Ngoài nước: trong những năm gần đây, kỹ thuật sinh học phân tử đang đƣợc
áp dụng rộng rãi, có hiệu quả trong nghiên cứu tiến hoá, phân loại và đa dạng di truyền quần thể sinh vật. Phƣơng pháp chủ yếu dựa trên kỹ thuật phân tích DNA. Các chỉ thị AFLP (đa hình các đoạn nhân chọn lọc), RFLP (đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn), RAPD (đa hình các đoạn đƣợc nhân bản ngẫu nhiên), SSR (DNA vệ tinh hay trình tự lặp lại đơn giản), cpSSR (trình tự lặp lại đơn giản genome lục lạp), gen mã hoá 18S rRNA,… hay đƣợc sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền, nhận dạng các đoạn DNA hoặc các trình tự đặc trƣng cho loài [8]. Với số lƣợng bản sao lớn trong hệ gen là điều kiện thuận lợi cho kỹ thuật PCR (phản ứng chuỗi polymerase) với các cặp mồi (primers) thích hợp.
Vì thế chỉ trong vài thập kỷ, cơ sở dữ liệu gen (Genbank, 2007) đã lƣu giữ trên 70 triệu trình tự DNA với gần 90 tỷ nucleotit. Đây là nguồn dữ liệu có giá trị trong sinh học bảo tồn (Conservation biology) vì bốn lý do chính là (1) số liệu về trình tự các nucleotit rất có giá trị trong việc xác định các đơn vị bảo tồn giúp cho đánh giá sắp xếp phân loại, nhất là bậc loài và dƣới loài; (2) số liệu trình tự nucleotit đảm bảo độ chính xác cao nên tạo cơ sở khoa học tốt nhất cho bảo tồn đa dạng di truyền, trong
nghiên cứu di truyền quần thể (population genetics), vì nó bộc lộ rõ các biến đổi di truyền ở trong và giữa các quần thể, giữa các cá thể, giữa cha mẹ và con cái...; (3) kết quả phân tích DNA cho phép xác định chính xác loài, quần thể cho đến tận cá thể từ các mẫu vật không còn nguyên vẹn mà vẫn xác định thấy hiện tƣợng tạp lai giữa các loài, các quần thể địa lý…; và (4) kết quả nghiên cứu DNA không bị ảnh hƣởng vào bất cứ yếu tố khách quan do môi trƣờng hay con ngƣời gây ra.
Vì các giá trị khoa học nêu trên, đến nay kỹ thuật sinh học phân tử đang là công cụ hỗ trợ đắc lực cho các nhà nghiên cứu trong việc phát hiện các loài mới, giải quyết các nghi ngờ về vị trí phân loại, đánh giá đầy đủ về tính đa dạng di truyền, quan hệ chủng loại và mức độ tiến hoá của nhiếu loài động thực vật và vi sinh vật (Avise, 1993) [19].Các kết quả nghiên cứu ở mức độ DNA đã và đang góp phần đánh giá tính đa dạng sinh học, định hƣớng khoa học cho việc bảo tồn và khai thác một cách hợp lý nguồn tài nguyên sinh vật trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam (Phillip, 1997) [52].
Do có giá trị sử dụng và thƣơng mại lớn, nên nghiên cứu đa dạng di truyền đối với một số loài cây gỗ quý của chi Dalbergia sử dụng các chỉ thị RAPD, cpSSR, AFLP... cũng đƣợc nhiều quốc gia quan tâm nghiên cứu. Chẳng hạn, Olivarimbola và cộng sự (2004) [17] đã dựng mối quan hệ di truyền của 122 cá thể loài Dalbergia monticola của Madagascar bằng việc phân tích với 60 chỉ thị RAPD và 03 chỉ thị cpSSR, kết quả nhận đƣợc cho thấy các quần thể cây ở vùng trung tâm phía Bắc có nguồn gốc từ vùng Holocene của phía Nam. Tƣơng tự, các nhóm tác giả ở Pháp, Ấn Độ, Brasil... cũng đã sử dụng các chỉ thị RAPD, SSR... để nghiên cứu mối quan hệ di truyền giữa các loài, các quần thể và xác định trình tự các đoạn gen đặc trƣng cho một số loài cây thân gỗ thuộc chi Dalbergia (Rout et al., 2003; Benedic et al., 2006; Subhash et al., 2004; Juchum et al., 2007) [26, 37, 56, 67]. Vì thế, riêng đối với chi Dalberrgia trong ngân hàng Genbank cũng đã lƣu dữ hàng trăm trình tự nucleotide đặc trƣng cho một số loài ở một số quốc gia. Đây là nguồn dữ liệu có giá trị để chúng tôi có thể khai thác ứng dụng cho nghiên cứu chi này của Việt Nam.
