chlorophyll a thành pheophytin a 2.3.1.1.1 Xây dựng qui trình chiết tách chlorophyll a từ vi khuẩn lam bằng phương pháp liên tục sử dụng dung môi axeton Cho 100g vi khuẩn lam vào bình cầu 1lit, sau đó thêm vào hỗn hợp 400ml axeton rồi đem đun hồi lưu 2h trong bóng tối Hỗn hợp sau phản ứng được lọc lấy dịch bằng giấy lọc băng xanh, r a bằng axeton... axit glutamic thành 5aminolevulinic, thì glutamic phải được hoạt h a tại α-cacboxyl bằng cách gắn với ARNtGlu Trong Hình 1.15, axit glutamic được hoạt h a bằng cách gắn với ARNtGlu tạo thành glutamyl-ARNt với sự có mặt c a ATP và Mg 2+ Sau đó, glutamyl-ARN t bị đehiđro dưới tác dụng c a NADP tạo thành glutamat-1-semianđehit Và cuối cùng là quá trình đeamin tạo thành 5aminolevulinic axit Hình 1.15: Quá... phân lập vào năm 1913 và cấu trúc hoàn chỉnh đã được xác định vào năm 1940 bởi Hans Fischer Sự phân lập chlorophyll a từ các nguồn tự nhiên rất khó khăn do các phản ứng phân hủy như: đề kim loại h a, đề phytyl h a, oxi h a quang h a, solvat h a, allomerization và đề metoxycarbonyl h a Chlorophyll a đóng vai trò rất quan trọng trong hệ thống quang hợp do khả năng hấp thụ ánh sáng và biến đổi quang năng... chi điển hình: Nostoc, Anabaena, Aphanizomenon, Tác giả khác lại chia thành 2 bộ: Chroococcales với những dạng đơn bàn hay tập đoàn, và Hormogonales với những dạng a bào 19 1.2.4 Ý ngh a thực tiễn Trong thực tiễn, vi khuẩn lam có vai trò tích cực và tiêu cực Trong nông nghiệp, vai trò quan trọng c a vi khuẩn lam là làm tăng độ phì cho đất nhờ khả năng cố định đạm Hiện nay người ta đã tìm thấy khoảng... 50 loài, phần lớn thuộc họ vi khuẩn chuỗi (Nostocaceae) có khả năng này Ðặc biệt đáng chú ý là loài Anabaena azollae cộng sinh trong bèo hoa dâu, một loại cây dùng làm phân xanh và làm thức ăn gia súc có ý ngh a kinh tế rất lớn ở nước ta Theo nhiều nghiên cứu cho thấy, nhờ sự phát triển c a vi khuẩn lam trong ruộng l a mà hằng năm mỗi hécta đất trồng l a có thể lấy được thêm từ không khí khoảng 15 -... 80 kg hay nhiều hơn n a Những năm gần đây, một số vi khuẩn lam có hàm lượng protein cao như Spirulina maxima, S platensis được nuôi trồng với quy mô công nghiệp để thu sinh khối nhằm bổ sung nguồn protein cần thiết cho chăn nuôi và cho con người Vi khuẩn lam tích lũy ở đáy thủy vực, tham gia vào vi c hình thành bùn sapropen được dùng làm phân bón, thức ăn gia súc giàu vitamin, chế biến làm than cốc,... xảy ra quá nhanh chóng ngăn các tế bào sử dụng năng lượng ánh sáng Hình 1.7: Chuỗi eletron vận chuyển c a màng thylakoid Carbohydrates được sản xuất từ khí cacbonic và nước trong pha tối c a máy cố định cacbon bằng cách sử dụng xúc tác enzyme và năng lượng từ ATP hoặc NADPH theo chu trình Calvin-Benson C6 (Hình 1.8) hoặc chu trình C4 (Hình 1.9) 10 Hình 1.8: Cố định Carbon C6 theo chu trình Calvin-Benson... bước xây dựng từ các khối pyrrole khác nhau Các con đường tổng hợp bao gồm sự l a chọn duy nhất lắp ráp từ hai n a c a bicyclic pyrrole AD 14 và BC 15 để hình thành porphyrin 17 Nó được chuyển đổi sang chlorin 28 bởi khử chọn lọc c a một chuỗi axit prôpionic trung gian cho một sản phẩm trung gian là chất dẫn suất acrylic methylester 17 Porphyrin 17 được chuyển đổi sang purpurin 18 và sau đó là isopurpurin-5-methyl . quang hợp thì vi khuẩn lam có cấu tạo hệ quang hợp đơn giản nên vi c phân lập dễ dàng hơn.Vì vậy tôi đã l a chọn “ Tách chiết và chuyển hoá chlorophyll a từ vi khuẩn cyanobacteria” làm đề tài. quang hoá diễn ra. Loại đầu tiên c a ăng-ten bao gồm một heterodimer c a các chuỗi axit amin và hai phân tử chất diệp lục a, b trong khi loại thứ hai c a ăng-ten bao gồm một heterodimer c a. nghiệp cao học c a mình. 2 CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN 1.1 Cấu tạo và tính chất c a hệ quang hợp 1.1.1 Cấu tạo và tính chất c a hệ quang hợp ở thực vật và vi khuẩn Quang hợp là cơ sở năng lượng c a sự