tách chiết và chuyển hóa chlorophylla từ vi khuẩn cyano bacteria

ĐA ̣ I HO ̣ C QUÔ ́ C GIA HA ̀ NÔ ̣ I TRƯƠ ̀ NG ĐA ̣ I HO ̣ C KHOA HO ̣ C TƯ ̣ NHIÊN    TRÂ ̀ N THI ̣ HIÊ ̀ N TCH CHIT V CHUYN HA CHLOROPHYLL A TƯ ̀ VI KHUÂ ̉ N CYANO BACTERIA LUÂ ̣ N VĂN THA ̣ C SI ̃ KHOA HO ̣ C H Ni - 2011 ĐA ̣ I HO ̣ C QUÔ ́ C GIA HA ̀ NÔ ̣ I TRƯƠ ̀ NG ĐA ̣ I HO ̣ C KHOA HO ̣ C TƯ ̣ NHIÊN    TRÂ ̀ N THI ̣ HIÊ ̀ N TCH CHIT V CHUYN HA CHLOROPHYLL A TƯ ̀ VI KHUÂ ̉ N CYANO BACTERIA Chuyên nga ̀ nh: Hoá hữu cơ M s: 60 44 27 LUÂ ̣ N VĂN THA ̣ C SI ̃ KHOA HO ̣ C NGƢƠ ̀ I HƢƠ ́ NG DN KHOA HC TS. Đoa ̀ n Duy Tiên H Ni - 2011 MỤC LỤC CÁC KÍ HIỆU VIẾT TẮT TRONG BÀI LUẬN VĂN DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ BẢNG HÌNH MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN 3 1.1 Cấu tạo và tính chất của hệ quang hợp. 3 1.1.1 Cấu tạo và tính chất của hệ quang hợp ở thực vật và vi khuẩn .3 1.1.2 Chlorophyll 10 1.2 Giới thiệu về ngành vi khuẩn lam ( ngành cyanobacteria) 14 1.2.1 Sơ lƣợc về vi khuẩn lam 14 1.2.2 Cấu tạo tế bào 16 1.2.3 Phân loại 16 1.2.4 Ý nghĩa thực tiễn 17 1.3 Tình hình nghiên cứu về chlorophyll a trong nƣớc và quốc tế 18 1.4 Các dẫn xuất của chlorophyll a 19 1.5 Sinh tổng hợp chlorophyll a 20 1.5.1 Sinh tổng hợp axit 5-aminolevulinic 20 1.5.2 Sinh tổng hợp pyrol (porphobilinogen) 21 1.5.3 Quá trình đóng vòng của 4 vòng pyrol (tetrapyrol) 22 1.5.4 Đƣa ion Mg 2+ vào hệ thống vòng 24 1.6 Tổng hợp toàn phần chlorophyll a theo Woodward 25 CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM 27 2.1 Mục tiêu thực nghiệm 27 2.2 Xác định các tính chất vật lý. 27 2.2.1 Sắc kí bản mỏng 27 2.2.2 Phổ hồng ngoại (IR) 27 2.2.3 Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 27 2.2.4 Phổ khối (MS) 27 2.2.5 Phổ tử ngoại 27 2.3 Nội dung nghiên cứu 27 2.3.1 Nội dung 1 27 2.3.2 Nội dung 2 29 2.3.3 Nội dung 3 30 2.4 Xác định cấu trúc các sản phẩm bằng phổ hồng ngoại, tử ngại và khả kiến, phổ cộng hƣởng từ hạt nhân và phổ khối. 31 2.4.1 Cấu trúc của pheophytin a 31 2.4.2 Cấu trúc của metyl pheophobide a 32 2.4.3 Cấu trúc của chlorin e 6 – trimetylester 33 CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Tách chiết và chuyển hoá chlorophyll a thành pheophytin a. 34 3.2 Thực hiện phản ứng chuyển hoá chlorophyll a thành metyl pheophobide a. . 38 3.3 Chuyển hoá metyl pheophobide a thành chlorin – e 6 trimetylester 42 CHƢƠNG 4 : KẾT LUẬN 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC CÁC KÍ HIỆU VIẾT TẮT TRONG BÀI LUẬN VĂN PS : Hệ thống quang hợp IR : Phổ hồng ngoại UV – VIS : Phổ tử ngoại và khả kiến MS : Phổ khối lượng 1 H – NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H. MPP : Metyl pheophobide a PP : Pheophytin a ATP : Adenosin Triphotphat NADP : Nicotinamit Adenin Dinucleotitphotphat LHC : Phức