Đánh giá hiệu quả tách chiết ADN của vi khuẩn trực tiếp từ phân

§Ò tμi: §¸nh gi¸ hiÖu qu¶ t¸ch chiÕt AND cña vi khuÈn trùc tiÕp tõ ph©n Chñ nhiÖm ®Ò tμi: TS. NguyÔn Vò Trung 1 Đặt vấn đề Tiêu chảy là một trong những vấn đề quan trọng về sức khỏe, đặc biệt đối với trẻ em trên toàn thế giới. Tiêu chảy chiếm vị trí thứ hai về tỷ lệ tử vong ở trẻ em dới 5 tuổi do mắc các bệnh nhiễm khuẩn (chỉ sau nhiễm khuẩn đờng hô hấp). Tiêu chảy còn là nguyên nhân quan trọng gây suy dinh dỡng, ảnh hởng đến sự tăng trởng của trẻ. ớc tính mỗi năm có khoảng 4 -10 triệu trờng hợp tử vong do tiêu chảy, trong đó phần lớn là trẻ dới 5 tuổi. Số trẻ em bị bệnh tiêu chảy chiếm khoảng 22% tổng số trẻ em nằm viện [2]. Từ khi thành lập Chơng trình Quốc gia Phòng chống Bệnh tiêu chảy năm 1982, số lợt tiêu chảy hàng năm trên mỗi trẻ đã giảm xuống, từ 2,2 lợt năm 1985 xuống còn 1,8 lợt năm 1990, và 1,3 lợt năm 2003. Tỷ lệ tử vong do tiêu chảy cũng giảm 2,4% ; 1,4% và 0,7% trong lần lợt các năm 1986-1987, 1990-1991, và 2003 [8]. Có nhiều tác nhân vi sinh vật gây tiêu chảy nh vi khuẩn, vi rút, ký sinh trùng. Trong đó, các căn nguyên vi khuẩn đóng vai trò quan trọng. Một số vi khuẩn hay gây tiêu chảy thờng gặp là Salmonella spp; Shigella spp; Escherichia coli gây tiêu chảy (Diarrheagenic Escherichia coli-DEC). Đặc biệt gần đây, vai trò của DEC đang thu hút đợc sự quan tâm của các bác sĩ lâm sàng và các nhà vi sinh. Có nhiều phơng pháp xác định các căn nguyên vi khuẩn gây tiêu chảy: Phơng pháp định danh kinh điển sử dụng các tính chất sinh vật hóa học và ngng kết với kháng huyết thanh đặc hiệu; Phơng pháp thử nghiệm trên động vật thí nghiệm; Phơng pháp miễn dịch; Phơng pháp sử dụng kỹ thuật nuôi cấy trên tế bào; Các phơng pháp sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử nh lai ADN, phản ứng khuyếch đại gen - Polymerase Chain Reaction (PCR). Trong số các phơng pháp trên, PCR rất hay đợc dùng vì kỹ thuật này có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao [8]. Tuy nhiên cho tới nay, phần lớn các qui trình sử dụng PCR để xác định các vi khuẩn nói chung và vi khuẩn gây tiêu chảy nói riêng, đều thông qua bớc cấy bệnh phẩm phân trên các môi trờng đặc, rồi tiến hành chọn lựa các khuẩn lạc để tách chiết ADN của vi khuẩn cho phản ứng PCR. Nh vậy, cần 2 ít nhất 24-30 giờ để phát hiện đợc sự có mặt của vi khuẩn gây tiêu chảy trong phân [33]. Trên lâm sàng, việc xác định nhanh các căn nguyên vi khuẩn có ý nghĩa rất quan trọng trong chẩn đoán và lựa chọn chế độ điều trị thích hợp cho bệnh nhân. Nếu có thể sử dụng kỹ thuật PCR với ADN tách chiết trực tiếp từ phân sẽ giúp cho qui trình xác định căn nguyên vi khuẩn gây tiêu chảy chỉ còn vài giờ. Điều này sẽ góp phần quan trọng trong quá trình chẩn đoán và điều trị. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài "Đánh giá hiệu quả tách chiết ADN của vi khuẩn trực tiếp từ phân" với 2 mục tiêu sau: 1. Phát triển qui trình tách chiết ADN của E. coli gây tiêu chảy trực tiếp từ phân. 2. Đánh giá hiệu quả tách chiết ADN trực tiếp từ phân. 3 CHƯƠNG I Tổng quan 1.1. Tình hình bệnh tiêu chảy 1.1.1. Trên thế giới Tiêu chảy có tỷ lệ mắc và tử vong đứng hàng thứ hai sau nhiễm khuẩn đờng hô hấp cấp tính ở trẻ em. Theo Tổ chức Y tế Thế giới, hằng năm, trên thế giới có khoảng 1 tỷ lợt ngời bị tiêu chảy và 4 -10 triệu trờng hợp tử vong, phần lớn ở trẻ dới 5 tuổi [2]. 1.1.2. ở Việt Nam Tiêu chảy là nguyên nhân quan trọng gây suy dinh dỡng và ảnh hởng đến sự tăng trởng của trẻ. Theo các nghiên cứu gần đây, bệnh tiêu chảy ở nớc ta đứng vị trí hàng đầu trong 10 bệnh phổ biến nhất, và là nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ hai ở trẻ em do mắc các bệnh nhiễm khuẩn (chỉ sau nhiễm khuẩn đờng hô hấp). Số trẻ em bị bệnh tiêu chảy chiếm khoảng 22% tổng số trẻ em nằm viện [6, 8, 9]. 1.2. Các căn nguyên vi sinh vật gây tiêu chảy Các căn nguyên vi sinh vật gây tiêu chảy thờng gặp là vi rút, vi khuẩn và ký sinh trùng. Một số nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ phân lập đợc căn nguyên vi sinh vật gây tiêu chảy vào khoảng 70% các trờng hợp tiêu chảy [5, 15]. Trong số các tác nhân vi khuẩn gây tiêu chảy, E. coli đã đợc quan tâm từ rất lâu. Tỷ lệ phân lập đợc các DEC từ bệnh phẩm phân trong một số nghiên cứu từ 22% đến 30%, có nơi tới 60,3%. Tỷ lệ này cao hơn so với các căn nguyên khác nh Shigella spp., 4,7-6,1%; Salmonella spp., 0,9-6%; Campylobacter spp., 7%; Bacteroides fragilis sinh độc tố ruột 7,3%. Điều này cho thấy vai trò quan trọng của DEC trong bệnh tiêu chảy [2]. Theo một số tác giả nớc ngoài, DEC đóng vai trò rất quan trọng trong bệnh tiêu chảy ở trẻ dới 5 tuổi. Tỷ lệ phân lập và xác định đợc DEC trong các nghiên cứu ở ác-hen-ti-na là 33,5%; Ni-giê-ria 60,3%; Mông Cổ 28,1% [17]. 4 ở Việt Nam, một số công trình nghiên cứu đã cho thấy vai trò của DEC trong gây bệnh tiêu chảy. Tỷ lệ phân lập đợc DEC theo Hoàng Tiến Mỹ (1997) là 28,94% [10]; Đỗ Thị Thu Hơng (2001), 24,9% [7] và Nguyễn Vũ Trung (2002) 22,5% [5] 1.3. E. coli và bệnh tiêu chảy do E. coli E. coli sống ở đại tràng của ngời và nhiều động vật khác nhau. Vi khuẩn theo phân ra ngoài và hiện diện trong đất, nớc và không khí. Tuy nhiên, một số chủng E. coli có những yếu tố độc lực đặc biệt giúp chúng có khả năng gây các bệnh lý khác nhau. Vào những năm 40 của thế kỉ trớc, ngời ta xác định đợc khả năng nhiễm trùng đờng tiêu hoá, gây tiêu chảy của E. coli [2]. Dựa trên đặc điểm lâm sàng của bệnh tiêu chảy, dịch tễ học, typ huyết thanh và sự có mặt của các yếu tố độc lực, DEC đợc chia làm 5 nhóm chính: 1.3.1. EPEC Chủng E. coli gây bệnh đờng ruột loại này đợc phát hiện vào năm 1948 bởi Bray và Giles [28]. * Yếu tố độc lực và cơ chế gây bệnh - EPEC gây tổn thơng mô học dạng bám và gây thoái hoá (A/E). Sự bám của vi khuẩn vào tế bào biểu mô niêm mạc ruột làm thoái hoá các vi nhung mao, tác động gây rối loạn quá trình hấp thu nớc và điện giải. - Cơ chế gây tiêu chảy: + Tác động của EPEC trên niêm mạc ruột dẫn đến đứt gãy các sợi actin trong lõi của vi nhung mao. Các vi nhung mao của các tế bào biểu mô bị thoái hoá, mất diềm bàn chải, gây kém hấp thu ở lòng ruột. + Mặt khác, khi nồng độ Ca ++ trong tế bào tăng sẽ ức chế quá trình hấp thu ion Na + và kích thích quá trình bài tiết Cl - . + Sự thay đổi trong cơ chế vận chuyển của các ion trong tế bào, và do đáp ứng với các phản ứng làm giảm khả năng vận chuyển màng, đã dẫn đến tăng tính thấm của tế bào biểu mô ruột [28]. 5 * Bệnh cảnh lâm sàng - Thời kỳ ủ bệnh ngắn, khoảng 9-12 giờ (nghiên cứu trên ngời tình nguyện) [28]. - Bệnh cảnh lâm sàng thờng là tiêu chảy phân toàn nớc, không có nhầy và máu; có thể kèm theo nôn và sốt nhẹ. 1.3.2. ETEC * Yếu tố độc lực và cơ chế gây bệnh Khả năng gây bệnh của ETEC liên quan đến hai yếu tố độc lực là khả năng bám, c ngụ ở niêm mạc ruột và sản sinh độc tố. - Yếu tố bám dính: + ETEC bám một cách đặc hiệu lên các receptor trên tế bào màng nhầy biểu mô ruột. Quá trình này đợc thực hiện thông qua một số yếu tố trung gian nh CFA, yếu tố kháng nguyên trên bề mặt E. coli. + Các gen mã hoá cho CFA nằm trên plasmid, và plasmid này chứa đồng thời các gen mã hoá cho các độc tố ruột không chịu nhiệt-labile toxin (LT) và chịu nhiệt-stable toxin (ST). - độc tố ruột: Gồm độc tố ruột LT và độc tố ST. Cả hai đều mang tính chất của ngoại độc tố. Một chủng ETEC có thể chỉ có LT, hoặc ST hoặc cả 2 [35]. * Bệnh cảnh lâm sàng - Thời gian ủ bệnh từ 14 - 50 giờ. Bệnh có thể diễn biến nhẹ, tự khỏi. - Biểu hiện lâm sàng thờng đột ngột với tiêu chảy phân toàn nớc, không có nhầy, máu; ít khi kèm theo nôn và sốt. 1.3.3. EIEC * Yếu tố độc lực và cơ chế gây bệnh EIEC gây bệnh bằng cách xâm nhập niêm mạc ruột. Cơ chế xâm nhập của EIEC thông qua plasmid pInv có trọng lợng phân tử 140 MDa, trong đó, chứa một số các gen mxi, spa mã hoá cho những protein cần thiết cho quá trình gây bệnh gồm Ipa A, Ipa B, Ipa C và Ipa D. 6 - Cơ chế gây bệnh: EIEC xâm nhập vào tế bào biểu mô đại tràng, làm tiêu huỷ các hạt vùi trong không bào, nhân lên trong nguyên tơng và chúng xâm lấn sang các tế bào biểu mô kế cận. Kết quả, tại niêm mạc đại tràng xảy ra phản ứng viêm, gây nên các tổn thơng khu trú và có thể còn dẫn đến những tổn thơng dạng loét. * Bệnh cảnh lâm sàng - Thời gian ủ bệnh ngắn từ 10 - 18 giờ (quan sát trên những ngời tình nguyện và các vụ dịch) [28]. - Vi khuẩn xâm lấn niêm mạc ruột gây triệu chứng giống hội chứng lỵ, phân ít thờng lẫn nhầy và máu. - ở những bệnh nhân nhiễm chủng EIEC sinh độc tố ruột, bệnh cảnh lâm sàng chỉ biểu hiện đơn thuần của một tiêu chảy phân nớc. 1.3.4. EHEC * Yếu tố độc lực và cơ chế gây bệnh. EHEC gây bệnh qua 2 cơ chế chính là: Gây tổn thơng mô bệnh học giống EPEC và sinh độc tố ruột. - Cơ chế sinh độc tố ruột: + Các chủng EHEC tiết ra các độc tố có tác dụng gây độc tế bào Vero nên còn đợc gọi là Verotoxin. Mặt khác, nó tơng tự nh độc tố Shiga nên còn có tên khác là Shiga-like-toxin, ký hiệu Stx. + Stx là một protein có tính kháng nguyên mạnh, mang tính chất của một ngoại độc tố, có các gen mã hoá nằm trên nhiễm sắc thể. Có hai loại Stx: Stx1 và Stx2 [29]. - Cơ chế gây bệnh: + Cơ chế gây tiêu chảy: Sau khi gắn vào tế bào, độc tố ruột của EHEC đi vào trong tế bào, chuyển tới bộ Golgi, sau đó đợc vận chuyển tới lới nội sinh chất. Tại đó, nó ức chế quá trình tổng hợp protein trong bào tơng (làm chết các tế bào này). Stx huỷ hoại một cách có chọn lọc trên các tế bào mang chức năng hấp thu, và bảo tồn các tế bào bài tiết vùng kẽ. Cơ chế này kết hợp với tổn thơng A/E làm tăng tính thẩm thấu của ruột, dẫn đến tiêu chảy 7 * Bệnh cảnh lâm sàng EHEC gây tiêu chảy phân có hoặc không có máu, hội chứng HUS (Heamolytic Uremic Syndrome) là biểu hiện của bộ ba triệu chứng: suy thận cấp - giảm tiểu cầu - thiếu máu tán huyết. 1.3.5. EAEC Là loại E. coli có kiểu cách bám dính kết tập trên tế bào Hep-2. Đây là loại DEC mới đợc phát hiện và nghiên cứu trong 20 năm gần đây. * Yếu tố độc lực và cơ chế gây bệnh - Phần lớn các yếu tố độc lực của EAEC nằm trên một plasmid có trọng lợng phân tử 60 MDa. Plasmid này có vai trò quan trọng trong kiểu cách bám dính kết tập (aggregative adherence) của EAEC, ký hiệu là plasmid AA-pAA. - Cơ chế gây bệnh của EAEC có 3 giai đoạn: Bám dính, tiết nhày và gây độc tế bào. * Bệnh cảnh lâm sàng - Thời gian ủ bệnh khoảng 7-22 giờ [28]. - Biểu hiện lâm sàng là tiêu chảy phân nhiều nớc lẫn nhiều nhầy, sốt nhẹ và thờng không nôn. * Các phơng pháp xác định E. coli gây tiêu chảy trong phòng thí nghiệm - Thử nghiệm trên môi trờng nuôi cấy tế bào (cho EAEC), trên môi trờng nuôi cấy phân lập SMAC (cho EHEC), trên chuột lang (cho EIEC), quai ruột thỏ (cho ETEC) - Thử nghiệm tạo váng trên bề mặt môi trờng canh thang Muller- Hinton. Đây là thử nghiệm đơn giản, rẻ tiền (cho EAEC). - Phơng pháp miễn dịch (cho EHEC, EIEC, ETEC, EPEC) - Mẫu dò ADN: Thờng sử dụng đoạn nucleotide pCVD432 trên plasmid pAA (cho EAEC); Stx1,2 (cho EHEC), gen ial, ipaH (cho EIEC) [43]. - Kỹ thuật PCR: Thiết kế đoạn mồi nhằm khuyếch đại đoạn nucleotide pCVD432 có chiều dài 630bp trên plasmid pAA (cho EAEC), các gen Stx1 và Stx2, pVCD419, Hly (cho EHEC); lt, st (cho ETEC); eae, bfp (cho EPEC) [13, 22]. 8 1.4. PCR trong xác định DEC Sự ra đời của kỹ thuật PCR đã đa lại một cuộc cách mạng trong việc nghiên cứu, phân tích gen và hệ gen. Trớc đây, khó khăn lớn nhất trong việc phân tích gen nằm ở chỗ, chúng là những đơn vị rất nhỏ, số lợng ít trong một hệ gen phức tạp và khổng lồ. Kỹ thuật PCR ra đời đã thay đổi tất cả, giúp chúng ta có thể tạo ra một số lợng lớn các bản sao của một đoạn ADN mong muốn [12]. Phản ứng PCR dựa trên nguyên lý tổng hợp ADN trong tế bào, trong đó ADN đợc nhân lên theo cơ chế bán bảo tồn. Về nguyên tắc, để bắt đầu quá trình tổng hợp ADN, hai sợi ADN làm khuôn mẫu bị tách ra dới tác dụng của nhiệt độ. Hai đoạn oligonucleotide từ 20-40 nucleotid gọi là mồi, sẽ gắn vào các vị trí bổ xung trên đoạn ADN khuôn mẫu. Sơ đồ hóa Nguyên lý kỹ thuật PCR 1. Giai đoạn biến tính. 2. Giai đoạn gắn mồi. 3. Giai đoạn kéo dài mồi. 4. Sau khi hoàn thành chu kỳ đầu tiên. Trong điều kiện của PCR, hai mồi sẽ đợc kéo dài về hai phía, tạo ra đoạn ADN mới bổ xung với đoạn khuôn mẫu. Với một cặp mồi đặc hiệu, một 9 đoạn ADN nào đó sẽ đợc tổng hợp sau mỗi chu kỳ của PCR. Việc thao tác đợc thực hịên trực tiếp trên chất liệu di truyền (đặc biệt trên các gen của vi khuẩn) để khuyếch đại một đoạn ADN đặc hiệu lên hàng triệu hay hàng tỷ lần trong thời gian ngắn [12]. Nhìn chung các tác giả đều có chung một nhận xét là kỹ thuật PCR đa mồi có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, và có ý nghĩa thiết thực, không chỉ trong chẩn đoán phòng thí nghiệm mà còn hỗ trợ trong điều trị và dự phòng tiêu chảy. Trên thế giới, đã có nhiều tác giả nghiên cứu áp dụng kỹ thụât PCR trong xác đinịh và phân loại DEC sử dụng các cặp mồi nhằm khuyếch đại đoạn nucleotide pCVD432 có chiều dài 630bp trên plasmid pAA (cho EAEC), các gen Stx1 và Stx2, pVCD419, Hly (cho EHEC); lt, st (cho ETEC); eae, bfp (cho EPEC); ial, ipaH (cho EIEC) [13, 22]. Tuy nhiên, các ứng dụng kỹ thuật PCR thờng phải phối hợp với bớc nuôi cấy bệnh phẩm trên môi trờng đặc. Qui trình này cần ít nhất 18-24 giờ cho vi khuẩn mọc sau khi cấy bệnh phẩm. Trên thực tế lâm sàng, nhiều bệnh lý tiêu chảy tiến triển rất nhanh, trong khi do phải chờ đợi kết quả xét nghiệm, việc quyết định phơng hớng điều trị gặp rất nhiều khó khăn. Điều này cho thấy, việc xác định nhanh căn nguyên gây tiêu chảy có ý nghĩa rất quan trọng. Phát triển và hoàn thiện một qui trình PCR xác định nhanh vi khuẩn từ bệnh phẩm phân là vấn đề cần thiết. Nó giúp giải quyết việc xác định nhanh các căn nguyên vi khuẩn gây tiêu chảy, giúp bác sĩ lâm sàng và dịch tễ có các biện pháp xử lý và điều trị kịp thời - thích hợp. Tuy nhiên, vấn đề cơ bản là tách chiết ADN của vi khuẩn trực tiếp từ phân để sử dụng cho phản ứng PCR. Tuy nhiên, sự có mặt của một số chất trong phân nh sắc tố mật, muối mật, polysaccharid, các chất cặn bã, xơ từ thức ăn đã tiêu hoá , một số chất cha đợc biết sẽ có thể ức chế phản ứng PCR, làm giảm đáng kể độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật. Vấn đề đặt ra ở đây là làm sao tách chiết và tinh sạch đợc ADN của các chủng E. coli gây tiêu chảy trực tiếp từ bệnh phẩm. Đã có một số phơng pháp tách chiết và tinh sạch ADN trực tiếp từ phân nh phơng pháp tách chiết dùng ethanol; phơng pháp sắc ký lỏng cao áp; [...]... ADN khuôn mẫu cho phản ứng PCR 2.3.3.2 Hoàn thiện qui trình - Lặp lại các bớc 2, 3, 4 của qui trình trên từ 1 đến 4 lần 16 - Tất cả các ADN sau tách chiết trong quá trình hoàn thiện, đều đợc chạy phản ứng PCR đơn mồi xác định EAEC theo hớng dẫn của bộ sinh phẩm Epicentre, Canada (Phần 2.3.1) 2.3.4 Đánh giá hiệu quả tách chiết ADN trực tiếp từ phân 2.3.4.1 Đánh giá kết quả PCR Hiệu quả tách chiết ADN. .. đợc đánh giá dựa vào độ dày của băng ADN trên kết quả điện di sản phẩm PCR Để thuận tiện cho vi c đánh giá, chúng tôi đa ra quy ớc đánh giá kết quả nh sau: Tính chất băng ADN trên thạch điện di Không có băng ADN Băng ADN mờ hoặc chấm hạt thành hàng Băng ADN nhỏ hoặc vừa, nhìn rõ Băng ADN lớn, đậm nhìn rất rõ Đánh giá kết quả (-) (+) (++) (+++) 2.3.4.2 Định lợng ADN của vi khuẩn tách đợc từ mẫu phân. .. Kiểm tra độ thuần của các chủng E coli bằng cách cấy trên môi trờng SMAC Độ thuần của chủng đợc đánh giá bằng hình thái khuẩn lạc, hình thể và tính chất bắt màu của vi khuẩn trên tiêu bản nhuộm Gram [4] * Kiểm tra các chủng E coli bằng phản ứng PCR đơn mồi - Tiến hành tách chiết ADN từ vi khuẩn qua cấy phân (Theo quy trình của Vi n Karolinska- Thụy Điển) [23] + Dùng que cấy lấy vi khuẩn từ đĩa môi trờng... (tơng đơng với 109 vi khuẩn/ ml), sau đó trộn từng huyền dịch với 200 mg phân đã đợc xác định không có E coli gây tiêu chảy Tách chiết ADN theo qui trình hoàn thiện - Mỗi thử nghiệm cho một chủng đợc lặp lại 10 lần - Dung dịch ADN tách chiết từ các chủng DEC đợc định lợng bằng quang phổ kế Tính nồng độ ADN trung bình sau khi tách chiết Bảng 3.14 Kết quả đo nồng độ ADN của các lần tách chiết Mẫu số 1 2... nghiên cứu của mình, Nguyễn Vũ Trung và cộng sự đã tối u hoá hệ thống PCR đa mồi xác định E coli gây tiêu chảy, sử dụng ADN tách từ khuẩn lạc [30] Điểm khác nhau cơ bản giữa qui trình xác định DEC trong nghiên cứu của chúng tôi so với nghiên cứu của Nguyễn Vũ Trung, là ADN đợc sử dụng cho phản ứng PCR Nghiên cứu của chúng tôi sử dụng ADN tách chiết trực tiếp từ phân 18 Nồng độ và độ tinh sạch của ADN phụ... Bớc 7: Ly tâm 12000 vòng/phút trong 20 phút, loại bỏ cặn Nớc nổi chứa ADN dùng làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR 23 3.3.3 Hoàn thiện qui trình Để hoàn thiện qui trình ly tâm và tách chiết ADN trực tiếp từ phân của EAEC, chúng tôi tiến hành lặp lại 1 4 lần các bớc 2, 3, 5 của qui trình trên Cụ thể là 84 lần tách chiết ADN trực tiếp từ phân theo sơ đồ 1, gồm: - 1 đến 4 lần ly tâm với tốc độ 1000 vòng trong... với các cặp mồi đặc hiệu cho từng DEC (Phần 2.3.1) - Chọn 10 mẫu phân có kết quả âm tính sau 3 lần chạy PCR liên tiếp Đây là 10 mẫu phân đợc coi là không có E coli gây tiêu chảy - Trộn đều các mẫu phân này, chia nhỏ thành các phần 200mg Bảo quản trong tủ 200C - Sử dụng các mẫu phân này trong quá trình: + Phát triển và hoàn thiện qui trình tách chiết ADN của E coli trực tiếp từ phân + Tối u hoá hệ... chloroform của Vi n quân y Mỹ (AFRIMS) [38] Qui trình cụ thể cũng khá phức tạp Hiện nay trên thị trờng có một số bộ kit thơng phẩm nh bộ sinh phẩm QIAamp DNA Stool Mini Kit của hãng QIAGEN [34] Trong bộ kit này để tách chiết ADN của vi khuẩn trực tiếp từ phân, các nhà sản xuất đã đa ra qui trình gồm có các bớc sau: - Ly giải 200mg (hoặc 2ml) mẫu phân trong 1,4ml dung dịch ASL Tế bào vi khuẩn và những... 4000rpm 4 lần 4000rpm Sơ đồ 1: Hoàn thiện qui trình ly tâm và tách chiết ADN trực tiếp từ phân 25 Bảng 3.6 Kết quả hoàn thiện qui trình tách chiết ADN với 1 lần ly tâm 1000 vòng/phút trong 10 phút (số trung bình của 3 lần thực hiện) 2000v/phút x 10 phút Ly tâm 1 lần 2 lần 3 lần 4 lần ADN g/ml Độ tinh sạch ADN g/ml Độ tinh sạch ADN g/ml Độ tinh sạch ADN g/ml Độ tinh sạch 4000v/phút x 10 phút và rửa 1 lần... kết quả PCR, chúng tôi đã thay đổi qui trình tách chiết ADN của EAEC trực tiếp từ phân nh sau: - Bớc 1: 200 mg phân đợc hoà với 1ml huyền dịch vi khuẩn có độ đục Macfarland 4 (tơng đơng với 109 vi khuẩn /ml), và 2ml nớc cất, trộn đều trên máy lắc - Bớc 2: Ly tâm huyền dịch phân ở bớc 1 với tốc độ 1000 vòng/phút trong 10 phút cho lắng các thành phần có kích thớc lớn Lấy nớc nổi - Bớc 3: Nớc nổi từ bớc . ADN của vi khuẩn trực tiếp từ phân& quot; với 2 mục tiêu sau: 1. Phát triển qui trình tách chiết ADN của E. coli gây tiêu chảy trực tiếp từ phân. 2. Đánh giá hiệu quả tách chiết ADN trực tiếp. hớng dẫn của bộ sinh phẩm Epicentre, Canada (Phần 2.3.1). 2.3.4. Đánh giá hiệu quả tách chiết ADN trực tiếp từ phân 2.3.4.1. Đánh giá kết quả PCR Hiệu quả tách chiết ADN đợc đánh giá dựa vào. này để tách chiết ADN của vi khuẩn trực tiếp từ phân, các nhà sản xuất đã đa ra qui trình gồm có các bớc sau: - Ly giải 200mg (hoặc 2ml) mẫu phân trong 1,4ml dung dịch ASL. Tế bào vi khuẩn