ứng dụng phương pháp phân tích dna góp phần vào việc phân loại một số loài gỗ quý thuộc chi dalbergia của việt nam

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT DƢƠNG VĂN TĂNG ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DNA GÓP PHẦN VÀO VIỆC PHÂN LOẠI MỘT SỐ LOÀI GỖ QUÝ THUỘC CHI DALBERGIA CỦA VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Hà Nội – 2010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Đề tài : ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DNA GÓP PHẦN VÀO VIỆC PHÂN LOẠI MỘT SỐ LOÀI GỖ QUÝ THUỘC CHI DALBERGIA CỦA VIỆT NAM Học viên: Dƣơng Văn Tăng Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 30 Ngƣời hƣớng dẫn: PGS. TS. Đinh Thị Phòng Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam Việ Lời cảm ơn Trƣớc tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Đinh Thị Phòng, Phòng Phân loại thực nghiệm và Đa dạng nguồn gen, Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam đã tận tình, hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận này. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến Ban Giám đốc Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong cả quá trình học tập, thực hiện nghiên cứu và hoàn thiện luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ của cơ sở đào tạo sau Đại học Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật đã tận tâm truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt khóa học. Nhân dịp này, tôi xin cảm ơn những chia sẻ, hỗ trợ nhiệt tình và các ý kiến đóng góp của TS. Nguyễn Minh Tâm, Ths. Trần Thị Việt Thanh và CN. Vũ Thị Thu Hiền cùng toàn thể cán bộ phòng Phân loại thực nghiệm và Đa dạng nguồn gen, Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam. Để hoàn thành bản luận văn này, tôi chân thành cảm ơn Ths. Nguyễn Quốc Bình, Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam đã cung cấp mẫu cho nghiên cứu và sự hỗ trợ kỹ thuật của Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học trong việc xác định trình tự DNA. Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và các đồng nghiệp đã luôn động viên, khích lệ và là chỗ dựa vững chắc cho tôi hoàn thành khóa luận này. Hà Nội, ngày 29 tháng 12 năm 2010 Học viên Dƣơng Văn Tăng LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chƣa đƣợc sử dụng công bố trong bất kỳ tài liệu nào. Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã đƣợc cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã đƣợc chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 29 tháng 12 năm 2010 Học viên Dƣơng Văn Tăng MỤC LỤC Lời cảm ơn Lời cam đoan Mục lục Danh mục các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình MỞ ĐẦU 1 Chƣơng I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Giới thiệu tổng quát về một số loài gỗ quý hiếm thuộc chi trắc (Dalbergia) 3 1.1.1. Vị trí phân loại 3 1.1.2. Một số đặc điểm sinh học chính và giá trị bảo tồn một số loài gỗ quý 4 1.1.2.1. Dalbergia assamica Benth 5 1.1.2.2. Dalbergia cochinchinensis Pierre 6 1.1.2.3. Dalbergia oliveri Gamble ex Prain 7 1.1.2.4. Dalbergia tonkinensis Prain 7 1.1.2.5. Dalbergia nigrescens Kurz 8 1.2. Giới thiệu một số phƣơng pháp phân loại thực vật 9 1.2.1. Phƣơng pháp hình thái học (phân loại học truyền thống) 9 1.2.2. Phƣơng pháp giải phẫu so sánh 10 1.2.3. Phƣơng pháp hoá học 10 1.2.4. Phƣơng pháp phân loại học phân tử 11 1.3. Hệ gen sử dụng trong nghiên cứu phân loại phân tử ở thực vật 13 1.3.1. Cấu trúc hệ gene lục lạp 13 1.3.2. Vùng ITS nhân 15 1.4. Một số thành tựu nghiên cứu về phân loại học phân tử 16 Chƣơng II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1. Vật liệu nghiên cứu 20 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 23 2.2.1. Phƣơng pháp tách chiết DNA và làm sạch DNA tổng số 23 2.2.2. Thiết kế cặp mồi 23 2.2.3. Nhân bản trình tự đích bằng kỹ thuật PCR 23 2.2.4. Thôi gel và tinh sạch sản phẩm PCR 24 2.2.5. Giải trình tự DNA 24 2.2.6. Phân tích số liệu 24 Chƣơng III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 3.1. Kết quả tách chiết DNA 25 3.2. Kết quả nhân bản trình tự DNA đích ở 01 vùng gen nhân và 03 vùng gen lục lạp 26 3.2.1. Kết quả nhân bản trình tự DNA với cặp mồi ITS1/ITS4 26 3.2.2. Kết quả nhân bản trình tự DNA với cặp mồi psbA - trnH 27 3.2.3. Kết quả nhân bản trình tự DNA với cặp mồi matK - matK 28 3.2.4. Kết quả nhân bản trình tự DNA với cặp mồi trnL - trnL 29 3.3. Kết quả giải mã trình tự 4 gen nghiên cứu 30 3.3.1. Kết quả xác định trình tự gen ITS nhân 30 3.3.2. Kết quả giải trình tự vùng psbA - trnH 33 3.3.3. Kết quả giải mã trình tự gen matK 35 3.3.4. Kết quả giải mã trình tự gen trnL 38 3.4. Kết quả thống kê đặc điểm DNA của bộ số liệu trình tự giữa 5 loài 40 3.4.1. Các vị trí nucleotide mang thông tin tiến hoá (parsimony) 40 3.4.2. So sánh sự biến đổi nucleotide giữa 4 vùng gen nghiên cứu của 5 loài gỗ quý thuộc chi Dalbergia 43 3.4.3. Khoảng cách di truyền giữa 5 loài nghiên cứu 44 3.4.4. Cây phát sinh chủng loại 48 3.5. Xác định nguồn gốc loài 50 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57 Kết luận 57 Kiến nghị 58 PHỤ LỤC 67 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AFLP Đa hình chiều dài các đoạn nhân chọn lọc (Amplified Fragment Length Polymorphism) Barcode Mã vạch bp Cặp bazơ (base pair) BTTNVN Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam CITES Công ƣớc về buôn bán quốc tế các loài động, thực vật hoang dã nguy cấp (Convention on International Trade in Endangered Species) cpDNA Axít Deoxyribonucleotide lục lạp (Choloroplast Deoxyribo Nucleotide Acid) cpSSR Các trình tự lặp lại đơn giản của lục lạp (Chloroplast Simple Sequence Repeat) DNA Axít Deoxyribonucleotide EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EN Nguy cấp (Endangered) Genbank Ngân hàng gen quốc tế ISSR Các trình tự lặp lại bên trong (Inter-Simple Sequence Repeat) ITS Internal Transcribed Spacer IUCN Hiệp hội bảo vệ thiên nhiên quốc tế (International Union for Conservation of Nature) MEGA Phần mềm phân tích di truyền tiến hoá phân tử (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) NCBI Trung tâm thông tin công nghệ sinh học quốc gia (Nationa Center for Biotechnology Information) NJ Neighbor Joining NTS Khoảng trống không đƣợc sao chép (Non Transcribed Spacer) OD Mật độ quan học (Optical Density) PCR Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction) psbA Gen mã hóa protein D1, enzyme tham gia quang hóa II RAPD Đa hình các đoạn nhân bản ngẫu nhiên (Randomly Amplified Polymorphic DNA) RNA Axít Ribonucleotide RFLP Đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn (Restriction Fragment Length Polymorphism) SSR Các đoạn lặp lại (Simple Sequence Repeat) tRNA RNA vận chuyển (transfer- RNA) trnF RNA vận chuyển Phenylalanine trnH RNA vận chuyển Histidine trnL RNA vận chuyển Leucine trnT RNA vận chuyển Threonine UV Ánh sáng tử ngoại (Ultraviolet) VQG Vƣờn quốc gia DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Danh sách và một số thông tin về mẫu vật nghiên cứu 20 Bảng 2.2. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 21 Bảng 2.3. Mã số của 50 trình tự nulcleotide gen trnL thuộc 36 loài trong Genbank sử dụng lập cây phân loại 22 Bảng 3.1. Một số thông số thống kê biến đổi nucleotide khi so sánh giữa 5 loài nghiên cứu 42 Bảng 3.2. Khoảng cách di truyền giữa 25 mẫu nghiên cứu của 5 loài gỗ quý 47 DANH MỤC CÁC HÌNH Hnh 1.1. Hệ gen lụ c lạ p của hoa Nhài Jasminum nudiflorum (Lee et al, 2007) 13 Hình 1.2. Sơ đồ vùng gen ITS 15 Hình 3.1. Kết quả kiểm tra DNA tổng số từ một số mẫu lá nghiên cứu trên gel agarose 0,9% 25 Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đƣợc của một số mẫu đại diện với cặp mồi ITS1 - ITS4 trên gel agarose 0,9% 27 Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đƣợc của một số mẫu đại diện với cặp mồi psbA - trnH trên gel agarose 0,9% 28 Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đƣợc của một số mẫu đại diện với cặp mồi matK - matK trên gel agarose 0,9% 29 Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đƣợc của một số mẫu đại diện với cặp mồi trnL - trnL trên gel agarose 0,9% 29 Hình 3.6. Kết quả so sánh trình tự nucleotide vùng ITS giải mã từ 25 mẫu nghiên cứu 33 Hình 3.7. Kết quả so sánh trình nucleotide vùng đệm psbA - trnH giải mã từ 25 mẫu nghiên cứu 35 Hình 3.8. Kết quả so sánh trình nucleotide gen matK giải mã từ 25 mẫu nghiên cứu 37 Hình 3.9. Kết quả so sánh trình nucleotide gen trnL giải mã từ 25 mẫu nghiên cứu 39 Hình 3.10. Mô hình 6 loại đột biến nucleotide 45 Hình 3.11. Cây phát sinh chủng loại của 5 loài Dalbergia nghiên cứu với 4 gen ITS, trnL, matK và psbA – trnH 50 Hình 3.12. Cây phát sinh chủng loại đƣợc xây dựng theo phƣơng pháp Neighbor – Joining của 5 loài nghiên cứu với 35 loài thực vật khác dựa trên phân tích trình tự gen trnL 52 Hình 3.13. Cây hình toả tròn của 5 loài nghiên cứu với 35 loài thực vật khác dựa trên phân tích trình tự gen trnL 54 [...]... dạng những loài gỗ quý thuộc chi Dalbergia, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu: Ứng dụng phương pháp phân tích DNA góp phần vào việc phân loại một số loài gỗ quý thuộc chi Dalbergia của Việt Nam với các mục tiêu và nội dung nghiên cứu sau: - Sử dụng hai vùng gen nhân và vùng gen lục lạp góp phần vào việc phân loại 5 loài gỗ quý thuộc chi Dalbergia đang bị đe doạ tuyệt chủng của Việt Nam - Góp phần đánh... bắt đầu nghiên cứu ở một vài cơ sở 1.2.4 Phƣơng pháp phân loại học phân tử Phân loại học phân tử là phƣơng pháp phân loại sử dụng sự khác biệt các cấu trúc phân tử để đạt đƣợc các thông tin về mối quan hệ tiến hoá giữa các loài Kết quả của một phân tích hệ thống phân tử đƣợc thể hiện bằng cây phát sinh loài Phƣơng pháp phân loại phân tử ra đời vào những năm 1960 với các nghiên cứu của Emile và công sự... làm cơ sở cho việc bảo tồn và phục hồi một số loài gỗ quý hiếm ở Việt Nam đồng thời giúp các nhà quản lý và cộng đồng các nhà khoa học hiểu biết sâu hơn về quan hệ họ hàng ở mức độ taxon và mức độ tiến hoá phân tử 2 Dương Văn Tăng Chƣơng I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu tổng quát về một số loài gỗ quý hiếm thuộc chi trắc (Dalbergia) 1.1.1 Vị trí phân loại Dalbergia là một chi lớn thuộc họ đậu (Fabaceae)... của chúng Hay nhóm tác giả của Đặng Tất Thế (2003-2006) cũng sử dụng các nhóm gen này để phân tích sự tiến hóa phân tử và phát sinh chủng loại của một số loài thú, bò sát quý hiếm của Việt Nam [3, 4] Nguyễn Thuý Hạnh (2006), Lê Thị Muội và cs (2005) đã dùng chỉ thị ISSR và cpSSR để nghiên cứu đa dạng di truyền một số loài chi họ Dầu và Lạc của Việt Nam [7, 11] Hay nhóm tác giả của Nguyễn Minh Tâm đã dùng... khác nhau, trong đó có 19 loài thuộc chi Dalbergia đã đƣợc lấy từ ngân hàng Genbank để sử dụng cho phân tích mối quan hệ di truyền với 5 loài trong nghiên cứu Mã hiệu và một số thông tin của gen trnL đƣợc trình bày trong bảng 2.3 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Phƣơng pháp tách chi t DNA và làm sạch DNA tổng số DNA tổng số đƣợc tách chi t từ mẫu lá hoặc mẫu gỗ theo phƣơng pháp CTAB đƣợc miêu tả bởi... chi Dalbergia còn có nhiều loài có giá trị bảo tồn nhƣ: Dalbergia baronii, Dalbergia brownei, Dalbergia cearensis, Dalbergia cochinchinensis, Dalbergia decipularis, Dalbergia ecastaphyllum, Dalbergia frutescens, Dalbergia louvelii, Dalbergia madagascariensis, Dalbergia melanoxylon, Dalbergia nigra, 4 Dương Văn Tăng Dalbergia oliveri, Dalbergia sissoo, Dalbergia stevensonii, Dalbergia tonkinensis, Dalbergia. .. MỞ ĐẦU Chi trắc (Dalbergia) gồm nhiều loài cây thân gỗ có kích thƣớc từ nhỏ đến trung bình, thuộc họ đậu (Febaceae) Đây là chi điển hình của rừng nhiệt đới với khoảng 300 loài Ở Việt Nam có khoảng 27 loài, phân bố rộng khắp ở các vùng rừng kín từ Bắc vào Nam [13] Hiện nay, nhiều loài cây gỗ quý thuộc chi Dalbergia đang bị khai thác cạn kiệt do có giá trị kinh tế và thƣơng mại cao nhƣ Cẩm lai (Dalbergia. .. thị DNA cho độ chính xác cao mà không lệ thuộc vào các yếu tố môi trƣờng Vì tính ƣu việt này, đến nay trong ngân hàng Genbank đã lƣu trữ hàng trăm trình tự DNA khác nhau đặc trƣng cho chi Dalbergia, đây là nguồn dữ liệu có giá trị để chúng ta có thể khai thác ứng dụng để nghiên cứu phân loại (Benedic et al., 2007; Juschum et al., 2007) [25, 37] Nhằm ứng dụng phƣơng pháp phân loại phân tử vào phân loại. .. các phân tử để xây dựng hệ thống phát sinh chủng loại, tuy nhiên mãi cho đến những thập kỷ gần đây, con ngƣời mới có khả năng tách chi t và xác định đƣợc cấu trúc phân tử của những chất này Sự ra đời của kỹ thuật giải trình tự DNA của Maxam – Gilbert (1977, 1980) và Singer (1977) [19] đã mở ra một ứng dụng to lớn cho phân loại học phân tử Hiện nay phân tích hay đƣợc sử dụng trong phân loại học phân. .. cũng nhƣ ở Việt Nam (Phillip, 1997) [52] Do có giá trị sử dụng và thƣơng mại lớn, nên nghiên cứu đa dạng di truyền đối với một số loài cây gỗ quý của chi Dalbergia sử dụng các chỉ thị RAPD, cpSSR, AFLP cũng đƣợc nhiều quốc gia quan tâm nghiên cứu Chẳng hạn, Olivarimbola và cộng sự (2004) [17] đã dựng mối quan hệ di truyền của 122 cá thể loài Dalbergia monticola của Madagascar bằng việc phân tích với . Nhằm ứng dụng phƣơng pháp phân loại phân tử vào phân loại và nhận dạng những loài gỗ quý thuộc chi Dalbergia, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu: Ứng dụng phương pháp phân tích DNA góp phần vào. NGUYÊN SINH VẬT DƢƠNG VĂN TĂNG ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DNA GÓP PHẦN VÀO VIỆC PHÂN LOẠI MỘT SỐ LOÀI GỖ QUÝ THUỘC CHI DALBERGIA CỦA VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC. NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Đề tài : ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DNA GÓP PHẦN VÀO VIỆC PHÂN LOẠI MỘT SỐ LOÀI GỖ QUÝ THUỘC CHI