hợp thu nhận ánh sáng DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ BẢNG Bảng 1.1: Thành phần của các chlorophyll khác nhau 11 Bảng 3.1: Bảng dữ liệu phổ 1 H-NMR của pheophytin a 35 Bảng 3.2: Bảng dữ liệu phổ 1 H-NMR của metyl pheophobide a 39 Bảng 3.3: Bảng dữ liệu phổ 1 H-NMR của chlorin e 6 - trimetylester 44 HÌNH Hình 1.1: Năng lượng bức xạ trong tổng hợp của các phân tử hữu cơ 3 Hình 1.2: Các hệ thống quang hợp 4 Hình 1.3: Hệ thống ăng ten của các vi khuẩn tía …………………… 5 Hình 1. 4: Hấp thụ ánh sáng của hệ thống ăng ten trong thực vật ……… 6 Hình 1.5: Caroten trong hệ quang hợp………….……………………… 6 Hình 1.6: Cấu trúc trung tâm phản ứng của vi khuẩn Rhodopseudomonas virdis 7 Hình 1.7: Chuỗi eletron vận chuyển của màng thylakoid 8 Hình 1.8: Cố định Cacbon C 6 theo chu trình Calvin-Benson. 9 Hình 1.9: Cố định cacbon theo chu trình C 4 10 Hình 1.10: Công thức cấu tạo của chlorophyll a 11 Hình 1.11. Tế bào dị hình (*) ở Tảo Annabaena 15 Hình 1.12: Các hợp chất chlorophyll phổ biến trong tự nhiên 18 Hình 1.13: Các hoạt chất sử dụng để chữa trị ung thư bằng liệu pháp quang 20 Hình 1.14: Sinh tổng hợp axit 5-aminolevulinic từ glyxin và sucxinyl-CoA 21 Hình 1.15: Sinh tổng hợp axit 5-aminolevulinic 21 Hình 1.16: Quá trình tổng hợp vòng pyrol 22 Hình 1.17: Sự tạo thành tetrapyrol 22 Hình 1.18: Quá trình đóng vòng của tetrepyrol 23 Hình 1.19: Quá trình tạo thành protophyrin IX 23 Hình 1.20: Quá trình hình thành phân tử chlorophyll a [10,30,33] 24 Hình 1.21: Tổng hợp chlorophyll a theo Woodward. 25 Hình 2.1: Chuyển hoá chlorophyll a thành pheophytin a 28 Hình 2.2: Chuyển hoá chlorophyll a thành metyl pheophobide a 29 Hình 2.3: Chuyển hoá trực tiếp thành metyl pheophobide a từ vi khuẩn lam 30 Hình 2.4: Chuyển hoá metyl pheophobide a thành chlorin e 6 - trimetylester 31 Hình 3.1: Phổ hồng ngoại của pheophytin a 36 Hình 3.2: Phổ UV – VIS của Pheophytin a 36 Hình 3.3: Phổ khối của pheophytin a 37 Hình 3.4: Phổ 1 H-NMR của pheophytin a 37 Hình 3.5: Phổ hồng ngoại của metyl pheophobide a 40 Hình 3.6: Phổ UV – VIS của metyl pheophobide a 40 Hình 3.7: Phổ khối của metyl pheophobide a 41 Hình 3.8: Phổ 1 H – NMR của pheophobide a 41 Hình 3.9: Phổ UV – VIS của chlorin e 6 - trimetylester 45 Hình 3.10: Phổ hồng ngoại của chlorin e 6 - trimetylester 45 Hình 3.11: Phổ khối của chlorin e 6 – trimetylester 46 Hình 3.12: Phổ 1 H – NMR của chlorin e 6 - trimetylester 46 1 MỞ ĐẦU Từ lâu các nhà khoa học rất quan tâm tới việc chiết tách các sắc tố từ lá xanh của thực vật bậc cao. Cách đây hơn 100 năm các nhà hóa học đã tách được chất màu xanh từ lá và gọi chúng là Chlorophyll. Vào năm 1913, Richard Willstatter, nhà hóa học người Đức đã chỉ ra rằng tất cả các năng lượng sống đều nhờ mặt trời và cây xanh có một cách nào đó để hấp thụ năng lượng này. Tới năm 1919, ông đã giải thích được chức năng của hợp chất hấp thụ năng lượng mặt trời chính là Chlorophyll. Thực vật bậc cao có lá xanh đã tự mình hấp thụ năng lượng bức xạ và chuyển hóa thành năng lượng dự trữ trong cơ thể. Chlorophyll giữ vai trò vô cùng quan trọng trong quá trình quang hợp, là chất hấp thụ năng lượng ánh sáng trong hệ quang hợp. Chlorophyll chuyển năng lượng ánh sáng thành năng lượng hóa học trong phân tử ATP, trong quá trình này xảy ra các phản ứng chuyển dịch electron (phản ứng oxy hóa khử). Chlorophyll và các dẫn xuất của chúng là một đối tượng nghiên cứu hấp dẫn và trở thành một lĩnh vực phát triển rộng lớn và được các nhà khoa học quan tâm bao gồm các nghiên cứu về hệ thơm, khả năng hấp thụ ánh sáng, chuyển dời điện tích, tính chất phổ, sinh tổng hợp và các nghiên cứu y dược. Chlorophyll và các dẫn xuất của chúng có nhiều ứng dụng khác nhau trong y học và công nghiệp. Trong y học, chlorophyll được dùng như một thành phần cơ bản trong khẩu phần ăn kiêng và thuốc chữa bệnh. Chẳng hạn, Cu-chlorophyllin phòng chống ung thư từ thức ăn bị thiu mốc chứa hydrocacbon mạch vòng, aflatoxin. Chlorophyll và các dẫn xuất còn được sử dụng như là chất nhạy sáng để tiêu diệt các tế bào ung thư và chống virus, chất chữa vết thương và khử mùi hôi. Chlorophyll ức chế phát triển của vi khuẩn, kích thích việc phục hồi các mô đã bị hư hại và ngăn cản tác hại của các chất gây ung thư. Chlorophyll còn có lợi cho hệ tiêu hóa và có tác dụng dưỡng da. Một số dẫn xuất chlorophyll có hoạt tính sinh học quí giá như tiêu diệt tế bào ung thư tủy, virus leukemia, u ác tính (malignant melanoma) theo cơ chế quang trị 2 liệu. Chlorophyll còn có tác dụng giảm viêm khớp (arthritis), chữa trị u xơ, giảm mùi hôi, giảm đường máu của người bệnh cao tuổi. Chlorophyll là một nhóm các hợp chất đa dạng bao gồm chlorophyll (a, b, c, d,…), trong đó chlorophyll a phổ biến nhất trong tự nhiên, đó là chlorophyll trong hệ quang hợp của thực vật bậc cao, tảo biển và vi khuẩn quang hợp. Trong thực vật bậc cao hệ thống quang hợp có cấu tạo rất phức tạp và chứa nhiều loại chlorophyll khác nhau. Quá trình tách các chlorophyll ra khỏi nhau rất khó khăn và phức tạp. Trong các loại vi khuẩn quang hợp thì vi khuẩn lam có cấu tạo hệ quang hợp đơn giản nên việc phân lập dễ dàng hơn. Vì vậy tôi đã lựa chọn “ Tách chiết và chuyển hoá chlorophyll a từ vi khuẩn cyano bacteria” làm đề tài cho luận văn cao học của mình. Mục tiêu của luận văn là tìm ra qui trình tách chiết chlorophyll a một cách hiệu quả ở qui mô phòng thí nghiệm và chuyển hóa chúng để thu được các hợp chất làm trung gian cho quá trình tổng hợp các hoạt chất chữa trị ung thư bằng liệu pháp quang, các chất màu thực phẩm, tổng hợp các hợp chất hấp thụ ánh sáng sử dụng cho pin mặt trời và các sensor. 3 CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN 1.1 Cấu tạo và tính chất của hệ quang hợp 1.1.1 Cấu tạo và tính chất của hệ quang hợp ở thực vật và vi khuẩn Quang hợp là cơ sở năng lượng của sự sống trên trái đất. Chlorophyll hấp thụ năng ánh sáng mặt trời và chuyển quang năng thành hóa năng bởi trung tâm phản ứng trong hệ quang hợp của vi khuẩn và thực vật dưới dạng NADPH và ATP được sử dụng để tổng hợp cacbohydrat (hình 1.1). Hình 1.1: Năng lượng bức xạ trong tổng hợp của các phân tử hữu cơ Các chlorophyll hấp thụ và biến quang năng thành hoá năng với hiệu suất cao. Các hệ thống quang hợp (PS) (hình 1.2) được phân loại theo cấu trúc của trung tâm phản ứng chia thành PSI của vi khuẩn lam, PSII của thực vật bậc cao và PS của vi khuẩn tía đều bao gồm bốn thành phần chính là ăng-ten thu sáng, trung tâm phản ứng, trung tâm chuyển điện tử và bộ máy cố định cacbon. [3,5] [...]... nuôi và cho con người Vi khuẩn lam tích lũy ở đáy thủy vực, tham gia vào vi c hình thành bùn sapropen được dùng làm phân bón, thức ăn gia súc giàu vitamin, chế biến làm than cốc, khí hơi và dùng chữa bệnh Một số vi khuẩn lam được dùng làm thức ăn cho người như Nostoc commune, Nostoc pruniforme Ðây là một loại thực phẩm ngon và quí đối với người Trung Quốc, giàu protein và vitamin Ngoài ra, cùng với vi. .. gia Hà Nội 2.3 Nội dung nghiên cứu 2.3.1 Nội dung 1 27 Nghiên cứu quá trình chiết tách liên tục chlorophyll a từ vi khuẩn lam và thực hiện phản ứng chuyển hóa chlorophyll a thành pheophytin a và metyl pheophobide a 2.3.1.1 Tách chiết và chuyển hoá chlorophyll a thành pheophytin a (PP) 2 N Vi khuẩn lam a 1 N Mg N H+ N 3 4 5 6 NH 19 23 N 16 17 15 MeOOC O COO Phytyl C55H72N4O5Mg 893.50 9 10 N b 18 8 22... LHCII và chuyển vào trung tâm phản ứng bởi protein-chlorophyll CP43 và CP47 Quá trình chuyển dời điện tích thực hiện bởi phức hợp của mangan để ôxi hóa nước và giải phóng oxi vào khí quyển Trong PS I, các protein PsaA và PsaB tạo thành một heterodimer giống PSII Mỗi PsaA và PsaB bao gồm một trung tâm phản ứng tương đương với D1 hoặc D2 và một ăng ten tương đương với CP43 hoặc CP47 Điện tử được lấy từ. .. trọng ở các hệ sinh thái Vi khuẩn lam là sinh vật quang hợp đầu tiên tổng hợp chất hữu cơ và cũng là tế bào đầu tiên có hai hệ thống tiếp nhận ánh sáng (hệ thống quang loại I và II) và giải 14 phóng O2 Nhiều loài vi khuẩn lam có khả năng cố định đạm, chuyển Nitơ trong khí quyển từ thể tự do sang dạng Nitơ sử dụng được như amoni ( NH 4 ), amino axit và một loạt hợp chất nitơ khác Vi khuẩn lam chưa có nhân... thu được Cặn được hoà tan trong 10ml CH2Cl2 để sắc kí cột (Alox, CH2Cl2/Acetone = 10:0,1) tách được metyl pheophobide a Sản phẩm được kết tinh bằng CH2Cl2/CH3OH 2.3.2 Nội dung 2 Nghiên cứu quá trình chiết tách chlorophyll a từ vi khuẩn lam và chuyển hóa trực tiếp thành metyl pheophorbide a bằng phương pháp chiết và chuyển vị este một giai đoạn 29 ... thấy một lượng lớn vi khuẩn Nostoc) Vi khuẩn phát triển mạnh ở nhiệt độ cao (vào các tháng nóng trong năm) Với các vi khuẩn nước ngọt, nhiệt độ phát triển thích hợp là 30°C Khi sinh trưởng phát triển mạnh, vi khuẩn gây nên hiện tượng “nước nở hoa” Tuy nhiên, một số loài thuộc chi Oscillatoria lại gây “nước nở hoa” trên băng ở nhiệt độ gần 0°C Khi có hiện tượng “nước nở hoa” do vi khuẩn lam gây ra thì... được và chúng thường sinh ra độc tố Chỉ có một số ít cá sử dụng một số vi khuẩn lam để ăn 1.3 Tình hình nghiên cứu về chlorophyll a trong nƣớc và quốc tế Quốc tế: Chlorophyll a được phân lập vào năm 1913 và cấu trúc hoàn chỉnh đã được xác định vào năm 1940 bởi Hans Fischer Sự phân lập chlorophyll a từ các nguồn tự nhiên rất khó khăn do các phản ứng phân hủy như: đề kim loại hóa, đề phytyl hóa, oxi hóa. .. vật khác, sau đó chúng chết hàng loạt và phân hủy Các chất do vi khuẩn tiết ra và các sản phẩm phân hủy của chúng khi chết đều gây hại Trong số các cơ thể tự dưỡng được thì vi khuẩn lam được xem là nhóm nguyên thủy nhất Di tích hóa thạch của các vi khuẩn lam dạng sợi phát hiện được cách nay khoảng 3,5 tỷ năm Mặc dầu tế bào không có cấu trúc phức tạp so với các vi khuẩn khác nhưng nó vẫn là đại diện có... ứng của vi khuẩn tía gồm các tiểu đơn vị protein L và M liên kết với các sắc tố hoạt động và có đối xứng bậc hai Trung tâm phản ứng được bao quanh bởi hệ thống ăng ten thu sáng (LH1) Các electron được chuyển vào trung tâm phản ứng của một heme-binding cytochrome (cyt) Trong PSII gồm protein D1 và D2 có cấu trúc và chức năng tương đồng với các tiểu đơn vị L và M của trung tâm phản ứng ở vi khuẩn Năng... protein và vitamin Ngoài ra, cùng với vi khuẩn và các động vật nguyên sinh, vi khuẩn lam còn được dùng làm sạch sinh học các nguồn nước thải ra từ sản xuất công nghiệp 17 Vi khuẩn lam cũng có những tác dụng tiêu cực: khi phát triển mạnh chúng gây hiện tượng "nước nở hoa' làm giảm phẩm chất của nước, ảnh hưởng tới động vật đáy và biến đổi hệ sinh thái thủy vực Vi khuẩn lam ít có ý nghĩa dinh dưỡng đối . loại vi khuẩn quang hợp thì vi khuẩn lam có cấu tạo hệ quang hợp đơn giản nên vi c phân lập dễ dàng hơn. Vì vậy tôi đã lựa chọn “ Tách chiết và chuyển hoá chlorophyll a từ vi khuẩn cyano bacteria . MỞ ĐẦU Từ lâu các nhà khoa học rất quan tâm tới vi c chiết tách các sắc tố từ lá xanh của thực vật bậc cao. Cách đây hơn 100 năm các nhà hóa học đã tách được chất màu xanh từ lá và gọi chúng. tính chất của hệ quang hợp ở thực vật và vi khuẩn .3 1.1.2 Chlorophyll 10 1.2 Giới thiệu về ngành vi khuẩn lam ( ngành cyanobacteria) 14 1.2.1 Sơ lƣợc về vi khuẩn lam 14 1.2.2 Cấu tạo tế bào