Để thiết kế đƣợc cặp mồi có tính đặc hiệu cao và giảm thiểu khả năng bắt cặp không đặc hiệu. Chúng tôi đã khai thác dữ liệu trong ngân hàng dữ liệu gen NCBI để tìm ra tất cả các trình tự gen mã hoá cho trnL (tARN-Leu) lục lạp đối với chi Dalbergia. Sau đó sử dụng phần mềm Bioedit để so sánh, vùng bảo thủ nhất đƣợc sử dụng để thiết kế mồi. Cặp mồi đƣợc thiết kế dựa trên chƣơng trình DNAstar.
2.2.3. Nhân bản trình tự đích bằng kỹ thuật PCR
Một phản ứng PCR có thể tích 50µl bao gồm các thành phần: 23µl H2O deion; 5µl dung dịch đệm buffer 10X; 5µl MgCl2 25mM; 5µl dNTPs 2,5Mm; 2,5µl mồi xuôi (10pmol); 2,5µl mồi ngƣợc (10pmol); 2µl Taq polymerase (5U/µl); 5µl DNA. Phản ứng đƣợc thực hiện trên máy chu trình nhiệt model 9700 (GeneAmp PCR System 9700, Mỹ), sử dụng ống PCR thành mỏng dung tích 0,2ml.
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR cho các cặp mồi với giai đoạn đầu là 940
trong 3 phút, tiếp sau là 35 chu ky nối tiếp nhau với các bƣớc: biến tính 940C trong 50 giây, gắn mồi 51 đến 600
phản ứng ở 720
C trong 10 phút, giữ sản phẩm ở 4C. Sau khi kết thúc phản ứng, 5µ sản phẩm PCR mỗi ống sẽ đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 0,9% cùng với thang DNA chuẩn 1kb. Gel agarose đƣợc nhuộm ethidium bromide 15 phút và quan sát dƣới tia UV.
2.2.4. Thôi gel và tinh sạch sản phẩm PCR
Tinh sạch sản phẩm PCR là bƣớc quan trọng để thực hiện phản ứng giải trình tự. Qúa trình tinh sạch nhằm thu đƣợc sản phẩm đoạn gen mong muốn. Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch theo bộ kit QIAquick Gel Extraction của QIAGEN. Kiểm tra sản phẩm thu đƣợc trên gel agarose 0,9%.
2.2.5. Giải trình tự DNA
Trình tự DNA đƣợc xác định bằng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp theo hai chiều (mồi xuôi và mồi ngƣợc) trên máy đọc trình tự ABI PRIMS® 3100 Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems) tại phòng thí nghiệm Trọng điểm công nghệ gen – VCNSH.
2.2.6. Phân tích số liệu
Các trình tự gen thu đƣợc đƣợc chỉnh sửa và phân tích bằng phần mềm MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis), version 4.0 (Kumar et al., 2007) [49]. Khoảng cách di truyền giữa các cá thể trong loài và giữa các loài đƣợc xác định theo trình tự tổ hợp các gen. Cây phát sinh chủng loại giữa 5 loài đƣợc xây dựng theo phƣơng pháp Neighbor – Joining (NJ).
Chƣơng III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả tách chiết DNA
DNA tổng số của 25 mẫu lá và mẫu gỗ đại diện cho 5 loài đã đƣợc tách chiết thành công với chất lƣợng DNA cao (hình 3.1). Kết quả điện di kiểm tra DNA trên gel agarose 0,9% cho thấy DNA không bị gãy và tƣơng đối sạch. Kết quả đo OD cho thấy chỉ số OD260/OD280 của các mẫu luôn nằm trong khoảng 1,8 đến 2 (chỉ số cho biết dung dịch DNA có độ tinh khiết cao). Trong quá trình tách chiết DNA lá đƣợc nghiền mịn trong nitơ lỏng, ngoài chức năng làm dòn thành tế bào thì nhiệt độ thấp của nitơ lỏng còn kìm hãm hoạt động của các nuclease có trong tế bào. Nuclease là các enzyme phân cắt DNA, sự hoạt động của nuclease có thể làm giảm chất lƣợng DNA với sự xuất hiện nhiều đoạn đứt gẫy. Bƣớc rửa đƣợc thực hiện trƣớc khi bổ sung đệm chiết cũng rất quan trọng, bƣớc này có thể loại bỏ phần lớn các chất bẩn có trong tế bào. Với việc cải tiến ở bƣớc rửa ban đầu, chúng tôi thu đƣợc DNA có chất lƣợng tốt, đạt chất lƣợng cho nhân bản trình tự đích bằng kỹ thuật PCR mà không cần phải dùng tới bộ Kit tách chiết DNA.Trong nghiên cứu này,để đảm bảo kết quả giải trình tự đƣợc chính xác chúng tôi tiến hành tinh sạch DNA tổng số bằng bộ Kít tách chiết DNA (Genomic Purification Kit).
