1 9 : Marker 3: 0,5 μg 5: 0 ng7: 00 pg9: pg
4.1. Phát triển qui trình tách chiết ADN của DEC trực tiếp từ phân
E. coli sống bình th−ờng ở ruột ng−ời và nhiều động vật khác nhau, nhiều nhất trong ruột già (vùng hồi manh tràng). Vi khuẩn theo phân ra ngoài, do đó th−ờng thấy chúng hiện diện trong đất, n−ớc và không khí [3]. Tuy nhiên, một số chủng E. coli có những yếu tố độc lực đặc biệt giúp chúng có khả năng gây các bệnh lý khác nhau. Vào những năm 40 của thế kỷ tr−ớc ng−ời ta xác định đ−ợc khả năng nhiễm trùng đ−ờng tiêu hoá, gây tiêu chảy của E. coli. Đó là những chủng E. coli gây tiêu chảy [2].
Dựa vào kháng nguyên O, kháng nguyên H và kháng nguyên K E. coli
đ−ợc phân thành 700 týp huyết thanh khác nhau.
Dựa trên đặc điểm lâm sàng của bệnh tiêu chảy, dịch tễ học, týp huyết thanh và sự có mặt của các yếu tố độc lực, DEC đ−ợc chia làm 5 nhóm chính: + E. coli bám dính kết tập ở đ−ờng ruột (enteroaggregative E. coli - EAEC) + E. coli gây chảy máu đ−ờng ruột (enterohaemorrhagic E. coli - EHEC) + E. coli xâm nhập đ−ờng ruột (enteroinvasive E. coli - EIEC)
+ E. coli ‘‘gây bệnh lý đ−ờng ruột’’ (enteropathogenic E. coli - EPEC) + E. coli sinh độc tố ruột (enterotoxigenic E. coli - ETEC) [28]
Trong chẩn đoán bệnh tiêu chảy do DEC, nếu chỉ dựa vào các triệu chứng lâm sàng sẽ thiếu tính chính xác, vì những bệnh cảnh lâm sàng của tiêu chảy do DEC không đặc hiệu. Xét nghiệm vi sinh tìm sự có mặt các gen độc lực của DEC trong phân, là tiêu chuẩn quyết định trong việc xác định nguyên nhân gây bệnh [16, 17, 20].
Có rất nhiều các ph−ơng pháp khác nhau để xác định E. coli gây tiêu chảy. Ngay từ những năm 1940, ng−ời ta đã sử dụng ph−ơng pháp nuôi cấy,
phân lập và định týp huyết thanh để xác định vi khuẩn này [8]. Tuy nhiên, giá trị của ph−ơng pháp rất hạn chế do nhiều nguyên nhân:
- Ph−ơng pháp nuôi cấy phân lập có độ nhạy thấp do phụ thuộc vào quá trình lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển mẫu phân. Mặt khác vi khuẩn có thể bị ức chế không mọc trên môi tr−ờng nuôi cấy khi đã sử dụng kháng sinh [11, 24].
- Việc nuôi cấy phân lập DEC cho đến nay vẫn ch−a đ−ợc th−ờng qui hoá trong các phòng xét nghiệm vi sinh, bởi lẽ các nhóm huyết thanh gây bệnh của chúng ch−a đ−ợc xác định đầy đủ, đồng thời các kháng huyết thanh mẫu cũng không có sẵn trên thị tr−ờng [8].
- Ngay cả khi xác định đ−ợc týp huyết thanh, việc khẳng định căn nguyên cũng ch−a đủ cơ sở khoa học, vì đó chỉ là dấu hiệu gián tiếp ch−a phản ánh đ−ợc bản chất của cơ chế gây bệnh. Cho đến nay, hầu nh− vẫn ch−a có dấu ấn đặc tr−ng nào dựa trên tính chất sinh vật hoá học cũng nh− kháng nguyên có thể dùng để phân biệt các DEC với các chủng E. coli thuộc vi hệ bình th−ờng. Thêm nữa, cũng không có dấu hiệu đặc tr−ng nào để phân biệt các chủng E. coli gây nên các bệnh cảnh lâm sàng khác nhau, do các cơ chế gây bệnh khác nhau [31]. Ví dụ, bệnh cảnh lâm sàng do ETEC (tiêu chảy phân toàn n−ớc không có máu) và EIEC (tiêu chảy phân nhầy mũi) hoàn toàn khác nhau, nh−ng có thể chung một týp huyết thanh gây ra: O124: H40, O167: H9.
- Thời gian nuôi cấy và xác định vi khuẩn ít nhất từ 24 đến 72 giờ.
Sau này các ph−ơng pháp xác định khác nh− ELISA, thử độc tính trên nuôi cấy tế bào, các tính chất sinh hoá, sự ly giải bởi phage…, đã đ−ợc áp dụng. Song, chúng cũng đều là các ph−ơng pháp gián tiếp và đòi hỏi các kỹ thuật phức tạp, nên ít đ−ợc ứng dụng trong xác định - phân loại các DEC. Do vậy, sự phân bố của các DEC ch−a đ−ợc nghiên cứu một cách hoàn chỉnh tại các n−ớc mà bệnh tiêu chảy còn rất phổ biến nh− Việt Nam. Điều này dẫn đến tình hình l−u hành của DEC cũng nh− các ph−ơng pháp phòng và điều trị bệnh, ch−a đ−ợc đánh giá và thực hiện một cách đầy đủ tại các cơ sở y tế và cả ở cộng đồng [8].
Từ những năm đầu thập kỷ 90 đến nay, thông qua việc phát hiện các đoạn gen qui định các yếu tố độc lực liên quan đến các cơ chế gây bệnh khác nhau,
ph−ơng pháp sử dụng mẫu dò acid nucleic hay còn gọi là’’lai ADN’’ và PCR ngày càng đ−ợc sử dụng rộng rãi, thay thế các ph−ơng pháp đề cập trên. Vì ph−ơng pháp sử dụng mẫu dò acid nucleic và PCR cho những thông tin trực tiếp nói lên cơ chế gây bệnh của chúng [18, 19, 42].
Ph−ơng pháp dùng mẫu dò ADN có thể xác định một cách nhanh chóng các vi sinh vật gây bệnh. Song ph−ơng pháp này cũng có khá nhiều nh−ợc điểm. Ng−ời ta th−ờng phải sử dụng đoạn ADN dò có gắn chất đồng vị phóng xạ hoặc mẫu dò gắn huỳnh quang. Bên cạnh đó, độ nhạy của các ph−ơng pháp này thấp, thao tác phức tạp và đòi hỏi một số l−ợng lớn vi sinh vật trong bệnh phẩm mới phát hiện đ−ợc [1, 8]. Do vậy, ph−ơng pháp ”lai ADN” ngày càng ít đ−ợc dùng.
Các nghiên cứu gần đây cho thấy, kỹ thuật PCR đa mồi phối hợp với nuôi cấy phân lập th−ờng đ−ợc dùng để phát hiện các chủng E. coli có khả năng gây tiêu chảy từ các bệnh phẩm lâm sàng. Kỹ thuật này cho kết quả với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, nên đã đ−ợc ứng dụng ngày càng rộng rãi ở nhiều n−ớc trên thế giới. Tuy nhiên để thực hiện kỹ thuật, trong qui trình cần ít nhất 18-24 giờ cho vi khuẩn mọc sau khi cấy bệnh phẩm trên môi tr−ờng đặc. Tiếp đến mới thực hiện phản ứng PCR. Do vậy, trong hầu hết các tr−ờng hợp tiêu chảy, việc xác định căn nguyên và quyết định ph−ơng h−ớng điều trị gặp rất nhiều khó khăn. Thêm vào đó, trên lâm sàng nhiều bệnh lý tiêu chảy tiến triển rất nhanh, khiến việc xác định sớm căn nguyên gây tiêu chảy có ý nghĩa rất quan trọng. Vì thế,
phát triển kỹ thuật PCR nhằm xác định trực tiếp các DEC từ bệnh phẩm phân là vấn đề cấp thiết. Nó không những giải quyết việc chẩn đoán sớm các DEC và còn là tiền đề để phát triển kỹ thuật PCR trong xác định trực tiếp các căn nguyên khác gây tiêu chảy [36, 40].
Tuy nhiên, quá trình khuyếch đại các ADN tách chiết trực tiếp từ bệnh phẩm phân, bị hạn chế rất nhiều bởi sự có mặt của một số chất ức chế PCR nh−: sắc tố mật, muối mật, polysaccharid, một số chất ch−a biết…
Các chất này với một số l−ợng đủ lớn có thể ức chế phản ứng PCR (hoặc với cặp mồi đặc hiệu cho đoạn ADN cần tìm trong phân, hoặc ức chế Taq polymerase gây nên hiện t−ợng âm tính giả) làm giảm độ nhạy và độ đặc hiệu
của kỹ thuật. Chính vì vậy, việc loại bỏ các chất này hoặc làm giảm đáng kể chúng, có ý nghĩa quyết định sự thành công của kỹ thuật. Hay nói cách khác, tách chiết và tinh sạch hịêu quả ADN trực tiếp từ bệnh phẩm, là chìa khoá đối với kỹ thuật PCR đa mồi xác định trực tiếp DEC từ phân.
Theo ph−ơng pháp cổ điển, ADN đ−ợc tách chiết từ bệnh phẩm phân bằng cách làm sạch, phá hủy protein và sau đó kết tủa bằng ethanol [8, 36, 39]. Sau đó, ng−ời ta dùng ph−ơng pháp sắc ký lỏng cao áp [8]. Gần đây, ng−ời ta sử dụng ph−ơng pháp dùng hạt bi thủy tinh hoặc bi silic và dung dịch chaotropic, qua các b−ớc để tách chiết ADN trực tiếp từ bệnh phẩm phân, ph−ơng pháp này có độ nhạy cao [8, 21, 36, 39]... Song, các ph−ơng pháp này hoặc là quá phức tạp, hoặc là quá đắt, hoặc ADN tách chiết đ−ợc quá ít hay không đủ tinh sạch dẫn đến ức chế phản ứng PCR hoặc PCR cho kết quả âm tính.
Vì thế, phát triển một ph−ơng pháp tách chiết ADN trực tiếp từ phân đơn giản- nhanh- hiệu quả- ít tốn kém sẽ có ý nghĩa vô cùng quan trọng, nhất là trong hoàn cảnh ở Việt Nam hiện nay. Mặt khác cùng với việc phát triển ph−ơng pháp này, kỹ thuật PCR đa mồi mới thực sự có ý nghĩa trong việc chẩn đoán nhanh, chính xác các chủng E. coli có khả năng gây tiêu chảy.
Nhìn chung, các chất trong phân có thể đ−ợc chia làm hai loại: các chất hữu hình và các chất hoà tan. Tham khảo một số tài liệu và công trình nghiên cứu tr−ớc đây [23, 27, 44], chúng tôi nhận thấy rằng để tách chiết ADN của vi khuẩn từ phân cần phải thực hiện một số b−ớc sau:
+ Sau khi tiến hành đồng nhất mẫu phân, việc loại bỏ các chất hữu hình có kích th−ớc lớn có thể đ−ợc thực hiện bằng cách ly tâm với tốc độ thấp.
+ Sau đó ly tâm tiếp với tốc độ cao hơn để gạn lấy vi khuẩn và loại bỏ các chất hoà tan.
+ Cuối cùng là dùng nhiệt để phá vỡ màng tế bào vi khuẩn thu đ−ợc, giải phóng ADN vào n−ớc nổi.
Với ý t−ởng nh− vậy và theo một số nghiên cứu khác b−ớc đầu chúng tôi thiết kế một qui trình tách chiết với trình tự nh− sau:
+ B−ớc 1: 200 mg phân (để dễ dàng so sánh với bộ kit th−ơng phẩm) đ−ợc hoà vào huyền dịch vi khuẩn có nồng độ Macfarland 4 (t−ơng đ−ơng với 109 vi khuẩn/ml).
+ B−ớc 2: Ly tâm huyền dịch phân ở b−ớc 1 với tốc độ 1000 vòng/phút trong 5 phút. Lấy n−ớc nổi.
+ B−ớc 3: N−ớc nổi từ b−ớc 2 đ−ợc tiếp tục ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút. Lấy n−ớc nổi.
+ B−ớc 4: N−ớc nổi từ b−ớc 3 tiếp tục đ−ợc ly tâm với tốc độ 12000 vòng/ phút trong 10 phút. Lấy cặn.
+ B−ớc 5: Hoà cặn sau khi thu đ−ợc vào 300 μl n−ớc cất, trộn đều. Đun cách thuỷ 1000C trong 20 phút. Ly tâm ở 12000 vòng/phút trong 15 phút. Phần n−ớc nổi chứa ADN, dùng làm ADN khuôn mẫu cho phản ứng PCR.
Đầu tiên, chúng tôi chọn chủng EAEC, là loại E. coli gây tiêu chảy có thể gặp trong phân với tỷ lệ cao nhất trong số 5 loại E. coli gây tiêu chảy, để thực hiện qui trình. Tất cả các dung dịch n−ớc nổi chứa ADN trong quá trình thử nghiệm đều đ−ợc chạy phản ứng PCR đơn mồi xác định EAEC. Kết quả ở Bảng 3.5 cho thấy, với qui trình thiết kế ban đầu, phần lớn kết quả PCR qua các lần thử nghiệm đều âm tính.
Sau nhiều lần thử nghiệm bằng cách thay đổi tốc độ, thời gian và số lần ly tâm, chúng tôi rút ra đ−ợc các điểm sau:
1/ L−ợng n−ớc cất tối thiểu phải là 3ml, mới đủ để hoà tan hết 200mg phân và giúp cho các b−ớc ly tâm sau này đ−ợc thực hiện dễ dàng hơn.
2/ ở tốc độ ly tâm thấp 1000 vòng/phút trong 10 phút, phần lớn các chất cặn, bã có kích cỡ lớn trong phân sẽ bị lắng xuống, nh−ng ch−a đủ để lắng vi khuẩn. 3/ Ly tâm tiếp với tốc độ 2000 vòng/phút trong 10 phút sẽ có hiệu quả cao khi loại bỏ thêm các chất hữu hình có kích th−ớc lớn hơn vi khuẩn trong huyền dịch phân. Phần n−ớc nổi thu đ−ợc lúc này sẽ chứa các thành phần có kích th−ớc nhỏ hơn hoặc t−ơng đ−ơng với vi khuẩn, và còn có nhiều các chất hoà tan có thể ức chế phản ứng PCR.
4/ Lợi dụng tính chất bị lắng cặn của vi khuẩn khi ly tâm ở tốc độ trên 2500 vòng/phút, khi tiến hành ly tâm tiếp với tốc độ 4000 vòng/phút trong 10 phút, chúng tôi sẽ thu đ−ợc vi khuẩn trong phần cặn lắng. Sau đó rửa cặn, các chất hoà tan sẽ bị loại bỏ cùng với n−ớc nổi trong quá trình rửa.
5/ Cặn vi khuẩn thu đ−ợc sẽ đ−ợc đun cách thuỷ 1000C trong 20 phút. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút, lấy n−ớc nổi chứa ADN. Kết quả PCR của sản phẩm tách chiết lúc này đều d−ơng tính.
Vì vậy, chúng tôi đã thay đổi qui trình tách chiết ADN của EAEC trực tiếp từ phân. So với thiết kế ban đầu (ly tâm lấy cặn lắng vi khuẩn ở 1000 vòng/phút trong 5 phút, tiếp đến 3000 vòng/phút trong 10 phút, sau đó là 12000 vòng/phút trong 10 phút), qui trình đ−ợc hiệu chỉnh có một số điểm khác biệt nh− sau:
- L−ợng n−ớc cất tối −u để hoà tan hoàn toàn 200 mg phân là 3ml. Việc tăng l−ợng n−ớc cất từ 1ml (theo thiết kế ban đầu) lên 3ml, đã giúp cho quá trình ly tâm đạt kết quả tốt.
- Tốc độ và thời gian ly tâm lấy cặn lắng vi khuẩn: + 1000 vòng/phút trong 10 phút
+ Tiếp đến 2000 vòng/phút trong 10 phút + Sau đó là 4000 vòng/phút trong 10 phút.
Để có một qui trình tách chiết ADN của vi khuẩn trực tiếp từ phân có hiệu quả, vấn đề đặt ra là phải hoàn thiện sao cho thu đ−ợc kết quả tốt nhất. Đặc biệt, số lần lặp lại của các b−ớc để loại bỏ đ−ợc càng nhiều càng tốt các chất hoà tan có mặt trong phân có thể gây ức chế phản ứng PCR.
Để thực hiện điều này, chúng tôi tiến hành lặp lại các b−ớc ly tâm của qui trình đã hiệu chỉnh trên từ 1 đến 4 lần. Mục đích là lựa chọn qui trình nào cho kết quả PCR tốt nhất (+++), có nồng độ nồng độ ADN cao hơn 100 μg/ml, độ tinh sạch của ADN đạt 1,8- 2 và tốn ít thời gian nhất.
Sau nhiều lần thử nghiệm, kết quả từ Bảng 3.6; 3.8; 3.10, 3.12 cho thấy: khi ly tâm 1 đến 4 lần với tốc độ 1000 vòng/phút trong 10 phút, tiếp theo là 1 đến 4 lần ở tốc độ 2000 vòng/phút trong 10 phút và 1 đến 4 lần ở tốc độ 4000
vòng/phút trong 10 phút, nồng độ ADN và độ tinh sạch của ADN giảm dần theo số lần ly tâm. Càng ly tâm nhiều lần ở cả 2 tốc độ 2000 vòng/phút và 4000 vòng/phút, nồng độ ADN càng giảm 197,4; 188,7; 96,2 và 92,9μg/ml.
Trong tất cả những lần thử nghiệm này, chỉ với qui trình: 1 lần ly tâm 1000 vòng/phút trong 10 phút, tiếp theo là 2000 vòng/phút và 4000 vòng/phút, nồng độ ADN đạt cao nhất (gần 200μg/ml), độ tinh sạch của ADN tốt nhất A260/A280 = 1,8 và tốn ít thời gian nhất.
Mặt khác, lặp lại giai đoạn rửa sạch cặn vi khuẩn (đ−ợc thực hiện bằng cách hoà tan cặn trong n−ớc cất và ly tâm ở 4000 vòng/phút trong 5 phút) 1 đến 2 lần có tác dụng loại trừ thêm các chất hoà tan có khả năng ức chế phản ứng PCR. “Độ sạch” của quá trình này có thể đ−ợc đánh giá dựa vào việc quan sát màu của n−ớc nổi. Nếu n−ớc nổi không còn màu vàng, chứng tỏ cặn vi khuẩn đã sạch. Màu vàng của n−ớc nổi do các chất là sản phẩm chuyển hoá của bilirubin tạo thành, chúng có thể ức chế phản ứng PCR tạo kết quả âm tính giả.