tách chiết và chuyển hóa chlorophylla từ vi khuẩn cyano bacteria

Chlorophyll chuyển năng lượng ánh sáng thành năng lượng hóa học trong phân tử ATP, trong quá trình này xảy ra các phản ứng chuyển dịch electron phản ứng oxy hóa khử.. Chlorophyll và các

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

  

TRẦN THI ̣ HIỀN

TÁCH CHIẾT VÀ CHUYỂN HÓA CHLOROPHYLL A

TỪ VI KHUẨN CYANO BACTERIA

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2011

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

  

TRẦN THI ̣ HIỀN

TÁCH CHIẾT VÀ CHUYỂN HÓA CHLOROPHYLL A

TỪ VI KHUẨN CYANO BACTERIA

Chuyên ngành: Hoá hữu cơ Mã số: 60 44 27

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS Đoa ̀n Duy Tiên

Hà Nội - 2011

MỤC LỤC

CÁC KÍ HIỆU VIẾT TẮT TRONG BÀI LUẬN VĂN

DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ

BẢNG

HÌNH

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN 3

1.1 Cấu tạo và tính chất của hệ quang hợp 3

1.1.1 Cấu tạo và tính chất của hệ quang hợp ở thực vật và vi khuẩn 3

1.1.2 Chlorophyll 10

1.2 Giới thiệu về ngành vi khuẩn lam ( ngành cyanobacteria) 14

1.2.1 Sơ lược về vi khuẩn lam 14

1.2.2 Cấu tạo tế bào 16

1.2.3 Phân loại 16

1.2.4 Ý nghĩa thực tiễn 17

1.3 Tình hình nghiên cứu về chlorophyll a trong nước và quốc tế 18

1.4 Các dẫn xuất của chlorophyll a 19

1.5 Sinh tổng hợp chlorophyll a 20

1.5.1 Sinh tổng hợp axit 5-aminolevulinic 20

1.5.2 Sinh tổng hợp pyrol (porphobilinogen) 21

1.5.3 Quá trình đóng vòng của 4 vòng pyrol (tetrapyrol) 22

1.5.4 Đưa ion Mg2+ vào hệ thống vòng 24

1.6 Tổng hợp toàn phần chlorophyll a theo Woodward 25

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 27

2.1 Mục tiêu thực nghiệm 27

2.2 Xác định các tính chất vật lý 27

2.2.1 Sắc kí bản mỏng 27

2.2.2 Phổ hồng ngoại (IR) 27

2.2.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 27

2.2.4 Phổ khối (MS) 27

2.2.5 Phổ tử ngoại 27

2.3 Nội dung nghiên cứu 27

2.3.1 Nội dung 1 27

2.3.2 Nội dung 2 29

2.3.3 Nội dung 3 30

2.4 Xác định cấu trúc các sản phẩm bằng phổ hồng ngoại, tử ngại và khả kiến, phổ cộng hưởng từ hạt nhân và phổ khối 31

2.4.1 Cấu trúc của pheophytin a 31

2.4.2 Cấu trúc của metyl pheophobide a 32

2.4.3 Cấu trúc của chlorin e6 – trimetylester 33

CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Tách chiết và chuyển hoá chlorophyll a thành pheophytin a 34

3.2 Thực hiện phản ứng chuyển hoá chlorophyll a thành metyl pheophobide a 38

3.3 Chuyển hoá metyl pheophobide a thành chlorin – e6 trimetylester 42

CHƯƠNG 4 : KẾT LUẬN 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

CÁC KÍ HIỆU VIẾT TẮT TRONG BÀI LUẬN VĂN

ATP : Adenosin Triphotphat

NADP : Nicotinamit Adenin Dinucleotitphotphat LHC : Phức hợp thu nhận ánh sáng

DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ

BẢNG

Bảng 1.1: Thành phần của các chlorophyll khác nhau 11

Bảng 3.1: Bảng dữ liệu phổ 1H-NMR của pheophytin a 35

Bảng 3.2: Bảng dữ liệu phổ 1H-NMR của metyl pheophobide a 39

Bảng 3.3: Bảng dữ liệu phổ 1H-NMR của chlorin e6 - trimetylester 44

HÌNH Hình 1.1: Năng lượng bức xạ trong tổng hợp của các phân tử hữu cơ 3

Hình 1.2: Các hệ thống quang hợp 4

Hình 1.3: Hệ thống ăng ten của các vi khuẩn tía ……… 5

Hình 1 4: Hấp thụ ánh sáng của hệ thống ăng ten trong thực vật ……… 6

Hình 1.5: Caroten trong hệ quang hợp………….……… 6

Hình 1.6: Cấu trúc trung tâm phản ứng của vi khuẩn Rhodopseudomonas virdis 7

Hình 1.7: Chuỗi eletron vận chuyển của màng thylakoid 8

Hình 1.8: Cố định Cacbon C6 theo chu trình Calvin-Benson 9

Hình 1.9: Cố định cacbon theo chu trình C4 10

Hình 1.10: Công thức cấu tạo của chlorophyll a 11

Hình 1.11 Tế bào dị hình (*) ở Tảo Annabaena 15

Hình 1.12: Các hợp chất chlorophyll phổ biến trong tự nhiên 18

Hình 1.13: Các hoạt chất sử dụng để chữa trị ung thư bằng liệu pháp quang 20

Hình 1.14: Sinh tổng hợp axit 5-aminolevulinic từ glyxin và sucxinyl-CoA 21

Hình 1.15: Sinh tổng hợp axit 5-aminolevulinic 21

Hình 1.16: Quá trình tổng hợp vòng pyrol 22

Hình 1.17: Sự tạo thành tetrapyrol 22

Hình 1.18: Quá trình đóng vòng của tetrepyrol 23

Hình 1.19: Quá trình tạo thành protophyrin IX 23

Hình 1.20: Quá trình hình thành phân tử chlorophyll a[10,30,33] 24

Hình 1.21: Tổng hợp chlorophyll a theo Woodward 25

Hình 2.1: Chuyển hoá chlorophyll a thành pheophytin a 28

Hình 2.2: Chuyển hoá chlorophyll a thành metyl pheophobide a 29

Hình 2.3: Chuyển hoá trực tiếp thành metyl pheophobide a từ vi khuẩn lam 30

Hình 2.4: Chuyển hoá metyl pheophobide a thành chlorin e6- trimetylester 31

Hình 3.1: Phổ hồng ngoại của pheophytin a 36

Hình 3.2: Phổ UV – VIS của Pheophytin a 36

Hình 3.3: Phổ khối của pheophytin a 37

Hình 3.4: Phổ 1H-NMR của pheophytin a 37

Hình 3.5: Phổ hồng ngoại của metyl pheophobide a 40

Hình 3.6: Phổ UV – VIS của metyl pheophobide a 40

Hình 3.7: Phổ khối của metyl pheophobide a 41

Hình 3.8: Phổ 1 H – NMR của pheophobide a 41

Hình 3.9: Phổ UV – VIS của chlorin e6 - trimetylester 45

Hình 3.10: Phổ hồng ngoại của chlorin e6- trimetylester 45

Hình 3.11: Phổ khối của chlorin e6 – trimetylester 46

Hình 3.12: Phổ 1 H – NMR của chlorin e6 - trimetylester 46

MỞ ĐẦU

Từ lâu các nhà khoa học rất quan tâm tới việc chiết tách các sắc tố từ lá xanh của thực vật bậc cao Cách đây hơn 100 năm các nhà hóa học đã tách được chất màu xanh từ lá và gọi chúng là Chlorophyll Vào năm 1913, Richard Willstatter, nhà hóa học người Đức đã chỉ ra rằng tất cả các năng lượng sống đều nhờ mặt trời

và cây xanh có một cách nào đó để hấp thụ năng lượng này Tới năm 1919, ông đã giải thích được chức năng của hợp chất hấp thụ năng lượng mặt trời chính là Chlorophyll Thực vật bậc cao có lá xanh đã tự mình hấp thụ năng lượng bức xạ và chuyển hóa thành năng lượng dự trữ trong cơ thể

Chlorophyll giữ vai trò vô cùng quan trọng trong quá trình quang hợp, là chất hấp thụ năng lượng ánh sáng trong hệ quang hợp Chlorophyll chuyển năng lượng ánh sáng thành năng lượng hóa học trong phân tử ATP, trong quá trình này xảy ra các phản ứng chuyển dịch electron (phản ứng oxy hóa khử)

Chlorophyll và các dẫn xuất của chúng là một đối tượng nghiên cứu hấp dẫn

và trở thành một lĩnh vực phát triển rộng lớn và được các nhà khoa học quan tâm bao gồm các nghiên cứu về hệ thơm, khả năng hấp thụ ánh sáng, chuyển dời điện tích, tính chất phổ, sinh tổng hợp và các nghiên cứu y dược

Chlorophyll và các dẫn xuất của chúng có nhiều ứng dụng khác nhau trong y học và công nghiệp Trong y học, chlorophyll được dùng như một thành phần cơ bản trong khẩu phần ăn kiêng và thuốc chữa bệnh Chẳng hạn, Cu-chlorophyllin phòng chống ung thư từ thức ăn bị thiu mốc chứa hydrocacbon mạch vòng, aflatoxin Chlorophyll và các dẫn xuất còn được sử dụng như là chất nhạy sáng để tiêu diệt các tế bào ung thư và chống virus, chất chữa vết thương và khử mùi hôi Chlorophyll ức chế phát triển của vi khuẩn, kích thích việc phục hồi các mô đã

bị hư hại và ngăn cản tác hại của các chất gây ung thư Chlorophyll còn có lợi cho

hệ tiêu hóa và có tác dụng dưỡng da

Một số dẫn xuất chlorophyll có hoạt tính sinh học quí giá như tiêu diệt tế bào ung thư tủy, virus leukemia, u ác tính (malignant melanoma) theo cơ chế quang trị

liệu Chlorophyll còn có tác dụng giảm viêm khớp (arthritis), chữa trị u xơ, giảm mùi hôi, giảm đường máu của người bệnh cao tuổi

Chlorophyll là một nhóm các hợp chất đa dạng bao gồm chlorophyll (a, b, c, d,…), trong đó chlorophyll a phổ biến nhất trong tự nhiên, đó là chlorophyll trong

hệ quang hợp của thực vật bậc cao, tảo biển và vi khuẩn quang hợp Trong thực vật bậc cao hệ thống quang hợp có cấu tạo rất phức tạp và chứa nhiều loại chlorophyll khác nhau Quá trình tách các chlorophyll ra khỏi nhau rất khó khăn và phức tạp Trong các loại vi khuẩn quang hợp thì vi khuẩn lam có cấu tạo hệ quang hợp đơn

giản nên việc phân lập dễ dàng hơn Vì vậy tôi đã lựa chọn “ Tách chiết và chuyển

hoá chlorophyll a từ vi khuẩn cyano bacteria” làm đề tài cho luận văn cao học của

mình Mục tiêu của luận văn là tìm ra qui trình tách chiết chlorophyll a một cách hiệu quả ở qui mô phòng thí nghiệm và chuyển hóa chúng để thu được các hợp chất làm trung gian cho quá trình tổng hợp các hoạt chất chữa trị ung thư bằng liệu pháp quang, các chất màu thực phẩm, tổng hợp các hợp chất hấp thụ ánh sáng sử dụng cho pin mặt trời và các sensor

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN

1.1 Cấu tạo và tính chất của hệ quang hợp

1.1.1 Cấu tạo và tính chất của hệ quang hợp ở thực vật và vi khuẩn

Quang hợp là cơ sở năng lượng của sự sống trên trái đất Chlorophyll hấp thụ năng ánh sáng mặt trời và chuyển quang năng thành hóa năng bởi trung tâm phản ứng trong hệ quang hợp của vi khuẩn và thực vật dưới dạng NADPH và ATP được

sử dụng để tổng hợp cacbohydrat (hình 1.1)

Hình 1.1: Năng lượng bức xạ trong tổng hợp của các phân tử hữu cơ

Các chlorophyll hấp thụ và biến quang năng thành hoá năng với hiệu suất cao

Các hệ thống quang hợp (PS) (hình 1.2) được phân loại theo cấu trúc của trung tâm

phản ứng chia thành PSI của vi khuẩn lam, PSII của thực vật bậc cao và PS của vi khuẩn tía đều bao gồm bốn thành phần chính là ăng-ten thu sáng, trung tâm phản ứng, trung tâm chuyển điện tử và bộ máy cố định cacbon [3,5]

Hình 1.2: Các hệ thống quang hợp [28]

Trung tâm phản ứng của vi khuẩn tía gồm các tiểu đơn vị protein L và M liên kết với các sắc tố hoạt động và có đối xứng bậc hai Trung tâm phản ứng được bao quanh bởi hệ thống ăng ten thu sáng (LH1) Các electron được chuyển vào trung tâm phản ứng của một heme-binding cytochrome (cyt)

Trong PSII gồm protein D1 và D2 có cấu trúc và chức năng tương đồng với các tiểu đơn vị L và M của trung tâm phản ứng ở vi khuẩn Năng lượng ánh sáng được hấp thụ bởi LHCII và chuyển vào trung tâm phản ứng bởi protein-chlorophyll CP43 và CP47 Quá trình chuyển dời điện tích thực hiện bởi phức hợp của mangan

để ôxi hóa nước và giải phóng oxi vào khí quyển

Trong PS I, các protein PsaA và PsaB tạo thành một heterodimer giống PSII Mỗi PsaA và PsaB bao gồm một trung tâm phản ứng tương đương với D1 hoặc D2

và một ăng ten tương đương với CP43 hoặc CP47 Điện tử được lấy từ plastocyanin (PC) ở bên trên lumen và chuyển đến sắt sunfua (FeS) ở phía trên stroma để khử NADP+ thành NADPH [28]

Hệ thống ăng ten (hình 1.3 và hình 1.4) được tổ chức để thu nhận năng lượng

bằng chuyển electron từ trạng thái cơ bản sang trạng thái kích thích và chuyển tới trung tâm phản ứng là nơi phản ứng quang hoá diễn ra Cấu tạo của ăng ten LH1 bao gồm một heterodimer của chuỗi peptit và hai phân tử chlorophyll a hoặc b LH2 bao gồm một heterodimer của chuỗi peptit và ba phân tử chlorophyll a hoặc b Các

sắc tố khác như caroten (hình 1.5) không hoạt động hoá học nhưng có chức năng

như một ăng ten

Hình 1.3 : Hệ thống ăng ten của các vi khuẩn tía [29]

Hệ thống ăng ten tăng hiệu quả hấp thụ photon bằng cách tăng số lượng sắc tố

để hấp thụ trong dải sóng từ 400nm-800nm Nếu cường độ của ánh sáng mặt trời thấp, mỗi phân tử chlorophyll chỉ hấp thụ một vài photon trong một giây Bằng cách kết hợp nhiều chất màu để hấp thụ ánh sáng hiệu suất quang có giá trị cao nhất.[1,4,7,12,15,26,27,29]

Hình 1 4: Hấp thụ ánh sáng của hệ thống ăng ten trong thực vật [15]

OH

O

O O

Hình 1.5: Caroten trong hệ quang hợp

Trung tâm phản ứng của hệ quang hợp bao gồm hàng trăm chlorophyll và một cặp chlorophyll có tổ chức đặc biệt, nhờ cấu tạo này mà sự chuyển dời điện tích xảy ra để thực hiện phản ứng khử NAD+

thành NADPH Phản ứng ở trung tâm phản ứng loại I không có sự tạo thành oxy trong khi ở trung tâm phản ứng loại II oxy được tạo thành

Trung tâm phản ứng của vi khuẩn Rhodopseudomonas virdis bao gồm bốn

tiểu đơn vị protein (hình 1.6) và các nhóm hoạt động bao gồm chlorophyll dime có

tổ chức đặc biệt, hai phân tử pheophytin, phân tử quinon QA, phân tử quinon QB và

một ion sắt (Fe) Chuỗi chuyển dời điện tích bắt đầu từ Chlorophyll monome phía bên trái qua chlorophyll dime sang pheophytin đến Chlorophyll monome phía bên phải rồi qua pheophytin phía bên phải tới Quinon A sang Fe và chuyển về pheophytin phía bên trái và trở về Chlorophyll monome ban đầu Năng lượng kích thích của electron đã được sử dụng để tổng hợp ATP cao năng từ ADP Đó chính là

cơ sở và bản chất của quá trình quang hợp

Hình 1.6: Cấu trúc trung tâm phản ứng trong hệ quang hợp

của vi khuẩn Rhodopseudomonas virdis [6]

Chuỗi vận chuyển điện tử là những hệ thống của các protein và enzyme thông qua đó các electron di chuyển từ mức năng lượng cao hơn về một mức độ năng

lượng thấp một cách điều hòa để nâng cao hiệu quả sử dụng năng lượng (hình 1.7)

Trong chuỗi vận chuyển điện tử của màng thylakoid bao gồm các enzym khử sắt, plastoquinon oxidoreductase và enzym ATP syntase Dòng electron tách ra từ phân

tử nước tới NADP dưới tác dụng của PS Chuỗi vận chuyển proton thực hiện qua màng thylakoid và được sử dụng để tổng hợp ATP Khi các electron di chuyển vào chuỗi vận chuyển, các protein luân phiên bị oxi hoá và giải phóng ra proton đi vào trong màng thylakoid Nếu không có chuỗi vận chuyển điện tử từ trạng thái năng lượng cao đến trạng thái năng lượng thấp thì sự mất mát năng lượng xảy ra quá nhanh dẫn đến các tế bào sử dụng năng lượng ánh sáng với hiệu suất quá thấp

Hình 1.7: Chuỗi eletron vận chuyển của màng thylakoid

Cacbohydrat được tổng hợp từ khí cacbonic và nước trong pha tối của bộ máy

cố định cacbon bằng cách sử dụng xúc tác enzyme và năng lượng từ ATP hoặc NADPH theo chu trình Calvin-Benson C6 (hình 1.8) hoặc chu trình C4 (hình 1.9)

Hình 1.8: Cố định Cacbon C 6 theo chu trình Calvin-Benson

Cố định Cacbon dioxit theo chu trình Calvin-Benson C6 xảy ra trong stroma của lục lạp gồm 3 chuỗi phản ứng khác nhau Pha đầu là phản ứng của dẫn xuất đường 5 ribulose-1,5-bisphotphat với CO2 và phân cắt dẫn xuất đường 6 thành hai phân tử 3-photphoglyxerat Pha hai là quá trình tái tạo cơ chất ribulose-5-photphat còn pha ba là phản ứng của ribulose-5-photphat với ATP tạo thành ribulose-1,5-bisphotphat Quá trình cố định CO2 xúc tác bởi enzym ribulose-1,5-bisphosphat cacboxylase oxygenase (RuBisCO), phản ứng của RuBisCO với O2 hoặc CO2 phụ thuộc vào nồng độ tương đối của chúng Trong tất cả các sinh vật, CO2 là chất nền

ưu tiên, nếu nồng độ CO2 trở nên thấp hơn nhiều so với nồng độ oxy thì sự hô hấp xảy ra ở mức độ đáng kể

Hình 1.9: Cố định cacbon theo chu trình C 4

Ở một số loại thực vật, cơ chất cho quá trình cố định CO2 là phosphoenolpyruvate (PEP) theo chu trình C4 Tỷ lệ sử dụng ATP cho cố định CO2 trong thực vật theo chu trình C4 cao hơn so với chu trình C6

Về công thức cấu tạo, phân tử chlorophyll a chia ra hai phần: nhân chlorophyll

và đuôi phân tử chlorophyll

Mg N N

N N

O MeOOC

Hình 1.10: Công thức cấu tạo của chlorophyll a

Chlorophyll a Chlorophyll b Chlorophyll c1 Chlorophyll c2 Chlorophyll d

Công thức

phân tử C55H72O5N4Mg C55H70O6N4Mg C35H30O5N4Mg C35H28O5N4Mg C54H70O6N4Mg Nhóm C3 -CH=CH2 -CH=CH2 -CH=CH2 -CH=CH2 -CHO

Nhóm C8 -CH2CH3 -CH2CH3 -CH2CH3 -CH=CH2 -CH2CH3Nhóm C17 -CH2CH2COO-

Phytyl

-CH2CH2Phytyl -CH=CHCOOH -CH=CHCOOH

COO CH2CH2COO - Phytyl Liên kết

Tần suất Phổ biến Đa số thực vật Các loại tảo khác nhau Các loại tảo khác nhau Vi khuẩn lam

(cyanobacteria)

Bảng 1.1: Thành phần của các chlorophyll khác nhau

Nhân chlorophyll là phần quan trọng nhất trong phân tử diệp lục, gồm 1

nguyên tử Mg ở trung tâm liên kết với 4 nguyên tử N của 4 vòng pyrol trong đó có

2 liên kết phối trí Phần nhân chlorophyll bao gồm 4 vòng pyrol liên kết với nhau qua liên kết metylen, do có mạch liên hợp dài, phân tử chlorophyll có khả năng hấp thụ ánh sáng rất mạnh

Đuôi phân tử chlorophyll là gốc rượu phytol có 20 nguyên tử cacbon Đuôi

chlorophyll có tính ưa lipit nên có vai trò định vị phân tử chlorophyll trên màng quang hợp thilakoit có tính lipit

1.1.2.1.2 Tính chất của chlorophyll

 Bản chất hoá học của chlorophyll

Chlorophyll không tan trong nước, chỉ tan trong các dung môi hữu cơ Khi

muốn chiết xuất chlorophyll ra khỏi lá xanh phải dùng các dung môi như este, axeton, rượu, benzen

Chlorophyll là este của axit chlorophyllic với hai rượu là phytol và metanol nên chúng có các phản ứng đặc trưng của một este là phản ứng xà phòng hoá khi tác dụng với kiềm để tạo nên muối chlorophylat vẫn có màu xanh

Mg N N

N N

O MeOOC

COO Phytyl

+2NaOH

Chlorophyll a

Mg N N

N N

O NaOOC

N NH

HN N

O MeOOC

COO Phytyl

Mg N N

N N

O MeOOC

COO Phytyl

+2H+

+ Mg2+

Chlorophyll a Pheophytin a

Pheophytin có thể tác dụng với một kim loại khác và kim loại này sẽ đẩy 2H

để thay thế vào vị trí của Mg trong phân tử chlorophyll tạo nên hợp chất có màu xanh rất bền Trong môi trường axit mạnh, đun nóng, pheophytin có thể bị thủy phân liên kết este với rượu phytol tạo thành hợp chất pheophorbide

Sự mất màu của diệp lục: Chlorophyll ở trong tế bào khó bị mất màu vì nằm trong phức hệ với protein và lipit Trong dung dịch, có ánh sáng và O2, chlorophyll

sẽ mất màu do phản ứng quang oxi hoá

 Tính quang học của diệp lục

Tính huỳnh quang: Khi quan sát ánh sáng phản xạ từ dung dịch chlorophyll thấy dung dịch có màu huyết dụ, nếu tắt nguồn sáng thấy dung dịch có màu xanh như cũ

Tính lân quang: cũng gần tương tự như huỳnh quang nhưng chỉ khác là khi tắt nguồn sáng thì ánh sáng màu huyết dụ còn lưu lại một thời gian ngắn nữa

1.1.2.1.3 Vai trò của chlorophyll trong hệ quang hợp

Hấp thu năng lượng ánh sáng mặt trời: nhờ cấu trúc đặc trưng của phân tử chlorophyll mà nó có thể hấp thụ năng lượng ánh sáng với hiệu suất cao

Vận chuyển năng lượng vào trung tâm phản ứng: từ phân tử chlorophyll hấp thu ánh sáng cho đến trung tâm phản ứng của quang hợp phải qua một hệ thống cấu trúc trong màng thilakoid gồm rất nhiều phân tử chlorophyll khác nhau Năng lượng ánh sáng phải truyền qua các phân tử chlorophyll để đến được trung tâm phản ứng Tham gia biến đổi năng lượng ánh sáng thành năng lượng hoá học tại trung tâm phản ứng

1.2 Giới thiệu về ngành vi khuẩn lam ( ngành cyanobacteria)

1.2.1 Sơ lƣợc về vi khuẩn lam

Vi khuẩn lam có sức sống rất dẻo dai, chúng phân bố rộng rãi trong tất cả các môi trường Đại bộ phận sống trong nước ngọt, ở các ao hồ có nhiều chất hữu cơ và góp phần hình thành hệ sinh vật nổi (plankton) của các thủy vực; một số phân bố trong nước mặn hoặc nước lợ, bùn lầy hay đất ẩm ướt, trên đá, trên vỏ cây ẩm, ngay

cả những nơi có điều kiện rất khắc nghiệt như trong tuyết và ở những suối nước nóng đến 69°C

Vi khuẩn lam thuộc loại ưa nhiệt, có tính bền vững với nhiệt độ Nhiều loài có thể phát triển ở nhiệt độ cao, cả trong các suối nước nóng (70 - 80°C) Tảo lam có thể chịu được nhiệt độ cao như vậy là nhờ trạng thái keo đặc biệt của chất nguyên sinh Mặt khác, một số vi khuẩn lam cũng có khả năng tồn tại ở nhiệt độ thấp (những vi khuẩn sống trong băng tuyết, hay ở Nam cực, nhiệt độ tới -83°C vẫn tìm

thấy một lượng lớn vi khuẩn Nostoc)

Vi khuẩn phát triển mạnh ở nhiệt độ cao (vào các tháng nóng trong năm) Với các vi khuẩn nước ngọt, nhiệt độ phát triển thích hợp là 30°C

Khi sinh trưởng phát triển mạnh, vi khuẩn gây nên hiện tượng “nước nở hoa”

Tuy nhiên, một số loài thuộc chi Oscillatoria lại gây “nước nở hoa” trên băng ở

nhiệt độ gần 0°C Khi có hiện tượng “nước nở hoa” do vi khuẩn lam gây ra thì nước không sử dụng được vì khi đó sinh khối của tảo đạt tới mức khá lớn (tối đa tới 450-500g/m3) mà trong đó rất ít loài có thể dùng làm thức ăn cho các sinh vật khác, sau

đó chúng chết hàng loạt và phân hủy Các chất do vi khuẩn tiết ra và các sản phẩm phân hủy của chúng khi chết đều gây hại

Trong số các cơ thể tự dưỡng được thì vi khuẩn lam được xem là nhóm nguyên thủy nhất Di tích hóa thạch của các vi khuẩn lam dạng sợi phát hiện được cách nay khoảng 3,5 tỷ năm Mặc dầu tế bào không có cấu trúc phức tạp so với các

vi khuẩn khác nhưng nó vẫn là đại diện có vai trò quan trọng ở các hệ sinh thái Vi khuẩn lam là sinh vật quang hợp đầu tiên tổng hợp chất hữu cơ và cũng là tế bào đầu tiên có hai hệ thống tiếp nhận ánh sáng (hệ thống quang loại I và II) và giải

phóng O2 Nhiều loài vi khuẩn lam có khả năng cố định đạm, chuyển Nitơ trong khí quyển từ thể tự do sang dạng Nitơ sử dụng được như amoni (NH4), amino axit và một loạt hợp chất nitơ khác

Vi khuẩn lam chưa có nhân điển hình, không có màng nhân, vật chất di truyền được tập trung trong chất nhân (nucleoid), không có lưới nội sinh chất, ty thể, thể golgi, lạp thể và không mang roi, chỉ chứa chlorophyll, sắc tố liên kết với protein thường làm cho chúng có màu lam (có khả năng tự dưỡng) Chúng cũng chưa có sự sinh dục hữu phái

Về tổ chức cơ thể, vi khuẩn lam có cấu tạo đơn giản, một số có dạng đơn bào, phần lớn dưới dạng tập đoàn hay đa bào hình sợi, hình chuỗi hạt đơn hay phân nhánh

Đại đa số tế bào vi khuẩn lam dạng sợi – chuỗi hạt thường có tế bào dị hình (dị bào) Dị bào là những tế bào đặc biệt, lớn hơn các tế bào bình thường khác, có màng đôi, dày, trong suốt, không có oxy và không có hệ thống quang II do đó không sản xuất ra oxy trong quá trình quang hợp Dị bào có 1 hoặc 2 lỗ (ở đầu tiếp xúc với tế bào dinh dưỡng) tùy theo vị trí ở đầu hay ở giữa sợi (đặc biệt trong phân loại) qua

đó lưu thông tế bào chất với các tế bào nằm cạnh nó Khoảng cách của dị bào trên sợi chịu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường Dưới kính hiển vi quang học, chất tế bào trông đồng nhất nhưng dưới kính hiển vi điện tử nó có một hệ thống màng, thường có màu xanh vàng do có chlorophyll a và caroten nhưng thiếu phycoxyanin

Dị bào có vai trò trong việc cố định đạm trong điều kiện hiếu khí

Hình 1.11 Tế bào dị hình (*) ở Tảo Annabaena

Trong sự phát triển của sợi, sợi có thể bị tách ra ở bên cạnh các dị bào này và tạo thành một nhánh mới đi ra từ sợi chính Đó là sự phân nhánh giả của sợi, phân biệt với sự phân nhánh thật được bắt đầu từ một tế bào sinh dưỡng nào đó của sợi phân chia dọc và sau đó tế bào non mới hình thành tiếp tục phân chia tạo nhánh bên

1.2.2 Cấu tạo tế bào

Màng tế bào vi khuẩn lam khá dầy, gồm 4 lớp, bên ngoài thường hóa nhầy, có khi tạo thành bao chuyên hóa, bao xung quanh tế bào hoặc nhóm tế bào hay toàn bộ sợi

Chất nguyên sinh ở vi khuẩn lam được phân biệt thành 2 phần:

- Phần ngoài tập trung các phiến mỏng quang hợp (lamen), thể ri bô và các thể hạt (hạt chất tế bào) khác

- Phần trong chứa chất nhân (nucleoprotein) Ở giữa ranh giới giữa 2 phần không rõ ràng chỉ nhận ra khi dùng phẩm Feulgen nhuộm trung bào chất chứa chất nhân

Các chất màu (sắc tố) phân bố trên các lamen ở phần ngoài nên phần này có màu (xanh đen hoặc xanh lục)

Chất màu gồm có: chlorophyll a (có màu lục); phycoxyanin màu lam và phycoerythrin màu hồng và các dẫn xuất của caroten, oxycaroten

Chất dự trữ của tế bào là glycogen, volutin, không có tinh bột

1.2.3 Phân loại

Ngành vi khuẩn lam có khoảng 1500 - 2000 loài, tập hợp thành một số bộ, họ khác nhau Hiện nay con số các bộ không thống nhất tuỳ theo tác giả Có người chia ngành này thành 3 lớp với nhiều bộ, có người lại chia thành 1 lớp với 4 bộ:

Bộ Chroococcales: Vi khuẩn đơn bào, đơn độc hay tập đoàn Tế bào tròn không phân biệt gốc và đỉnh, không có nội và ngoại bào tử

Tế bào đơn độc hay tập đoàn nhưng không sắp xếp thành hàng hay sợi (họ Chroococcaceae), thường gặp như: Chroococcus, Microcystis

Bộ Dermocarpales: đơn bào

Bộ Pleurocapsales: Vi khuẩn đa bào dạng sợi đơn, có phân nhánh hoặc không,

sinh sản cách phân chia tế bào hoặc nội bào tử

Các chi điển hình: Cyanocystis, Pleurocapsa

Bộ Hormogonales: đa bào dạng sợi lông, hoặc phân nhánh, thường có tế bào

dị hình, có khi sợi lại tập hợp thành tập đoàn

Các chi điển hình: Nostoc, Anabaena, Aphanizomenon,

Tác giả khác lại chia thành 2 bộ: Chroococcales với những dạng đơn bàn hay tập đoàn và Hormogonales với những dạng đa bào

1.2.4 Ý nghĩa thực tiễn

Trong thực tiễn, vi khuẩn lam có vai trò tích cực và tiêu cực

Trong nông nghiệp, vai trò quan trọng của vi khuẩn lam là làm tăng độ phì cho đất nhờ khả năng cố định đạm Hiện nay người ta đã tìm thấy khoảng 50 loài, phần lớn thuộc họ vi khuẩn chuỗi (Nostocaceae) có khả năng này Ðặc biệt đáng chú ý là

loài Anabaena azollae cộng sinh trong bèo hoa dâu, một loại cây dùng làm phân

xanh và làm thức ăn gia súc có ý nghĩa kinh tế rất lớn ở nước ta

Theo nhiều nghiên cứu cho thấy, nhờ sự phát triển của vi khuẩn lam trong ruộng lúa mà hằng năm mỗi hécta đất trồng lúa có thể lấy được thêm từ không khí khoảng 15 - 50 kg nitơ, trung bình là 20 - 25 kg, đôi khi thu được đến 80 kg hay nhiều hơn nữa

Những năm gần đây, một số vi khuẩn lam có hàm lượng protein cao như

Spirulina maxima, S platensis được nuôi trồng với quy mô công nghiệp để thu sinh

khối nhằm bổ sung nguồn protein cần thiết cho chăn nuôi và cho con người

Vi khuẩn lam tích lũy ở đáy thủy vực, tham gia vào việc hình thành bùn sapropen được dùng làm phân bón, thức ăn gia súc giàu vitamin, chế biến làm than cốc, khí hơi và dùng chữa bệnh

Một số vi khuẩn lam được dùng làm thức ăn cho người như Nostoc commune,

Nostoc pruniforme Ðây là một loại thực phẩm ngon và quí đối với người Trung

Quốc, giàu protein và vitamin

Ngoài ra, cùng với vi khuẩn và các động vật nguyên sinh, vi khuẩn lam còn được dùng làm sạch sinh học các nguồn nước thải ra từ sản xuất công nghiệp

Vi khuẩn lam cũng có những tác dụng tiêu cực: khi phát triển mạnh chúng gây hiện tượng "nước nở hoa' làm giảm phẩm chất của nước, ảnh hưởng tới động vật đáy và biến đổi hệ sinh thái thủy vực

Vi khuẩn lam ít có ý nghĩa dinh dưỡng đối với động vật phù du, do chúng có cấu trúc màng nhầy, động vật thường không sử dụng được và chúng thường sinh ra

độc tố Chỉ có một số ít cá sử dụng một số vi khuẩn lam để ăn

1.3 Tình hình nghiên cứu về chlorophyll a trong nước và quốc tế

Quốc tế: Chlorophyll a được phân lập vào năm 1913 và cấu trúc hoàn chỉnh

đã được xác định vào năm 1940 bởi Hans Fischer Sự phân lập chlorophyll a từ các

nguồn tự nhiên rất khó khăn do các phản ứng phân hủy như: đề kim loại hóa, đề phytyl hóa, oxi hóa quang hóa, solvat hóa, allomerization và đề metoxycacbonyl

hóa Chlorophyll a đóng vai trò rất quan trọng trong hệ thống quang hợp do khả

năng hấp thụ ánh sáng và biến đổi quang năng thành hoá năng với hiệu xuất cao, quá trình này xảy ra trong hệ quang hợp của thực vật bậc cao, tảo biển và vi khuẩn quang hợp.[11,18,19,31,32]

Mg N N

N N

O MeOOC

O

O phytyl

Mg N N

N N

O MeOOC

O

O phytyl

CHO

Mg N N

N N

O MeOOC

O

O phytyl CHO

Hình 1.12: Các hợp chất chlorophyll phổ biến trong tự nhiên

Chlorophyll và các dẫn xuất của nó là một đối tượng rất hấp dẫn cho các nghiên cứu lý thuyết hóa hữu cơ như cấu trúc điện tử, tính thơm, quá trình chuyển dời điện tử, quang hóa và quá trình quang hợp Nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp

chlorophyll a cũng đạt được những thành tựu to lớn [11,18,19,32]

Trong nước: Hoá học chlorophyll là một lĩnh vực rất rộng lớn và lâu đời trên

thế giới do những tính chất hóa học và ứng dụng đặc biệt của nhóm hợp chất này Tuy nhiên vấn đề này còn rất mới mẻ ở Việt nam Chlorophyll và các dẫn xuất của chúng được sử dụng rất rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, mỹ phẩm, công nghệ nano và điều trị ung thư [2,4,5]

Vì vậy việc đặt nền móng cho Hoá học Chlorophyll là vấn đề cấp thiết, nó có ỹ nghĩa lớn về mặt khoa học cũng như ứng dụng thực tiễn rất phong phú và rất gần gũi với cuộc sống

1.4 Các dẫn xuất của chlorophyll a

Chlorophyll và các dẫn xuất của chúng được sử dụng trong các lĩnh vực khác nhau như thực phẩm, mỹ phẩm, công nghệ nano và điều trị ung thư Hàng ngàn tấn dẫn xuất của chlorophyll có tên là Cu-Chlorophyllin được sử dụng trong ngành thực phẩm,

mỹ phẩm, kem đánh răng như là các chất màu hữu cơ [4,11,28,29]

Quang trị liệu các bệnh ung thư là một ứng dụng quan trọng của các dẫn xuất chlorophyll dựa trên sự khu trú có chọn lọc trên khối u và sản sinh ra oxy ở trạng thái singlet để phá hủy các tế bào ung thư Chlorophyll và các dẫn xuất của nó hấp thụ ánh sáng có bước sóng khoảng 650 nm nên ánh sáng dễ dàng xuyên qua các tế bào mô Khi được chiếu xạ, các dẫn xuất chất này chuyển lên trạng thái kích thích

triplet (Năng lượng kích thích với chlorophyll a, E = 29 kcal / mol) sau đó năng

lượng này được chuyển sang cho oxy để sản xuất oxy ở trạng thái kích thích singlet (E = 22,5 kcal / mol) Oxy ở trạng thái singlet là một chất oxy hoá hiệu quả dẫn đến

sự hình thành các thành tố rất hoạt động như anion gốc, gốc hydroxyl và hydroperoxide, các gốc hoạt động này sẽ đi vào phản ứng trực tiếp với các phân tử hữu cơ của các tế bào ung thư Các gốc tự do phản ứng dây chuyền để phân huỷ màng lipit của các tế bào dẫn đến phá hủy các tế bào ung thư Một số chlorin rất quan trọng được sử dụng cho quang trị liệu bao gồm chlorin-e6 và các muối natri, monoaspartylchlorin-e6 và photochlorin Liệu pháp quang đã được sử dụng để điều trị các khối u ác tính của da, tuyến vú, màng nhầy của các khoang miệng, lưỡi, môi dưới, thanh quản, dạ dày, phổi, ruột non, bàng quang và trực tràng [11,13,14,16,17,22,23,24,25,34]

N NH

N H N

COOH COOH COOH

chlorin e 6

N NH

N H N

COOH COOH

O N H

COOH HOOC

mono L-aspartyl chlorin e 6

N NH

N H N O

O COOMe

C5H11

photochlorin

N NH HN N

O MeOOC

HN N

O MeOOC

Quá trình sinh tổng hợp chlorophyll trải qua 4 giai đoạn:

 Sinh tổng hợp axit 5-aminolevulinic

 Sinh tổng hợp vòng pyrol từ axit 5-aminolevulinic

 Tổng hợp hệ 4 vòng tetrapyrol

 Quá trình đưa Mg2+ vào hệ thống vòng

1.5.1 Sinh tổng hợp axit 5-aminolevulinic

 Sinh tổng hợp axit 5-aminolevulinic từ glyxin và succinyl-CoA

Sử dụng phản ứng của glyxin với succinyl-CoA dưới tác dụng của enzim axit 5-aminolevulinic xảy ra trong động vật, nấm men và một số vi khuẩn

CH2

CH2COOH

O

NH-Pyridoxal-P H

Enzyme

CH2

CH2COOH

O NH-Pyridoxal-P H

ALA

Succinyl-CoA

Hình 1.14: Sinh tổng hợp axit 5-aminolevulinic từ glycine và succinyl-CoA

 Sinh tổng hợp axit 5-aminolevulinic từ axit glutamic

Cơ chất của quá trình sinh tổng hợp là glutamic xảy ra trong thực vật bậc cao,

rêu, khuẩn lam và nhiều vi khuẩn khác

Đầu tiên, axit glutamic được hoạt hóa bằng cách gắn với ARNtGlu tạo thành glutamyl-ARNt với sự có mặt của ATP và Mg2+ Sau đó, glutamyl-ARNt bị đehiđro dưới tác dụng của NADP tạo thành glutamat-1-anđehit Cuối cùng là quá trình đeamin hóa tạo thành axit 5-aminolevulinic

Hình 1.15: Sinh tổng hợp axit 5-aminolevulinic

1.5.2 Sinh tổng hợp pyrol (porphobilinogen)

Sinh tổng hợp chlorophyll từ axit 5-aminolevulinic đến uroporphyrinogen III

tới protoporphyrin IX tương tự như sinh tổng hợp hemoglobin ở người và chuột Liên kết C-C và C-N trong vòng pyrol được hình thành dưới tác dụng của enzim, axit 5-aminolevulinic bị đehiđrat tạo ra liên kết không đối xứng và ngưng tụ

với nhau tạo thành porphobilinogen (PBG) (hình 1.16)

COOH

NH2O

Hình 1.16: Sinh tổng hợp vòng pyrol

Sau đó, porpobilinogen bị đeamin hóa và 4 vòng pyrol kết hợp với nhau tạo

thành tetrepyrol hay hiđroximetylbilan (hình 1.17)

1 deamin

2 đóng vòng

N NH

HN NH

COOH COOH COOH

HOOC

COOH HO

COOH COOH

COOH

hydroxy methylbilane

III IV

Hình 1.17: Sự tạo thành tetrapyrol

1.5.3 Quá trình đóng vòng của 4 vòng pyrol (tetrapyrol)

Hình 1.18 mô tả quá trình đóng vòng của tetrapyrol Nhóm metylen của vòng

pyrol I ngưng tụ với vị trí α của vòng pyrol IX và tạo thành uroporphyrinogen III

N NH

HN NH

COOH COOH

COOH HOOC

COOH HO

COOH COOH

COOH

HN NH

HN NH

COOH COOH COOH

HOOC

COOH

COOH COOH HOOC

hydroxy methylbilane uroporphyrinogen III

H 2 O

III IV

I

II

Hình 1.18: Đóng vòng tetrapyrol

Hình 1.19 cho ta thấy uroporphyrinogen III bị đecacboxyl hoá tạo thành

coproporphyrinogen III Phân tử mới tạo thành tiếp tục bị đecacboxyl: chuyển nhóm propionyl thành nhóm vinyl để tạo thành phân tử protoporphyrinogen IX Phân tử này lại tiếp tục bị oxi hoá tạo thành nối đôi liên hợp trong vòng protoporphyrin IX

và kết thúc quá trình đóng vòng của tetrapyrol.[2,21]

HN NH

HN NH

COOH COOH COOH

HOOC

COOH

COOH COOH HOOC

HN NH

COOH COOH

COOH COOH

coproporphyrinogen III 4CO 2

HN NH

HN NH

COOH COOH

COOH COOH

protoporphyrin IX

Hình 1.19: Quá trình tạo thành protophyrin IX

1.5.4 Đưa ion Mg 2+ vào hệ thống vòng

Quá trình hình thành chlorophyll bằng việc đưa ion Mg2+

vào vòng

protoporphyrin IX (hình 1.20) Tiếp sau đó Magiê-protoporphyrin IX bị

monometyleste hóa bên nhóm propionic của vòng III để chuẩn bị cho phản ứng tạo

vòng V Kết thúc quá trình là sự tạo vòng cacboxyclic V dưới tác dụng của enzym

cyclase sau đó là quá trình devinyl hóa, khử hóa chọn lọc và phytyl este hóa tạo thành chlorophyll a

Mg N N

N N

COOH

O MeOOC

Mg N N

N N

COOH

O MeOOC

Mg N N

N N

COOH

O MeOOC

Mg N N

N N

COO phytyl

O MeOOC

divinyl protochlorophyllide a monovinyl protochlorophyllide a

chlorophyllide a chlorophyll a

NADPH NADP + enzym Cyclase

NADPH NADP

phytyl PP

PPi NADPH

NADP + protochlorophyllide enzym oxidoreductase

+

N NH

HN N

COOH COOH

N N

N N

Mg Mg

N N

N N

COOH COOH

protoporphyrin IX Mg protoporphyrinogen IX Mg protoporphyrinogen IX monomethylester

1.6 Tổng hợp toàn phần chlorophyll a theo Woodward

Woodward tổng hợp chlorophyll vào năm 1960 là một sự đóng góp vô giá trong lĩnh vực tổng hợp hữu cơ Quá trình này chỉ được áp dụng cho chlorophyll a

mà không phải là phương pháp chung cho tổng hợp các hợp chất tương tự vì vậy bài toán tổng hợp toàn phần chlorophyll a vẫn còn là một trong những bài toàn khó khăn nhất của Hóa hữu cơ

O

CO2Me NHAc

CN NC

HN

CO2Et

NH OHC

MeO2C

A

C A

N NH

HN N

COOMe

N NH

HN N

O MeO

Hình 1.21: Woodward tổng hợp chất chlorophyll a

Chlorin e6- trimetylester được tạo thành bởi 46 bước từ các pyrol khác nhau

Con đường tổng hợp đặc thù từ liên kết giữa hai nửa của bicyclic pyrol AD 14 và

BC 15 để hình thành porphyrin 17 Tiếp theo là phản ứng khử chọn lọc của một nhánh axit prôpionic tạo ra dẫn suất acrylic metylester 17 Porphyrin 17 chuyển thành purpurin 18 và sau đó là isopurpurin-5-methyl ester 19, một tiền chất cho sự

hình thành của chlorin e6- trimetylester 9 Sự hoán chuyển giữa porphyrin-chlorin

17-18 là phản ứng chính cho sự hình thành chlorin trong quá trình tổng hợp, đó là

quá trình đồng phân hóa giữa porphyrin thành chlorin duy nhất được quan sát cho đến ngày nay

Các bước cuối cùng cho việc tạo thành chlorophyll a từ chlorin e6trimetylester lần đầu tiên được tiến hành nghiên cứu bởi H Fisher và đã được cải thiện bởi K.M.Smith, P Hynninen và F.-P Montforts

-Cuối cùng là đưa ion Mg2+ vào hệ thống vòng được tìm ra bởi Eschemoser

2.2.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR được đo trên máy Bruker Ultrashield

TM 500 tại phòng thí nghiệm phân tích trung tâm, trường đại học khoa học tự nhiên

TP HCM Dung môi là CDCl3, chất chuẩn nội là TMS

2.3 Nội dung nghiên cứu

2.3.1 Nội dung 1

Nghiên cứu quá trình chiết tách liên tục chlorophyll a từ vi khuẩn lam và thực hiện phản ứng chuyển hóa chlorophyll a thành pheophytin a và metyl pheophobide a

2.3.1.1 Tách chiết và chuyển hoá chlorophyll a thành pheophytin a (PP)

N NH

HN N

O MeOOC

COO Phytyl

Mg N N

N N

O MeOOC

Vi khuẩn lam

1

8 9 10

22 23 24

Hình 2.1: Chuyển hoá chlorophyll a thành pheophytin a

2.3.1.1.1 Xây dựng qui trình chiết tách chlorophyll a từ vi khuẩn lam

Cho 100g vi khuẩn lam vào bình cầu 1lit, sau đó thêm vào hỗn hợp 400ml axeton rồi đem đun hồi lưu 2h trong bóng tối Hỗn hợp sau phản ứng được lọc lấy dịch bằng giấy lọc băng xanh, rửa bằng axeton Dịch lọc có chứa chlorophyll a được

cô quay để loại bỏ dung môi Khi đó phần cặn thu được bao gồm chlorophyll a, caroten, phycoxyanin và bẩn

2.3.1.1.2 Phản ứng chuyển hóa chlorophyll a thành pheophytin a

 Quy trình

Phần chất rắn thu được sau khi cô quay được đem thực hiện phản ứng để loại

bỏ ion Mg2+ trong chlorophyll a như sau: Thêm vào bình cầu chứa chất rắn 100ml dung dịch axeton, 5ml dung dịch H2SO4 1M rồi đêm khuấy hỗn hợp phản ứng 1h trong bóng tối Trong quá trình khuấy, kiểm tra tiến trình phản ứng bằng sắc kí bản mỏng với hệ dung môi CH2Cl2/Acetone = 10:0,4

Hỗn hợp sau khuấy được đổ vào 300ml nước, chiết bằng 200ml CH2Cl2 Cô

quay dịch chiết để loại bỏ dung môi Làm khô phần rắn thu được và tách bằng sắc

kí cột (Silicagen, CH2Cl2/Axetone = 10:0,4 ) Sản phẩm được kết tinh bằng

CH2Cl2/n-pentan

2.3.1.2 Phản ứng chuyển hoá chlorophyll a thành metyl pheophobide a (MPP)

Mg N N

N N

O MeOOC

HN N

O MeOOC

Cặn được hoà tan trong 10ml CH2Cl2 để sắc kí cột (Alox, CH2Cl2/Acetone = 10:0,1) tách được metyl pheophobide a Sản phẩm được kết tinh bằng CH2Cl2/CH3OH

2.3.2 Nội dung 2

Nghiên cứu quá trình chiết tách chlorophyll a từ vi khuẩn lam và chuyển hóa trực tiếp thành metyl pheophorbide a bằng phương pháp chiết và chuyển vị este một giai đoạn

N NH

HN N

O MeOOC

12 13 14 15

16 17 18 19 20

21 22

23 24

Hình 2.3: Chuyển hoá trực tiếp thành metylpheophobide a

từ vi khuẩn lam

 Quy trình 2

Cho 100g vi khuẩn lam vào bình cầu dung tích 500 ml Thêm vào đó 300ml

CH3OH, 15ml H2SO4 đặc, khuấy hỗn hợp trong bóng tối 3-5h Sau đó đem lọc hỗn hợp bằng giấy lọc băng xanh, rửa hỗn hợp bằng CH2Cl2 Dịch lọc thu được được thêm 200ml CH2Cl2, 500ml H2O, 180ml NaHCO3 Sau đó đem chiết với CH2Cl2 Dịch chiết được rửa lại bằng H2O (3x 300ml), rồi đem cô quay để loại bỏ dung môi

và làm khô chất rắn thu được

Hoà tan chất rắn bằng 10ml CH2Cl2 để đem sắc kí cột (Alox, CH2Cl2/ /Axetone = 10:0,1) tách được mety pheophobide a Sản phẩm được kết tinh bằng

CH2Cl2/ CH3OH

2.3.3 Nội dung 3

Nghiên cứu phản ứng chuyển hóa metyl pheophorbide a thành chlorin-e 6 trimetylester bằng phản ứng mở vòng cacboxyclic

-N NH

HN N

O MeOOC

COOMe

N NH

HN N

COOMe

COOMe COOMe +MeOH

MeOK/MeOH

1 2

3 4

5 6 7 8

9 10

11

12 13 14 15

16 17 18 19 20

21 22

23 24

Hình 2.4: Chuyển hoá metyl pheophobide a thành chlorin e 6 - trimetylester

 Quy trình

Lấy 151,6 mg Metylpheophobide hoà tan trong 10ml THF Sau đó thêm 100ml CH3OH, 2ml hỗn hợp dung dịch CH3OK/ CH3OH 30-35% Khuấy hỗn hợp trong bóng tối trong vòng 3h, trong quá trình khuấy kiểm tra bằng sắc kí bản mỏng (CH2Cl2/EtOAc = 7:1)

Sau đó, thêm 400ml H2O, chiết với 200ml CH2Cl2, rồi rửa lại dịch chiết bằng H2O (4x 200ml) Dịch chiết được cô quay để loại bỏ dung môi và làm khô Sản phẩm được tinh chế bằng sắc kí cột (CH2Cl2/EtOAc = 7:1) và kết tinh bằng Axetone/CH3OH

2.4 Xác định cấu trúc các sản phẩm bằng phổ hồng ngoại, tử ngại và khả kiến, phổ cộng hưởng từ hạt nhân và phổ khối

2.4.1 Cấu trúc của pheophytin a

R f : 0,58

IR (KBr):~= 3402.29 cm-1

(w, N-H), 2931.15 (m), 2867 (w), 1737.30 (s, br, C=O, este), 1694.16 (s, C=O, este), 1615.96 (w, C=C, vòng thơm), 1451.48 (w), 1349.0 (w), 1160.26 (m, br, C-O-C), 1000 (w), 971.51 (w), 731.53 (w), 610.19 (w).-

UV/ VIS (THF): λmax (εx103) = 410 (120.58), 667.5 (56.29).-

1

H-NMR (500 MHz, CDCl3):  132R [132S] = - 1.61 ppm [- 1.43] (s, br, 1H,

NH), 0.57 (s, br, 1H, NH), 0.78 - 0.88 (br, 12H, 4CH3, chuỗi phytyl ), 1.20 - 1.30 (br, 21H, CH, CH2, chuỗi phytyl), 1.69 (s, 3H, CH3-CH=, chuỗi phytyl), 1.72 (t, 3J

= 7.50 Hz, 3H, CH3, 82), 1.81 (d, 3J = 7.50 Hz, 3H, CH3, 181), 2.10 - 2.60 (m, 4H, 2CH2, 171 và 172), 3.26 (s, 3H, CH3, 71), [3.38] 3.41 (s, 3H, CH3, 21), [3.68] 3.71 (s, 3H, CH3, 121), 3.70 (q, 3J = 7.50 Hz, 2H, CH2, 81), 3.90 (s, 3H, CH3, 132), 4.20 - 4.25 (m, 1H, CH, 17), 4.4 - 4.49 (m, 3H, CH, CH2, CH2-CH=C-CH3, chuỗi phytyl

và 18), 5.14 (t, 3J = 6.00 Hz, 1H, CH, CH2-CH=C-CH3, chuỗi phytyl), 6.20 (d, 3J =

11.50 Hz, cis - vinyl, 1H, =CH2, 32 ), 6.28 (s, 1H, CH, 132), 6.31 (d, 3J = 17.50 Hz,

trans - vinyl, 1H, =CH2, 32), 8.00 (dd, 3J = 11.50 Hz, cis - vinyl, 3J = 17.50 Hz,

trans - vinyl, 1H, =CH, 31), [8.48] 8.55 (s, 1H, meso proton), [9.35] 9.41 (s, 1H, meso proton), [9.49] 9.53 (s, 1H, meso proton) -

MS : M + =871

2.4.2 Cấu trúc của metyl pheophobide a

R f : 0,57

IR (KBr):~= 3376.54 cm-1 (w, N-H), 2930.19 (w), 2859.35 (w), 1743.82 (s, C=O, este), 1790.92 (s, C=O, este), 1618.52 (m, C=C, vòng thơm), 1437.52 (w), 1214.76 (s, C-O-C, este), 1164.63 ( s, br, C-O-C, este), 980.85 (w), 897.31 (w), 746.95 (w).-

UV/ VIS (THF): λmax (εx103) = 410 (106.05), 610.0 (7.87), 667.5 (48.86).-

1

H-NMR (500 MHz, CDCl3):  132R [132S] = - 1.61 ppm [- 1.43] (s, br, 1H, NH), 0.54 [0.86] (s, br, 1H, NH), 1.8 (t, 3J = 7.50 Hz, 3H, CH3, 82), 1.82 (d, 3J = 7.50 Hz, 3H, CH3, 181), 2.10 - 2.70 (m, 4H, 2CH2, 171 và 172), [3.20] 3.25(s, 3H,

CH3, 71), 3.39 (s, 3H, CH3, 21), 3.59 (s, 3H, CH3, 121), 3.66 (q, 3J = 6.50 Hz, 2H,

CH2, 81), 3.70 (s, 3H, CH3, 174), [3.84] 3.89 (s, 3H, CH3, 153), 4.21 (m, 1H, CH, 17), 4.46 (q, 3J = 5.5 Hz, 1H, CH, 18), 6.20-6.28 (d, 3J = 11.50 Hz, cis - vinyl,=CH2, 32), 6.28 (s, 1H, CH, 132), 6.30 (d, 3J = 17.50 Hz, trans - vinyl, 1H, =CH2, 32), 7.98 (dd,

3J = 11.50 Hz, cis - vinyl, 3J = 17.50 Hz, trans - vinyl, 1H, =CH, 31), [8.52] 8.59 (s, 1H, meso proton), [9.35] 9.41 (s, 1H, meso proton), [9.49] 9.54 (s, 1H, meso proton).-

UV/ VIS (THF): λmax (εx103) = 401 (123.51), 666 (42.44).-

1 H-NMR (500 MHz, CDCl3):  = - 1.47 ppm (s, br, 1H, NH), -1.29(s, br, 1H, NH), 1.71 (t, 3J = 7.50 Hz, 3H, CH3, 82), 1.77 (d, 3J = 7.30 Hz, 3H, CH3, 181), 2.18 - 2.22 (m, 4H, 2 CH2, 171 và 172), 3.29 (s, 3H, CH3, 71), 3.46 (s, 3H, CH3, 21), 3.57 (s, 3H, CH3, 121), 3.63 (s, 3H, CH3, 174), 3.78 (q, 3J = 7.50 Hz, 2H, CH2, 81), 4.26 (s, 3H, CH3, 153), 4.44 (q, 3J = 7.00 Hz, 1H, CH, 18), 5.25 (d, 1H, 2J = 19.00 Hz, CH2,