Trong nước: nhìn chung, các nghiên cứu về đa dạng di truyền phục vụ công tác
bảo tồn đa dạng sinh học và tái tạo nguồn gen đã đƣợc thế giới quan tâm và phát triển. Theo hƣớng này, các nhà nghiên cứu trong nƣớc cũng đã từng bƣớc tiếp cận. Tuy
nhiên, nghiên cứu xây dựng cơ sở dữ liệu DNA có tính hệ thống cao mới đƣợc thực hiện tại Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật cho một số loài động vật quý hiếm. Còn đối với thực vật thì hầu nhƣ chƣa có, hơn nữa trong thực tế, sự tồn tại phân bố của nhiều loài ở dạng biệt lập, nên chứa đựng tính đa dạng nguồn gen rất lớn mà chƣa đƣợc nghiên cứu.
Vài năm trở lại đây, nghiên cứu đa dạng DNA ở thực vật đã và đang đƣợc tiến hành nghiên cứu ở Viện Công nghệ sinh học, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, Trƣờng Đại học Lâm nghiệp và Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, nhƣng mới chỉ tập trung đƣợc vào vài đối tƣợng cây trồng (cây lạc, lúa, một số loài hoa lan, một số loài thuộc chi họ Dầu, Vạn tuế, Bách xanh và Giổi). Mặc dù các nghiên cứu mới chỉ tập trung vào việc đánh giá đa dạng di truyền quần thể nhƣng cũng rất có giá trị cho nghiên cứu bảo tồn, tiến hoá và tái tạo nguồn gen.
Gần đây, việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền, phân loại và nhận dạng mẫu sinh vật ở Việt Nam cũng đã đạt đƣợc nhiều kết quả có giá trị. Đối với một số loài động thực vật là nhóm nghiên cứu của Nông Văn Hải [8] đã dùng gen ty thể (18S rRNA) để nghiên cứu phả hệ và giám định DNA một số loài lan Hài, cây Bình vôi, chim (gà Lôi), cá (cá Vƣợc) và đã phát hiện ra mức độ tiến hóa của chúng. Hay nhóm tác giả của Đặng Tất Thế (2003-2006) cũng sử dụng các nhóm gen này để phân tích sự tiến hóa phân tử và phát sinh chủng loại của một số loài thú, bò sát quý hiếm của Việt Nam [3, 4]. Nguyễn Thuý Hạnh (2006), Lê Thị Muội và cs (2005) đã dùng chỉ thị ISSR và cpSSR để nghiên cứu đa dạng di truyền một số loài chi họ Dầu và Lạc của Việt Nam [7, 11]. Hay nhóm tác giả của Nguyễn Minh Tâm đã dùng các chỉ thị SSR để đánh giá đa dạng nguồn gen cây Vạn tuế của Việt Nam làm cơ sở cho công tác bảo tồn đa dạng di truyền [9]. Tuy nhiên nghiên cứu ứng dụng phƣơng pháp phân tích DNA góp phần vào việc phân loại mẫu thực vật đang còn rất ít. Đặc
biệt đối với nhóm cây rừng nói chung và loài gỗ quý có nguy cơ truyệt chủng nói riêng nên cần tập trung nghiên cứu có hệ thống.
Chƣơng II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU