1 9 : Marker 3: 0,5 μg 5: 0 ng7: 00 pg9: pg
4.2. Đánh giá hiệu quả tách chiết ADN trực tiếp từ phân
Kết quả từ các Bảng 3.7; 3.9; 3.11; 3.13 chứng tỏ rằng qui trình mà chúng tôi hiệu chỉnh, đã cải thiện kết quả của phản ứng PCR. Các sản phẩm ADN tách chiết đ−ợc, cho kết quả “d−ơng tính mạnh hơn” so với thiết kế ban đầu. Điều này có thể giải thích nh− sau: ở tốc độ 3000 vòng/phút theo qui trình ban đầu, một số vi khuẩn đã bị lắng, vì vậy việc bỏ cặn lấy n−ớc nổi ở b−ớc này có thể làm mất vi khuẩn, dẫn đến kết quả PCR d−ơng tính yếu hoặc âm tính.
Trong một số công trình nghiên cứu trên thế giới, để tách chiết ADN của vi khuẩn trực tiếp từ phân, các tác giả cũng đã đ−a ra nhiều qui trình khác nhau:
+ Sandrina và cộng sự đã sử dụng một qui trình mà ngoài việc ly tâm và rửa, còn sử dụng rất nhiều các hoá chất phức tạp, và hạt thuỷ tinh đặc biệt để gắn kết nhằm tách ADN ra khỏi hỗn hợp các chất cặn trong phân. Toàn bộ qui trình mất khoảng 70-90 phút [37]. So với qui trình của Sandrina, qui trình của chúng tôi tuy cần 90 -100 phút nh−ng đơn giản và chi phí thấp hơn rất nhiều.
+ Karam và cộng sự đã sử dụng kháng thể kháng lại E. coli trong bệnh phẩm phân để tách biệt vi khuẩn [8]. Qui trình này đỏi hỏi sinh phẩm đắt tiền và phức tạp.
+ Pathmanathan dùng một qui trình đơn giản hơn so với Sandrina và Karam [32]. Trong đó, huyền dịch phân đ−ợc làm phong phú ở 370C trong 6 giờ sau đó mới tách chiết ADN. Tuy nhiên, qui trình này đòi hỏi nhiều thời gian và cũng phức tạp hơn qui trình của chúng tôi.
ở trong n−ớc, trong nghiên cứu của mình Nguyễn Thị Thông [14] và cộng sự đã tách chiết ADN của vi khuẩn Shigella trực tiếp từ phân bằng ph−ơng pháp dùng phenol và chloroform của Viện quân y Mỹ (AFRIMS). Qui trình cụ thể cũng khá phức tạp nh− sau:
- 100 mg phân đ−ợc hoà trong 0,5 ml n−ớc muối sinh lý. Ly tâm với tốc độ 600 vòng/phút trong 3 phút. Lấy n−ớc nổi.
- Ly tâm tiếp 11000 vòng/phút trong 3 phút. Lấy cặn. - Thêm 50 μl dung dịch lysozyme, ủ 370C/30 phút. - Thêm 150 μl hỗn dịch proteinase K, ủ 500C/30 phút. - Thêm 300 μl dung dịch phenol bão hoà.
- Ly tâm với tốc độ 11000 vòng/phút trong 3 phút. Lấy n−ớc nổi. - Thêm 12 μl dung dịch acetat natri 3,3M.
- Thêm 330μl cồn tuyệt đối đã để lạnh, để ở nhiệt độ phòng 10 phút. - Ly tâm 1200 vòng/phút trong 15 phút.
- Lấy cặn.
- Thêm 300μl cồn 70% đã để lạnh để rửa cặn. - Ly tâm với tốc độ 11000 vòng/phút trong 10 phút. - Lấy cặn.
- Làm khô cặn bằng bình hút chân không trong 15 phút.
ở n−ớc ta, trên thực tế cho đến nay có rất ít nghiên cứu sử dụng PCR để chẩn đoán căn nguyên vi sinh vật nói chung và vi khuẩn nói riêng trực tiếp từ phân. Nguyên nhân chính là do ch−a có một qui trình tách chiết ADN trực tiếp từ phân hiệu quả, đơn giản, và ít tốn kém. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phát
triển và hoàn thiện đ−ợc một qui trình với thời gian thực hiện khoảng 90-100 phút và không đòi hỏi hoá chất cũng nh− trang thiết bị phức tạp.
Trong t−ơng lai, nếu có thể rút ngắn thời gian và thao tác hơn nữa, chắc chắn, qui trình sẽ có nhiều −u điểm hơn. Mặc dù vậy, chúng tôi thiết nghĩ rằng qui trình này rất có ý nghĩa trong việc chẩn đoán trực tiếp căn nguyên vi khuẩn từ phân bằng PCR thông qua việc tách chiết ADN trực tiếp từ phân.
Trong nghiên cứu tr−ớc đây, Nguyễn Vũ Trung và cộng sự đã tối −u hoá hệ thống PCR xác định E. coli gây tiêu chảy sử dụng ADN tách từ khuẩn lạc [30]. Nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng ADN tách chiết trực tiếp từ phân. Nh− vậy, điểm khác nhau cơ bản giữa hai nghiên cứu là ph−ơng pháp tách chiết ADN sử dụng cho phản ứng PCR.
Nồng độ và độ tinh sạch của ADN phụ thuộc rất nhiều vào cách tách chiết, chính vì vậy trong nghiên cứu này, tối −u hoá hệ thống PCR đa mồi thực chất là tối −u hoá nồng độ ADN tách chiết đ−ợc sử dụng cho phản ứng PCR.
Sử dụng các chủng chuẩn DEC trộn với 200 mg phân, sau đó tách chiết ADN theo qui trình đã hoàn thiện nói trên. Mỗi thử nghiệm cho một chủng DEC đ−ợc lặp lại 10 lần. Chúng tôi đã tính đ−ợc nồng độ ADN trung bình ban đầu sau tách chiết nh− sau:
- Đối với EAEC : 191,6 ng/μl - Đối với EIEC : 235,6 ng/μl - Đối với EHEC : 385,2 ng/μl - Đối với EPEC : 184,5 ng/μl - Đối với ETEC : 174,2 ng/μl
Theo qui trình PCR, l−ợng ADN khuôn mẫu dùng cho mỗi phản ứng PCR là 3μl. Do đó, l−ợng ADN khuôn cho một phản ứng PCR của từng chủng DEC nh− sau: - EAEC = 3μl x 91,6 ng/μl = 574,8 ng - EIEC = 3μl x 235,6 ng/μl = 706,8 ng - EHEC = 3μl x 85,2 ng/μl = 1155,6 ng - EPEC = 3μl x 84,5 ng/μl = 553,5 ng - ETEC = 3μl x 74,2 ng/μl = 522,6 ng
Theo một số tác giả [12, 25, 41] l−ợng ADN khuôn mẫu dùng cho một phản ứng PCR vào khoảng 100-500 ng đối với đoạn ADN mẫu từ nhiễm sắc
thể. Trong nghiên cứu này một số đoạn gen cần phát hiện của DEC nằm cả ở plasmid và nhiễm sắc thể. Vì vậy để tìm ra l−ợng DNA khuôn tối −u cho mỗi cặp mồi sử dụng, chúng tôi tiến hành PCR với các nồng độ khác nhau.
Kết quả cho thấy:
- ở nồng độ ADN khuôn ban đầu, phản ứng PCR đều cho kết quả d−ơng tính trên tất cả các gen đặc hiệu của DEC với độ lặp lại 100%.
- Với l−ợng ADN khuôn 500 ng, phản ứng PCR cũng đều cho kết quả d−ơng tính trên tất cả các gen đặc hiệu của DEC với độ lặp lại 100%.
- Với l−ợng ADN khuôn 100 ng, phản ứng PCR cho kết quả d−ơng tính trên tất cả các gen đặc hiệu của DEC với độ lặp lại 100%. Riêng đối với gen vt1 mức độ d−ơng tính yếu và độ lặp lại chỉ 60%.
- Với l−ợng ADN khuôn 10 ng chỉ có gen vt2, eaeA và ial cho kết quả PCR d−ơng tính.
- Với l−ợng ADN khuôn khác 1 ng , 100 pg, 10 pg và 1 pg các gen đặc hiệu của DEC đều cho kết quả âm tính.
Nh− vậy l−ợng ADN tối thiểu để có kết quả d−ơng tính là 100 ng cho một phản ứng.
Theo kết quả nghiên cứu, sau khi tách chiết trực tiếp từ phân, nồng độ ADN chúng tôi thu đ−ợc từ 174,2 ng/μl (ETEC) đến 385,2 ng/μl (EHEC). Các nồng độ này đều cao hơn 100 ng/μl, đã đủ cho yêu cầu của một phản ứng PCR để phát hiện những đoạn ADN cả trên nhiễm sắc thể và plasmid.
Theo qui trình PCR cần dùng 3 μl ADN khuôn, thì l−ợng ADN sử dụng cho một phản ứng sẽ từ 522,6 ng đến 1155,6 ng, là quá hoàn toàn đủ. Theo chúng tôi nếu chỉ sử dụng 1 μl ADN khuôn mẫu, thì phản ứng PCR vẫn có thể cho kết quả tốt. Tuy nhiên, do hạn chế về thời gian, và tuân thủ h−ớng dẫn của nhà sản xuất, chúng tôi đã không thử nghiệm với 1μl ADN khuôn.
Điều này nói lên rằng, qui trình tách chiết đơn giản, rẻ tiền, tốn ít thời gian mà chúng tôi đã phát triển, hoàn toàn đáp ứng đ−ợc yêu cầu cho phản ứng PCR. Mặt khác trong nghiên cứu này, đối với một số chủng DEC nh− EHEC,
EIEC 10 ng ADN vẫn cho kết quả PCR d−ơng tính. Hay có thể nói ADN thu đ−ợc qua quá trình tách chiết của chúng tôi, không những đủ về l−ợng mà còn đủ về độ tinh sạch, nó hoàn toàn trùng hợp với kết quả đo mật độ quang (A260/A280 = 1,8). Đây là điểm mấu chốt của mọi qui trình tách chiết ADN mà chúng tôi đạt đ−ợc.
Nh− vậy, qua b−ớc tối −unồng độ adn khuôn cho phản ứng PCR, chúng tôi thấy rằng, 1 μl dung dịch ADN sau khi tách chiết trực tiếp, là hoàn toàn đủ cho phản ứng PCR. Điều này không những giúp tiết kiệm l−ợng ADN tách chiết đ−ợc mà còn góp phần làm hạn chế một số chất ức chế phản ứng PCR, có thể có mặt trong dung dịch ADN khuôn.
Theo một số tác giả [34], phản ứng PCR có thể bị ức chế khi nồng độ ADN khuôn cho một phản ứng lớn hơn 1 àg. Tuy nhiên trong nghiên cứu này chúng tôi nhận thấy với nồng độ ADN khuôn là 1,16 àg, phản ứng PCR trên các gen ial- vt1- vt2 vẫn cho kết quả d−ơng tính. Chính vì lý do này, trong một số tr−ờng hợp khi l−ợng ADN tách chiết đ−ợc có nồng độ cao, thì việc sử dụng 1 μl dung dịch ADN khuôn là ‘’khá an toàn’’ cho phản ứng PCR.
Nghiên cứu này góp phần quan trọng vào việc xác định sớm các DEC ở bệnh nhân tiêu chảy, và là cơ sở cho các nghiên cứu sau này. Với mục tiêu phát triển những kỹ thuật có độ nhạy, độ đặc hiệu cao và có khả năng ứng dụng rộng rãi trong hoàn cảnh của Việt Nam, góp phần xác định sớm các căn nguyên tiêu chảy.
Kết luận
1. Phát triển qui trình tách chiết ADN của DEC trực tiếp từ phân
- Qui trình tách chiết ADN đã đ−ợc phát triển thành công. Qui trình gồm các b−ớc sau: