Đánh giá hiệu quả tách chiết ADN của vi khuẩn trực tiếp từ phân

Nếu có thể sử dụng kỹ thuật PCR với ADN tách chiết trực tiếp từ phân sẽ giúp cho qui trình xác định căn nguyên vi khuẩn gây tiêu chảy chỉ còn vài giờ.. ở Việt Nam, một số công trình ngh

đến sự tăng trưởng của trẻ ước tính mỗi năm có khoảng 4 -10 triệu trường hợp

tử vong do tiêu chảy, trong đó phần lớn là trẻ dưới 5 tuổi Số trẻ em bị bệnh tiêu chảy chiếm khoảng 22% tổng số trẻ em nằm viện [2] Từ khi thành lập Chương trình Quốc gia Phòng chống Bệnh tiêu chảy năm 1982, số lượt tiêu chảy hàng năm trên mỗi trẻ đã giảm xuống, từ 2,2 lượt năm 1985 xuống còn 1,8 lượt năm

1990, và 1,3 lượt năm 2003 Tỷ lệ tử vong do tiêu chảy cũng giảm 2,4% ; 1,4%

ít nhất 24-30 giờ để phát hiện đ−ợc sự có mặt của vi khuẩn gây tiêu chảy trong phân [33]

Trên lâm sàng, việc xác định nhanh các căn nguyên vi khuẩn có ý nghĩa rất

quan trọng trong chẩn đoán và lựa chọn chế độ điều trị thích hợp cho bệnh

nhân Nếu có thể sử dụng kỹ thuật PCR với ADN tách chiết trực tiếp từ phân sẽ

giúp cho qui trình xác định căn nguyên vi khuẩn gây tiêu chảy chỉ còn vài giờ

Điều này sẽ góp phần quan trọng trong quá trình chẩn đoán và điều trị Chính vì

vậy, chúng tôi tiến hành đề tài "Đánh giá hiệu quả tách chiết ADN của vi

khuẩn trực tiếp từ phân" với 2 mục tiêu sau:

1 Phát triển qui trình tách chiết ADN của E coli gây tiêu chảy trực tiếp từ phân

2 Đánh giá hiệu quả tách chiết ADN trực tiếp từ phân

CHƯƠNG I Tổng quan 1.1 Tình hình bệnh tiêu chảy

1.1.1 Trên thế giới

Tiêu chảy có tỷ lệ mắc và tử vong đứng hàng thứ hai sau nhiễm khuẩn

đường hô hấp cấp tính ở trẻ em Theo Tổ chức Y tế Thế giới, hằng năm, trên thế giới có khoảng 1 tỷ lượt người bị tiêu chảy và 4 -10 triệu trường hợp tử vong, phần lớn ở trẻ dưới 5 tuổi [2]

1.1.2 ở Việt Nam

Tiêu chảy là nguyên nhân quan trọng gây suy dinh dưỡng và ảnh hưởng

đến sự tăng trưởng của trẻ Theo các nghiên cứu gần đây, bệnh tiêu chảy ở nước

ta đứng vị trí hàng đầu trong 10 bệnh phổ biến nhất, và là nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ hai ở trẻ em do mắc các bệnh nhiễm khuẩn (chỉ sau nhiễm khuẩn đường hô hấp) Số trẻ em bị bệnh tiêu chảy chiếm khoảng 22% tổng số trẻ em nằm viện [6, 8, 9]

1.2 Các căn nguyên vi sinh vật gây tiêu chảy

Các căn nguyên vi sinh vật gây tiêu chảy thường gặp là vi rút, vi khuẩn và

ký sinh trùng Một số nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ phân lập được căn nguyên vi sinh vật gây tiêu chảy vào khoảng 70% các trường hợp tiêu chảy [5, 15] Trong

số các tác nhân vi khuẩn gây tiêu chảy, E coli đã được quan tâm từ rất lâu Tỷ

lệ phân lập được các DEC từ bệnh phẩm phân trong một số nghiên cứu từ 22%

đến 30%, có nơi tới 60,3% Tỷ lệ này cao hơn so với các căn nguyên khác như

Shigella spp., 4,7-6,1%; Salmonella spp., 0,9-6%; Campylobacter spp., 7%; Bacteroides fragilis sinh độc tố ruột 7,3% Điều này cho thấy vai trò quan trọng

của DEC trong bệnh tiêu chảy [2]

Theo một số tác giả nước ngoài, DEC đóng vai trò rất quan trọng trong

bệnh tiêu chảy ở trẻ dưới 5 tuổi Tỷ lệ phân lập và xác định được DEC trong các nghiên cứu ở ác-hen-ti-na là 33,5%; Ni-giê-ria 60,3%; Mông Cổ 28,1% [17]

ở Việt Nam, một số công trình nghiên cứu đã cho thấy vai trò của DEC trong gây bệnh tiêu chảy Tỷ lệ phân lập được DEC theo Hoàng Tiến Mỹ (1997)

là 28,94% [10]; Đỗ Thị Thu Hương (2001), 24,9% [7] và Nguyễn Vũ Trung (2002) 22,5% [5]

1.3 E coli và bệnh tiêu chảy do E coli

E coli sống ở đại tràng của người và nhiều động vật khác nhau Vi khuẩn

theo phân ra ngoài và hiện diện trong đất, nước và không khí Tuy nhiên, một số

chủng E coli có những yếu tố độc lực đặc biệt giúp chúng có khả năng gây các

bệnh lý khác nhau Vào những năm 40 của thế kỉ trước, người ta xác định được

khả năng nhiễm trùng đường tiêu hoá, gây tiêu chảy của E coli [2]

Dựa trên đặc điểm lâm sàng của bệnh tiêu chảy, dịch tễ học, typ huyết thanh và sự có mặt của các yếu tố độc lực, DEC được chia làm 5 nhóm chính:

1.3.1 EPEC

Chủng E coli gây bệnh đường ruột loại này được phát hiện vào năm

1948 bởi Bray và Giles [28]

* Yếu tố độc lực và cơ chế gây bệnh

- EPEC gây tổn thương mô học dạng bám và gây thoái hoá (A/E) Sự bám của vi khuẩn vào tế bào biểu mô niêm mạc ruột làm thoái hoá các vi nhung mao, tác động gây rối loạn quá trình hấp thu nước và điện giải

- Cơ chế gây tiêu chảy:

+ Tác động của EPEC trên niêm mạc ruột dẫn đến đứt gãy các sợi actin trong lõi của vi nhung mao Các vi nhung mao của các tế bào biểu mô bị thoái hoá, mất diềm bàn chải, gây kém hấp thu ở lòng ruột

+ Mặt khác, khi nồng độ Ca++ trong tế bào tăng sẽ ức chế quá trình hấp thu ion Na+ và kích thích quá trình bài tiết Cl-

+ Sự thay đổi trong cơ chế vận chuyển của các ion trong tế bào, và do đáp ứng với các phản ứng làm giảm khả năng vận chuyển màng, đã dẫn đến tăng tính thấm của tế bào biểu mô ruột [28]

như CFA, yếu tố kháng nguyên trên bề mặt E coli

+ Các gen mã hoá cho CFA nằm trên plasmid, và plasmid này chứa đồng thời các gen mã hoá cho các độc tố ruột không chịu nhiệt-labile toxin (LT) và chịu nhiệt-stable toxin (ST)

- độc tố ruột:

Gồm độc tố ruột LT và độc tố ST Cả hai đều mang tính chất của ngoại

độc tố Một chủng ETEC có thể chỉ có LT, hoặc ST hoặc cả 2 [35]

* Bệnh cảnh lâm sàng

- Thời gian ủ bệnh từ 14 - 50 giờ Bệnh có thể diễn biến nhẹ, tự khỏi

- Biểu hiện lâm sàng thường đột ngột với tiêu chảy phân toàn nước, không

có nhầy, máu; ít khi kèm theo nôn và sốt

1.3.3 EIEC

* Yếu tố độc lực và cơ chế gây bệnh

EIEC gây bệnh bằng cách xâm nhập niêm mạc ruột Cơ chế xâm nhập của EIEC thông qua plasmid pInv có trọng lượng phân tử 140 MDa, trong đó,

chứa một số các gen mxi, spa mã hoá cho những protein cần thiết cho quá trình

gây bệnh gồm Ipa A, Ipa B, Ipa C và Ipa D

- Cơ chế gây bệnh: EIEC xâm nhập vào tế bào biểu mô đại tràng, làm tiêu huỷ các hạt vùi trong không bào, nhân lên trong nguyên tương và chúng xâm lấn sang các tế bào biểu mô kế cận Kết quả, tại niêm mạc đại tràng xảy ra phản ứng viêm, gây nên các tổn thương khu trú và có thể còn dẫn đến những tổn thương dạng loét

tế bào này) Stx huỷ hoại một cách có chọn lọc trên các tế bào mang chức năng hấp thu, và bảo tồn các tế bào bài tiết vùng kẽ Cơ chế này kết hợp với tổn thương A/E làm tăng tính thẩm thấu của ruột, dẫn đến tiêu chảy

* Bệnh cảnh lâm sàng

EHEC gây tiêu chảy phân có hoặc không có máu, hội chứng HUS (Heamolytic Uremic Syndrome) là biểu hiện của bộ ba triệu chứng: suy thận cấp - giảm tiểu cầu - thiếu máu tán huyết

1.3.5 EAEC

Là loại E coli có kiểu cách bám dính kết tập trên tế bào Hep-2 Đây là

loại DEC mới được phát hiện và nghiên cứu trong 20 năm gần đây

* Yếu tố độc lực và cơ chế gây bệnh

- Phần lớn các yếu tố độc lực của EAEC nằm trên một plasmid có trọng lượng phân tử 60 MDa Plasmid này có vai trò quan trọng trong kiểu cách bám dính kết tập (aggregative adherence) của EAEC, ký hiệu là plasmid AA-pAA

- Cơ chế gây bệnh của EAEC có 3 giai đoạn: Bám dính, tiết nhày và gây

độc tế bào

* Bệnh cảnh lâm sàng

- Thời gian ủ bệnh khoảng 7-22 giờ [28]

- Biểu hiện lâm sàng là tiêu chảy phân nhiều nước lẫn nhiều nhầy, sốt nhẹ

và thường không nôn

* Các phương pháp xác định E coli gây tiêu chảy trong phòng thí nghiệm

- Thử nghiệm trên môi trường nuôi cấy tế bào (cho EAEC), trên môi trường nuôi cấy phân lập SMAC (cho EHEC), trên chuột lang (cho EIEC), quai ruột thỏ (cho ETEC)…

- Thử nghiệm tạo váng trên bề mặt môi trường canh thang Muller- Hinton Đây là thử nghiệm đơn giản, rẻ tiền (cho EAEC)

- Phương pháp miễn dịch (cho EHEC, EIEC, ETEC, EPEC…)

- Mẫu dò ADN: Thường sử dụng đoạn nucleotide pCVD432 trên plasmid pAA (cho EAEC); Stx1,2 (cho EHEC), gen ial, ipaH (cho EIEC)… [43]

- Kỹ thuật PCR: Thiết kế đoạn mồi nhằm khuyếch đại đoạn nucleotide

pCVD432 có chiều dài 630bp trên plasmid pAA (cho EAEC), các gen Stx1 và Stx2, pVCD419, Hly (cho EHEC); lt, st (cho ETEC); eae, bfp (cho EPEC) [13,

22]

1.4 PCR trong xác định DEC

Sự ra đời của kỹ thuật PCR đã đưa lại một cuộc cách mạng trong việc nghiên cứu, phân tích gen và hệ gen Trước đây, khó khăn lớn nhất trong việc phân tích gen nằm ở chỗ, chúng là những đơn vị rất nhỏ, số lượng ít trong một hệ gen phức tạp và khổng lồ Kỹ thuật PCR ra đời đã thay đổi tất cả, giúp chúng ta có thể tạo ra một số lượng lớn các bản sao của một đoạn ADN mong muốn [12]

Phản ứng PCR dựa trên nguyên lý tổng hợp ADN trong tế bào, trong đó ADN được nhân lên theo cơ chế bán bảo tồn Về nguyên tắc, để bắt đầu quá trình tổng hợp ADN, hai sợi ADN làm khuôn mẫu bị tách ra dưới tác dụng của nhiệt độ Hai đoạn oligonucleotide từ 20-40 nucleotid gọi là mồi, sẽ gắn vào các

vị trí bổ xung trên đoạn ADN khuôn mẫu

Sơ đồ hóa Nguyên lý kỹ thuật PCR

1 Giai đoạn biến tính 2 Giai đoạn gắn mồi

3 Giai đoạn kéo dài mồi 4 Sau khi hoàn thành chu kỳ đầu tiên

Trong điều kiện của PCR, hai mồi sẽ được kéo dài về hai phía, tạo ra

đoạn ADN mới bổ xung với đoạn khuôn mẫu Với một cặp mồi đặc hiệu, một

đoạn ADN nào đó sẽ được tổng hợp sau mỗi chu kỳ của PCR Việc thao tác

được thực hịên trực tiếp trên chất liệu di truyền (đặc biệt trên các gen của vi khuẩn) để khuyếch đại một đoạn ADN đặc hiệu lên hàng triệu hay hàng tỷ lần trong thời gian ngắn [12]

Nhìn chung các tác giả đều có chung một nhận xét là kỹ thuật PCR đa mồi có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, và có ý nghĩa thiết thực, không chỉ trong chẩn đoán phòng thí nghiệm mà còn hỗ trợ trong điều trị và dự phòng tiêu chảy Trên thế giới, đã có nhiều tác giả nghiên cứu áp dụng kỹ thụât PCR trong xác

đinịh và phân loại DEC sử dụng các cặp mồi nhằm khuyếch đại đoạn nucleotide

pCVD432 có chiều dài 630bp trên plasmid pAA (cho EAEC), các gen Stx1 và Stx2, pVCD419, Hly (cho EHEC); lt, st (cho ETEC); eae, bfp (cho EPEC); ial, ipaH (cho EIEC)… [13, 22]

Tuy nhiên, các ứng dụng kỹ thuật PCR thường phải phối hợp với bước nuôi cấy bệnh phẩm trên môi trường đặc Qui trình này cần ít nhất 18-24 giờ cho vi khuẩn mọc sau khi cấy bệnh phẩm Trên thực tế lâm sàng, nhiều bệnh lý tiêu chảy tiến triển rất nhanh, trong khi do phải chờ đợi kết quả xét nghiệm, việc quyết định phương hướng điều trị gặp rất nhiều khó khăn Điều này cho thấy, việc xác định nhanh căn nguyên gây tiêu chảy có ý nghĩa rất quan trọng

Phát triển và hoàn thiện một qui trình PCR xác định nhanh vi khuẩn từ bệnh phẩm phân là vấn đề cần thiết Nó giúp giải quyết việc xác định nhanh các căn nguyên vi khuẩn gây tiêu chảy, giúp bác sĩ lâm sàng và dịch tễ có các biện pháp xử lý và điều trị kịp thời - thích hợp Tuy nhiên, vấn đề cơ bản là tách chiết ADN của vi khuẩn trực tiếp từ phân để sử dụng cho phản ứng PCR

Tuy nhiên, sự có mặt của một số chất trong phân như sắc tố mật, muối mật, polysaccharid, các chất cặn bã, xơ từ thức ăn đã tiêu hoá , một số chất chưa

được biết sẽ có thể ức chế phản ứng PCR, làm giảm đáng kể độ nhạy và độ

đặc hiệu của kỹ thuật Vấn đề đặt ra ở đây là làm sao tách chiết và tinh sạch

được ADN của các chủng E coli gây tiêu chảy trực tiếp từ bệnh phẩm

Đã có một số phương pháp tách chiết và tinh sạch ADN trực tiếp từ phân như phương pháp tách chiết dùng ethanol; phương pháp sắc ký lỏng cao áp;

phương pháp dùng bi thuỷ tinh hoặc bi silic [8] Đơn cử như phương pháp dùng phenol và chloroform của Viện quân y Mỹ (AFRIMS) [38] Qui trình cụ thể cũng khá phức tạp Hiện nay trên thị trường có một số bộ kit thương phẩm như bộ sinh phẩm “QIAamp DNA Stool Mini Kit” của hãng QIAGEN [34] Trong bộ kit này để tách chiết ADN của vi khuẩn trực tiếp từ phân, các nhà sản xuất đã đưa ra qui trìnhgồm có các bước sau:

- Ly giải 200mg (hoặc 2ml) mẫu phân trong 1,4ml dung dịch ASL Tế bào vi khuẩn và những tế bào bệnh lý khác trong phân, được ly giải đồng nhất ở

70oC trong 5 phút (nếu cần thiết có thể tăng lên 950C)

- Hấp phụ tạp chất: sử dụng 1 viên InhibitEX được cung cấp trong bộ kit,

để hấp phụ hết những chất ức chế phản ứng PCR

- Thuần khiết DNA:

+ Sử dụng Proteinase K, Buffer AL, ethanol để làm biến tính protein + Gắn kết ADN lên một màng silica-gel có sẵn trong ống QIAamp + Rửa màng bằng dung dịch Buffer AW1, Buffer AW2 để loại bỏ

những chất không thuần khiết

+ Sử dụng dung dịch Buffer AE để hoà tan ADN gắn trên màng

Tuy nhiên, các phương pháp này hoặc là quá phức tạp, hoặc quá đắt và chỉ thực hiện được ở những phòng xét nghiệm được trang bị máy móc hiện đại Vì thế, một phương pháp tách chiết ADN trực tiếp từ phân đơn giản, nhanh, hiệu quả và ít tốn kém sẽ có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong hoàn cảnh ở Việt Nam, là chìa khoá đối với kỹ thuật PCR xác định nhanh và trực tiếp các chủng

E coli gây tiêu chảy cũng như các vi khuẩn khác trực tiếp từ phân

E coli ATCC 11775 Chủng không có gen độc lực

Các chủng này được lưu giữ trong Ngân hàng của Đề án Bảo tồn nguồn gen Vi sinh vật y học

2.2 Vật liệu

2.2.1 Vật liệu dùng cho nuôi cấy và xác định vi khuẩn

- Môi trường dùng trong nuôi cấy và phân lập vi khuẩn: Sorbitol Mac Conkey (SMAC), Deoxycholate Citrat Agar (DCA)

- Các loại tube, đĩa petri

2.2.2 Sinh phẩm, hoá chất, và máy móc dùng trong PCR

2.2.2.1 Sinh phẩm, hóa chất

- Cặp mồi (primer) đặc hiệu cho các E coli gây tiêu chảy (Invitrogen-Mỹ)

Primer

Gen

đích

Số truy cập trong ngân hàng gen

Trình tự

Sản phẩm (bp)

- Thạch Agarose dùng trong điện di gel của hãng BBL

- Ethidium bromide dùng để nhuộm gel

- TAE (Tris Acetate EDTA)

- PBS (Phosphate Buffer Saline)

2.2.2.2 Dụng cụ và máy móc

- Máy điều nhiệt tự động GenAmp PCR System 9700 AB (Applied Biosystem, Mỹ)

- Máy ly tâm lạnh (Beckman, Mỹ)

- Bộ điện di ngang Horizonđ58 (Gibco-BRL, Mỹ)

- Máy soi và chụp gel Geldoc (BioRad, Mỹ)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp thực nghiệm trong phòng thí nghiệm

2.3.1 Kiểm tra chủng

* Kiểm tra bằng phương pháp định danh kinh điển

- Kiểm tra độ thuần của các chủng E coli bằng cách cấy trên môi trường

SMAC Độ thuần của chủng được đánh giá bằng hình thái khuẩn lạc, hình thể

và tính chất bắt màu của vi khuẩn trên tiêu bản nhuộm Gram [4]

* Kiểm tra các chủng E coli bằng phản ứng PCR đơn mồi

- Tiến hành tách chiết ADN từ vi khuẩn qua cấy phân (Theo quy trình của Viện Karolinska- Thụy Điển) [23]

+ Dùng que cấy lấy vi khuẩn từ đĩa môi trường SMAC cho vào 500 μl nước cất khuấy đều bằng máy Vortex để tạo thành huyền dịch vi khuẩn có độ đục Macfarland 4 (tương đương với nồng độ 109 vi khuẩn/ml)

+ Đun sôi cách thủy trong 20 phút để giải phóng ADN

+ Ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút trong 10 phút

+ Chuyển phần nước nổi (chứa ADN khuôn mẫu) sang ống Eppendorf mới + ADN khuôn mẫu này được bảo quản trong tủ -200C nếu không tiến hành phản ứng ngay

- Kiểm tra các chủng E coli bằng phản ứng PCR đơn mồi

+ Các thành phần tham gia phản ứng PCR đơn mồi gồm (theo qui trình khuyến cáo của Epicentre, Canada

+ Điện di các sản phẩm sau khi chạy PCR trên gel agarose 1,2% với dung

dịch đệm là TAE [12]

Các mẫu thực nghiệm được điện di song song cùng với chứng âm và dương Luôn có thang ADN chuẩn để đối chiếu kết quả khi đọc

+ Nhuộm ADN và đọc kết quả

Bản gel sau khi điện di được ngâm trong dung dịch Ethidium Bromide 1% pha trong nước cất (trong 10 phút), sau đó vớt bản gel ra ngâm vào nước cất

10 phút để khử ethidium bromide bám không đặc hiệu vào thạch Sau khi nhuộm, các vạch ADN trên bản gel sẽ phát sáng dưới ánh đèn cực tím

Đọc kết quả bằng máy GelDoc (BioRad) với phần mềm chuyên dụng

2.3.2 Chuẩn bị mẫu phân

- Sử dụng 10 bệnh phẩm phân bình thường (5 mẫu từ trẻ em và 5 mẫu từ người lớn), trộn đều Lấy 1 ăng bệnh phẩm đầy cấy lên trên môi trường SMAC, để

370C, 16-18 giờ

- Sau khi có các khuẩn lạc mọc, lấy que cấy chạm vào tất cả các khuẩn lạc trên

đĩa cấy, hòa vào 500 μl nước cất Đun sôi cách thuỷ 1000C trong 20 phút để giải phóng ADN

- Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút, loại bỏ cặn Nước nổi chứa ADN dùng làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR

- Tiến hành kỹ thuật PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho từng DEC (Phần 2.3.1)

- Chọn 10 mẫu phân có kết quả âm tính sau 3 lần chạy PCR liên tiếp Đây là 10

mẫu phân được coi là không có E coli gây tiêu chảy

- Trộn đều các mẫu phân này, chia nhỏ thành các phần 200mg Bảo quản trong

tủ – 200C

- Sử dụng các mẫu phân này trong quá trình:

+ Phát triển và hoàn thiện qui trình tách chiết ADN của E coli trực tiếp từ phân

+ Tối ưu hoá hệ thống PCR đa mồi

2.3.3 Phát triển qui trình tách chiết ADN của DEC trực tiếp từ phân

2.3.3.1 Phát triển qui trình

- Đầu tiên, qui trình được thực hiện với chủng chuẩn EAEC, do đây là loại

E coli gây tiêu chảy gặp với tỷ lệ cao nhất trong số 5 loại E coli gây tiêu chảy

có thể gặp trong bệnh phẩm

Dựa vào một số nghiên cứu trước đây [23, 26, 44] chúng tôi dự kiến qui trình

như sau:

- Ly tâm với tốc độ thấp để loại bỏ các chất có kích thước lớn trong phân

- Ly tâm với tốc độ cao hơn để lấy vi khuẩn và loại bỏ các chất hoà tan trong phân

- Đun huyền dịch vi khuẩn để giải phóng ADN

- Ly tâm lấy nước nổi chứa ADN làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR

Các bước thực hiện của qui trình:

+ Bước 1: 200 mg phân được hoà vào huyền dịch vi khuẩn có độ đục

Macfarland bằng 4 (tương đương với nồng độ 109 vi khuẩn/ml)

+ Bước 2: Ly tâm huyền dịch phân ở bước 1 với tốc độ 1000 vòng/phút trong 5

phút Lấy nước nổi

+ Bước 3: Nước nổi từ bước 2 được tiếp tục ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút

trong 10 phút Lấy nước nổi

+ Bước 4: Nước nổi từ bước 3 tiếp tục được ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút

Nước nổi chứa ADN, dùng làm ADN khuôn mẫu cho phản ứng PCR

2.3.3.2 Hoàn thiện qui trình

- Lặp lại các bước 2, 3, 4 của qui trình trên từ 1 đến 4 lần

- Tất cả các ADN sau tách chiết trong quá trình hoàn thiện, đều được chạy phản ứng PCR đơn mồi xác định EAEC theo hướng dẫn của bộ sinh phẩm Epicentre,

Tính chất băng ADN trên thạch điện di Đánh giá kết quả

Băng ADN mờ hoặc chấm hạt thành hàng (+)

2.3.4.2 Định lượng ADN của vi khuẩn tách được từ mẫu phân

Sử dụng quang phổ kế (Spectrophotometer-Beckman) Phương pháp này dựa vào sự hấp thu ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 và 280 nm của các bazơ nitơ Nồng độ ADN trong mẫu được tính theo công thức:

C= A 260 x 50 (μg/ml)

Trong đó: C: nồng độ ADN cần xác định

A260: giá trị mật độ quang ở bước sóng 260nm

50: hệ số đo OD của ADN sợi đôi

Độ sạch của ADN được đánh giá thông qua tỷ số OD260/OD280

ADN được coi là sạch nếu tỷ số này nằm trong khoảng 1,8 - 2,0 [34]

+ Đánh giá dựa vào một số tiêu chuẩn sau:

1 Phản ứng PCR cho kết quả tốt nhất (+++)

2 Nồng độ ADN cao hơn 100 μg/ml

Theo một số tác giả [12, 25, 41] lượng ADN khuôn mẫu dùng cho một phản ứng PCR khoảng 100-500 ng đối với đoạn ADN mẫu từ nhiễm sắc thể Trong nghiên cứu này, một số đoạn gen cần phát hiện của DEC nằm cả ở

plasmid và nhiễm sắc thể Chúng tôi lấy giá trị trung bình khoảng 300 ng Theo

qui trình của Epicentre (lượng ADN khuôn mẫu là 3μl/phản ứng), thì nồng độ

ADN khuôn mẫu cần tối thiểu là 100 ng/μl tương đương với 100 μg/ml

3 Độ tinh sạch của ADN đạt từ 1,8-2,0

Qui trình sau khi đã hoàn thiện sẽ được dùng để:

- Đánh giá mức độ lặp lại

- áp dụng qui trình đã tối ưu với các loại DEC khác

Qui trình PCR

+ Phản ứng PCR đa mồi

(Theo qui trình của Nguyễn Vũ Trung và cộng sự [5])

- Các thành phần tham gia phản ứng PCR đa mồi gồm (theo Epicentre, Canada):

+ Thực hiện phản ứng PCR đa mồi với nồng độ DNA khuôn mẫu thay đổi

Trong nghiên cứu của mình, Nguyễn Vũ Trung và cộng sự đã tối ưu hoá

hệ thống PCR đa mồi xác định E coli gây tiêu chảy, sử dụng ADN tách từ

khuẩn lạc [30] Điểm khác nhau cơ bản giữa qui trình xác định DEC trong

nghiên cứu của chúng tôi so với nghiên cứu của Nguyễn Vũ Trung, là ADN

được sử dụng cho phản ứng PCR Nghiên cứu của chúng tôi sử dụng ADN tách

chiết trực tiếp từ phân

Nồng độ và độ tinh sạch của ADN phụ thuộc vào phương pháp tách chiết Chính vì vậy trong nghiên cứu này, tối ưu hoá hệ thống PCR đa mồi thực chất là tối ưu hoá nồng độ ADN sử dụng cho phản ứng PCR

Để tối ưu hoá nồng độ ADN sử dụng cho phản ứng PCR chúng tôi tiến hành như sau:

- Pha lần lượt các chủng chuẩn E coli gây tiêu chảy EAEC, EHEC, HIEC,

EPEC, và ETEC vào 1 ml nước cất để có độ đục Macfarland 4 (tương đương với

109 vi khuẩn/ml)

- Trộn 1 ml từng huyền dịch trên với 200 mg phân đã được xác định không có

E coli gây tiêu chảy

- Tách chiết ADN theo qui trình đã hoàn thiện (Phần 2.3.3.2)

- Mỗi thử nghiệm cho một chủng được lặp lại 10 lần

- Dung dịch ADN tách chiết từ các chủng DEC, được định lượng bằng quang phổ

kế Tính nồng độ ADN trung bình ban đầu sau khi tách chiết

- Phản ứng PCR đa mồi xác định E coli gây tiêu chảy trong điều kiện thay đổi

nồng độ ADN khuôn cho một phản ứng, được tiến hành với:

Nồng độ ban đầu; 0,5 μg; 100 ng; 10 ng; 1 ng; 100 pg; 10 pg; 1 pg để tìm ra lượng ADN khuôn tối ưu cho mỗi cặp mồi sủ dụng

- Các thành phần tham gia phản ứng đều giống nhau

- Luôn có chứng âm và Dương đi kèm khi làm phản ứng để kiểm tra kết quả

2.6 Địa điểm nghiên cứu

- Bộ môn Vi sinh- Trường Đại học Y Hà Nội

- Khoa Xét nghiệm Viện Các bệnh Truyền nhiễm và Nhiệt đới Quốc gia

CHƯƠNG III kết quả nghiên cứu

3.1 Kết quả kiểm tra các chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu

Các chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu được kiểm tra bằng:

Nuôi cấy- phân lập và PCR

Bảng 3.1 kết quả kiểm tra các chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu

bằng phương pháp định danh kinh điển

7 E coli ATCC 11775 E coli

Nhận xét Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy:

7 chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu đã được kiểm tra và đúng với tên trong lý lịch chủng của Đề án Lưu giữ Nguồn gen Vi sinh Y học

Bảng 3.2 Kết quả kiểm tra các chủng E coli gây tiêu chảy bằng kỹ thuật

PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho từng chủng

STT

E coli

gây tiêu chảy

Tên chủng kiểm tra

Cặp mồi sử dụng Kết quả

kiểm tra

Primer Gen

đích

Sản phẩm (bp)

6 E coli ATCC 11775 Với từng cặp mồi trên -

Nhận xét Kết quả ở Bảng 3.2 cho thấy:

Các chủng E coli gây tiêu chảy (DEC) có phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu, riêng rẽ cho từng chủng cho kết quả dương tính Chủng E coli ATCC

11775 không gây tiêu chảy cho kết quả âm tính

1 2 3 4 5 6 7 8

1: Ladder 100bp 2: EAEC 630bp 3: EIEC 320bp 4: ETEC

147bp 322bp 5: EHEC 43889

298bp và 376bp

6: EHEC43890 130bp và 376bp

7: EPEC 376bp 367bp

8: E coli

ATCC11775

Hình 1 Kết quả PCR từng chủng DEC với các cặp mồi đặc hiệu

3.2 Kết quả chuẩn bị mẫu phân

Bảng 3.3 Kết quả kiểm tra các mẫu phân bằng kỹ thuật PCR

STT Mẫu phân Kết quả PCR với 8 cặp mồi đặc hiệu cho DEC

Nhận xét Kết quả ở Bảng 3.3 cho thấy, PCR kiểm tra 10 mẫu phân cho kết quả

âm tính, các mẫu phân này không có DEC

3.3 Kết quả phát triển và hoàn thiện qui trình tách chiết ADN của DEC

trực tiếp từ phân

3.3.1 Tối ưu lượng nước cất để hoà tan 200 mg phân

- 200 mg mẫu phân đã chuẩn bị cho vào các tube nhựa chứa 1, 2, 3, 4 và 5 ml nước cất Lắc trên máy lắc đến khi phân được hoà tan thành một huyền dịch

- Lặp lại thử nghiệm 10 lần Kết quả thử nghiệm như sau:

Bảng 3.4 Kết quả tối ưu hoá lượng nước cất để hoà tan 200 mg phân

Không hoà tan hết phân

Hoà tan hết phân

Hoà tan hết phân

Hoà tan hết phân

Nhận xét Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy:

Lượng nước cất tối thiểu phải là 3ml mới đủ để hoà tan hết 200 mg phân

3.3.2 Phát triển qui trình

- Sử dụng chủng EAEC 97R, cấy trên môi trường SMAC, lấy khuẩn lạc hoà với nước cất tạo huyền dịch vi khuẩn có độ đục Macfarland bằng 4 (nồng độ vi khuẩn tương đương với 109 vi khuẩn /ml) để bắt đầu thực hiện qui trình ly tâm

- Theo thiết kế ban đầu: Như mô tả trong phần 2.3.3.1

Bảng 3.5 Kết quả PCR dùng ADN tách chiết theo thiết kế ban đầu

(sử dụng cặp mồi EA)

1000 v/p

trong 10 phút

3000 v/p trong 10 phút

12000 v/p trong 10 phút

Nhận xét Kết quả ở bảng 3.5 cho thấy:

- Với qui trình thiết kế ban đầu, phần lớn kết quả PCR qua các lần thử nghiệm đều âm tính

- Khi thực hiện ly tâm 1000 vòng/phút trong 10 phút từ 1 -2 lần, tiếp theo

là 3000 vòng/phút từ 1 - 5 lần, và 1 lần ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, kết quả PCR dương tính yếu

Sau khi thử nghiệm nhiều lần bằng cách thay đổi tốc độ, thời gian và số lần ly tâm Dựa vào kết quả PCR, chúng tôi đã thay đổi qui trình tách chiết ADN của EAEC trực tiếp từ phân như sau:

- Bước 1: 200 mg phân được hoà với 1ml huyền dịch vi khuẩn có độ đục

Macfarland 4 (tương đương với 109 vi khuẩn /ml), và 2ml nước cất, trộn đều trên máy lắc

- Bước 2: Ly tâm huyền dịch phân ở bước 1 với tốc độ 1000 vòng/phút trong 10

phút cho lắng các thành phần có kích thước lớn Lấy nước nổi

- Bước 3: Nước nổi từ bước 2 được ly tâm tiếp với tốc độ 2000 vòng/phút trong

10 phút để lắng các thành phần có kích cỡ trung bình Lấy nước nổi

- Bước 4: Nước nổi từ bước 3 được ly tâm tiếp với tốc độ 4000 vòng/phút trong

10 phút để lắng vi khuẩn Loại bỏ nước nổi và lấy cặn

- Bước 5: Cho thêm vào cặn 500 μl nước cất, lắc đều trên máy lắc Ly tâm với

tốc độ 4000 vòng/phút trong 5 phút Loại bỏ nước nổi

- Bước 6: Cho 300 μl nước cất vào cặn thu được ở bước 5 Đun sôi cách thuỷ

1000C trong 20 phút

- Bước 7: Ly tâm 12000 vòng/phút trong 20 phút, loại bỏ cặn

Nước nổi chứa ADN dùng làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR

3.3.3 Hoàn thiện qui trình

Để hoàn thiện qui trình ly tâm và tách chiết ADN trực tiếp từ phân của EAEC, chúng tôi tiến hành lặp lại 1 – 4 lần các bước 2, 3, 5 của qui trình trên

Cụ thể là 84 lần tách chiết ADN trực tiếp từ phân theo sơ đồ 1, gồm:

- 1 đến 4 lần ly tâm với tốc độ 1000 vòng trong 10 phút

- 1 đến 4 lần ly tâm với tốc độ 2000 vòng trong 10 phút

- 1 đến 4 lần ly tâm với tốc độ 4000 vòng trong 10 phút

Sau đó lặp lại thử nghiệm 3 lần để lấy kết quả trung bình

Mục đích là lựa chọn qui trình hoàn thiện đạt các tiêu chuẩn sau: phản ứng PCR cho kết quả tốt nhất (+++); nồng độ ADN cao hơn 100 μg/ml, độ tinh sạch của ADN đạt từ 1,8-2,0 và tốn ít thời gian nhất

Sơ đồ 1: Hoàn thiện qui trình ly tâm và tách chiết ADN

3 lần 4000rpm ầ

4 lần 4000rpm ầ