Hình 3.1. Kết quả kiểm tra DNA tổng số từ một số mẫu lá nghiên cứu trên gel agarose 0,9% (Giếng 1-3: D. assamica; giếng 4-6: D. cochinchinensis; giếng 7-9: D. negrescens; giếng 10-12: D. oliveri; giếng 13-15: D. tonkinensis)
Quy trình tách chiết DNA cũng đƣợc nghiên cứu trên các mẫu gỗ khô, DNA tổng số tách đƣợc từ các mẫu gỗ khô là rất thấp. Mặc dù không quan sát đƣợc băng điện di trên gel agarose 0,9%, tuy nhiên khi thực hiện phản ứng PCR vẫn diễn ra thành công. Kết quả này mở ra một triển vọng phát triển một phƣơng pháp giám định loài cho các khối gỗ thƣơng mại bằng kỹ thuật DNA barcoding.
3.2. Kết quả nhân bản trình tự DNA đích ở 01 vùng gen nhân và 03 vùng gen lục lạp
Tất cả các trình tự DNA đích bao gồm vùng ITS (Internal transcribed spacer) nằm trên gen mã hoá cho RNA ribosomse nhân, gen matK, gen trnL mã hoá RNA vận chuyển Leucine, khoảng trống psbA - trnH – thuộc hệ gen lục lạp đã đƣợc nhân bản thành công. Trong quá trình tối ƣu, theo lý thuyết các phản ứng PCR có nhiệt độ gắn mồi từ 550C trở lên đều cho phản ứng đặc hiệu, tuy nhiên do bộ gen thực vật rất lớn (466 megabase với bộ gen lúa, bộ gen ngƣời khoảng 320 megabase)[59] nên tất cả cặp mồi khi tiến hành gắn mồi ở 550C đều xuất hiện các băng phụ, hay phản ứng không đặc hiệu. Phản ứng chỉ đạt đƣợc tối ƣu và đặc hiệu ở nhiệt độ trên 580
C. Trên 4 vùng nucleotide giải mã, ngoài gen matK các vùng còn lại đều là các trình tự nucleotide không mã hoá cho protein. Vì vậy kích thƣớc của các băng có thể thay đổi giữa các nhóm do xuất hiện các đột biến thêm và mất nucleotide.
3.2.1. Kết quả nhân bản trình tự DNA với cặp mồi ITS1/ITS4
Vùng ITS đã đƣợc nhân bản thành công với cặp mồi ITS1/ITS4 ở nhiệt độ gắn mồi là 58oC cho tất cả các mẫu của loài D. oliveri, D. cochinchinensis, D. nigrescens,
D. tonkinensis và D. assamica. Hình 3.2 là kết quả đại diện cho một số mẫu nghiên cứu của 5 loài Dalbergia, sản phẩm PCR có kích thƣớc khoảng 700 bp (đúng nhƣ kích thƣớc lý thuyết dự đoán). Chất lƣợng của sản phẩm PCR đƣợc thể hiện khi điện di trên gel agarose 0,9% chỉ có một băng duy nhất, sáng đậm, đủ tiêu chuẩn cho tách đoạn gen nhân để giải mã trình tự.
Sự tồn tại hai vùng bảo thủ 18S và 26S là một thuận lợi cho việc thiết kế cặp mồi nhân bản vùng ITS. Có rất nhiều cặp mồi khác nhau đã đƣợc công bố, trong đó bao gồm cả những cặp mồi cho nhân bản riêng rẽ từng vùng ITS1 và ITS2. Với sự tồn
tại của hai vùng không mã hoá ITS1 và ITS2, các đột biến thêm bớt nucleotide có thể xảy ra làm thay đổi kích thƣớc của vùng ITS. Theo nghiên cứu của Ribeiro và cộng sự (2007) [57] chỉ ra rằng vùng ITS có kích thƣớc thay đổi từ 607bp – 641bp đối với các loài thuộc chi Dalbergia, hay Son và cộng sự (2010)[65] cho thấy vùng ITS của các loài thuộc chi Zanthoxylum có kích thƣớc khoảng 731 bp. Ngoài sự thay đổi kích thƣớc do đột biến trên vùng ITS, kích thƣớc của các sản phẩm PCR cũng thay đổi theo cặp mồi đƣợc sử dụng. Sản phẩm PCR của vùng ITS nhân đƣợc trong nghiên cứu của chúng tôi gồm một phần kích thƣớc vùng 18S và 26S, do vậy vùng gen nhân đƣợc sẽ có kích thƣớc lớn hơn kích thƣớc vùng ITS thực tế.
3.2.2. Kết quả nhân bản trình tự DNA với cặp mồi psbA - trnH
Vùng psbA – trnH đƣợc chứng minh là vùng dễ dàng thực hiện phản ứng PCR nhất đối với các loài thực vật nói chung (Shaw et al, 2005)[60]. Do một vùng không mã hoá nên kích thƣớc của vùng psbA - trnH cũng thay đổi khác nhau giữa các loài.
Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đƣợc của một số mẫu đại diện với cặp mồi ITS1 - ITS4 trên gel agarose 0,9% (M: marker phân tử 1kb; giếng 1: D. assamica; giếng 2: D.
cochinchinensis; giếng 3: D. nigrescens; giếng 4: D. oliveri và giếng 5: D.tonkinensis700bp )
Vùng này có kích thƣớc biến đổi trong một giới hạn rất lớn, từ 247bp đến 1221bp (Kress et al, 2005) [40]. Kết quả nhân bản vùng gen đích bằng cặp mồi psbA - trnH với 5 loài nghiên cứu đã thu đƣợc đoạn DNA có kích thƣớc khoảng 400 bp, sản phẩm PCR trên gel agarose 0,9 % chỉ cho một băng đặc hiệu và không xuất hiện các băng phụ (hình 3.3).
3.2.3. Kết quả nhân bản trình tự DNA với cặp mồi matK - matK
Sử dụng cặp mồi matK - matK do chúng tôi thiết kế đã nhân bản thành công gen
matK cho 5 loài nghiên cứu (hình 3.4). Gen matK có kích thƣớc đẩy đủ là 2450 bp, tuy nhiên trong nghiên cứu này cặp mồi đƣợc thiết kế cho nhân bản đoạn DNA chỉ có kích thƣớc 750 bp và nằm gần đầu 3’ của gen. Gen matK là một gen chức năng do vậy thƣờng không có các đột biến thêm bớt nucleotide xảy ra trên gen, nên kích thƣớc giữa các loài cũng tƣơng đối ổn định. Sản phẩm PCR nhân bản gen matK có kích thƣớc đúng nhƣ kích thƣớc lý thuyết dự đoán. Kết quả nhân bản gen matK đƣợc thực hiện tốt nhất ở nhiệt độ gắn mồi là 600
C.
Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đƣợc của một số mẫu đại diện với cặp mồi
psbA - trnH trên gel agarose 0,9% (M: marker phân tử 1kb; giếng 1: D. assamica; giếng 2: D. cochinchinensis; giếng 3: D. nigrescens;
giếng 4: D. oliveri và giếng 5: D.tonkinensis) 400bp
Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đƣợc của một số mẫu đại diện với cặp mồi
matK - matK trên gel agarose 0,9% (M:marker phân tử 1kb; giếng 1: D. assamica; giếng 2:
D. cochinchinensis; giếng 3: Dnigrescens;giếng 4: D. oliveri và giếng 5: D. tonkinensis)
3.2.4. Kết quả nhân bản trình tự DNA với cặp mồi trnL - trnL
Phản ứng nhân bản vùng gen trnL đƣợc thực hiện ở nhiệt độ tối ƣu là 580
C, trnL là gen mã hoá cho rRNA ribosome vận chuyển Leucine trong lục lạp. Kích thƣớc gen thay đổi từ 452bp – 528bp đối với một số loài trong họ đậu (Fabaceae) (Ribeiro, et al., 2007) [57]. Nhân bản gen trnL ở hình 3.5 đối với 5 mẫu đại diện cho 5 loài nghiên cứu.
Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đƣợc của một số mẫu đại diện với cặp mồi trnL - trnL trên gel agarose 0,9% M: marker phân tử 1kb; giếng 1: D. assamica; giếng 2: D. cochinchinensis; giếng 3: D. nigrescens;giếng 4: D. oliveri và giếng 5: D. tonkinensis)
750bp
Kết quả cho thấy, chỉ nhân đƣợc 1 phân đoạn đặc hiệu đúng với kích thƣớc dự đoán, đủ tiêu chuẩn cho nghiên cứu giải mã trình tự DNA.
3.3. Kết quả giải mã trình tự 4 gen nghiên cứu
Sản phẩm PCR sau khi đƣợc tinh sạch sử dụng làm DNA khuôn cho phản ứng PCR đọc trình tự. Quá trình xác định trình tự đƣợc thực hiện tại Viện CNSH trên máy ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Phản ứng đọc trình tự đƣợc thực hiện theo hai chiều bằng phƣơng pháp giải trình tự trực tiếp.
3.3.1. Kết quả xác định trình tự gen ITS nhân
Kết quả xác định trình tự vùng ITS nhân cho ảnh điện di đồ với các đỉnh huỳnh quang rõ nét, cƣờng độ mạnh và rõ ràng (kết quả không chỉ ra ở đây). Các trình tự thu đƣợc của 25 mẫu nghiên cứu đƣợc sắp xếp theo hàng (alignment) bởi phần mềm Bioedit (hình 3.6). Sau khi loại bỏ trình tự mồi và các nucleotide so le ở hai đầu, chúng tôi đã thu đƣợc trình tự nucleotide của các loài có độ dài nhƣ sau: 642 bp đối với D. assamica, 647 bp cho D. cochinchinensis, 644 bp với D. nigrescens, 644 bp với D. oliveri và D. tonkinensis là 643 bp. Sở dĩ có sự khác biệt về kích thƣớc giữa các loài là do có các đột biến thêm bớt nucleotde xảy ra trên hai vùng ITS1 và ITS2. Kết quả thống kê ở hình 3.6 đã chỉ ra 11 vị trí (16, 113, 117, 118, 175, 236-238, 429, 596 và 597) đột biến bởi chèn vào hay mất đi nucleotide khi so sánh giữa 5 loài nghiên cứu. Tại vị trí nucleotide thứ 16, loài D. oliveri chèn thêm nucleotide (A), 4 loài D. assamica, D. cochinchinensis, D. nigrescens và D. tonkinensis đã không có nucleotide (A). Hay tại vị trí 236 đến 238, loài D. cochinchinensis đã chèn thêm 3 nucleotide (ACA), 4 loài còn lại đã không xuất hiện các nucleotide.... Các vùng sai khác giữa các nucleotide khi so sánh 5 loài nghiên cứu đƣợc thể hiện trên hình 3.6.
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
D.ass.1 TtGTCGATGC CTCAA-TCCA GAGAGACCCG CGAACGCGTT CCACCACCGG GGACAGTCGG AGCTGCCTGG CAGCCCGCCT TCCCCAGAAG TCGGGACCGA D.ass.2 ... ...-.... ... ... ... ... ... ... ... ... D.ass.3 ... ...-.... ... ... ... ....G... ... ... ...C... ... D.ass.4 ... ...-.... ... ... ... ... ...C.. ... ...C... ... D.ass.5 ... ...-.... ... ... ... ... ... ... ...C... ... D.coc.1 ...A.. ....G-.... ... ... TT... ...A ...C...CA. .G... ...GT. ... D.coc.2 ...A.. ....G-.... ... ... TT... ...A ...C...CA. .G... ...GT. ... D.coc.3 ...A.. ....G-.... ... ... TT... ...A ...C...CA. .G... ...GT. ... D.coc.4 ...A.. ....G-.... ... ... TT... ...A ...C...CA. .G... ...GT. ... D.coc.5 ...A.. ....G-.... ... ... TT... ...A ...C...CA. .G... ...GT. ... D.nig.1 ...C... .C.G.-CA.. ... ... .G... ....G... ...c...c.. .G...C ...A.C. C...A.. D.nig.2 ...C... .C.G.-CA.. ... ... .G... ....G... ...c...C.. .G...C ...A.C. C...A.. D.nig.3 ...C... .C.G.-CA.. ... ... .G... ....G... ...C...C.. .G...C ...A.C. C...A.. D.nig.4 ...C... .C.G.-CA.. ... ... .G... ....G... ...c...C.. .G...C ...AGC. C...A.. D.nig.5 ...C... .C.G.-CA.. ... ... .G... ....G... ...c...C.. .G...C ...A.C. C...A.. D.oli.1 ... .C...A.... ... ... TT..T..G.. ...A ...C..TC.. .G..T... ...A.T. ...A... D.oli.2 ... .C...A.... ... ... TT..T..G.. ...A ...C..TCA. .G..T... ...A.T. ...A... D.oli.3 ... .C...A.... ... ... TT..T..G.. ...A ...C..TCA. .G..T... ...A.T. ...A... D.oli.4 ... .C...A.... ... ... TT..T..G.. ...A ...C..TCA. .G..T... ...A.T. ...A... D.oli.5 ... .C...A.... ... ... TT..T..G.. ...A ...C..TCA. .G..T... ...A.T. ...A... D.ton.1 ... ...-.... ... ..G..A.... T..A....C. ...A..A ...CA. ....T... ....G.A... ...G.. D.ton.2 ... ...-.... ... ..G..A.... T..A....C. ...A..A ...CA. ....T... ....G.A... ...G.. D.ton.3 ... ...-.... ... ..G..A.... T..A....C. ...A..A ...CA. ....T... ....G.A... ...G.. D.ton.4 ... ...-.... ... ..G..A.... T..A....C. ...A..A ...CT. ....T... ....G.A... ...G.. D.ton.5 ... ...-.... ... ..G..A.... T..A....C. ...A..A ...CA. ....T... ....G.A... ...G..
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
110 120 130 140 150 160 170 180 190 200
D.ass.1 GTCACGCCCC GG-CGG--TC TCGTCCCGGC GCAACAAC-A ACAAACCCCG GCGCGGAATG CGCCAAGGAA GCAA-CAATC GTAGAGCGTG CCCCGTCGAC D.ass.2 ... ..-...--.. ... ...-. ... ... ... ....-... ... ... D.ass.3 ... ..-...--.. ... ...-. ... ... ... ....-... ... ... D.ass.4 ... ..-...--.. ... ...-. ... ... ... ....-... ... ... D.ass.5 ... ..-...--.. ... ...-. ... ... ... ....-... ... ... D.coc.1 .C...T.. C.-...--.. ... ....T...-. ... ...A. ... ....A....T .C.CG...C. T... D.coc.2 .C...T.. C.-...--.. ... ....T...-. ... ...A. ... ....A....T .C.CG...C. T... D.coc.3 .C...T.. C.-...--.. ... ....T...-. ... ...A. ... ....A....T .C.CG...C. T... D.coc.4 .C...T.. C.-...--.. ... ....T...-. ... ...A. ... ....A....T .C.CG...C. T... D.coc.5 .C...T.. C.-...--.. ... ....T...-. ... ...A. ... ....A....T .C.CG...C. T... D.nig.1 .C.C..G... T.C..CGG.. C... ...-. ... ...C. ... ...G-... .C...C. ...G. D.nig.2 .C.C..G... T.C..CGG.. C... ...-. ... ...C. ... ...G-... .C...C. ...G. D.nig.3 .C.C..G... T.C..CGG.. C... ...-. ... ...C. ... ...G-... .C...C. ...G. D.nig.4 .C.C..G... T.C..CGG.. C... ...-. ... ...C. ... ...G-... .C...C. ...G. D.nig.5 .C.C..G... T.C..CGG.. C... ...-. ... ...C. ... ...G-... .C...C. ...G. D.oli.1 ...G...T.. T.-...--.. ... ....T...-. ... ...C. ... .T..-... ....G... ... D.oli.2 ...G...T.. T.-...--.. ... ....T...-. ... ...C. ... .T..-... ....G... ... D.oli.3 ...G...T.. T.-...--.. ... ....T...-. ... ...C. ... .T..-... ....G... ... D.oli.4 ...G...T.. T.-...--.. ... ....T...-. ... ...C. ... .T..-... ....G... ... D.oli.5 ...G...T.. T.-...--.. ... ....T...-. ... ...C. ... .T..-... ....G... ... D.ton.1 .C.G...-.. C.-...CC.. ... .A...C. ... ...A. ... T...-... .C...C. T...G. D.ton.2 .C.G...-.. C.-...CC.. ... .A...C. ... ...A. ... T...-... .C...C. T...G. D.ton.3 .C.G...-.. C.-...CC.. ... .A...C. ... ...A. ... T...-... .C...C. T...G. D.ton.4 .C.G...-.. C.-...CC.. ... .A...C. ... ...A. ... T...-... .C...C. T...G. D.ton.5 .C.G...-.. C.-...CC.. ... .A...C. ... ...A. ... T...-... .C...C. T...G.
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
210 220 230 240 250 260 270 280 290 300
D.ass.1 CCGGCAACGG TGCTCGTACG GGTGATGTCG CAACA---CT CGAGTCCAAA ACGACTCTCG GCAACGGATA TCTCGGCTCT TGCATCGATG AAGAACGTAG D.ass.2 ... ... ... ...---.. ... ... ... ... ... ...