Nghiên cứu quá trình chiết tách liên tục chlorophyll a từ vi khuẩn lam và thực hiện phản ứng chuyển hóa chlorophyll a thành pheophytin a và metyl pheophobide a.
2.3.1.1 Tách chiết và chuyển hoá chlorophyll a thành pheophytin a (PP)
NH N N HN
MeOOC O COO Phytyl Mg
N N N N
MeOOC O COO Phytyl
C55H74N4O5 C55H72N4O5Mg
871.22 893.50
H+
Chlorophyll a
Pheophytin a a
b
a: Axeton, reufux 2h b: H2SO4
Vi khuẩn lam
1
2 3 4 5
6 7 8 9 10 11
12 14 13 1615 17 18 19
20 21 22
23 24
Hình 2.1: Chuyển hoá chlorophyll a thành pheophytin a 2.3.1.1.1 Xây dựng qui trình chiết tách chlorophyll a từ vi khuẩn lam
Cho 100g vi khuẩn lam vào bình cầu 1lit, sau đó thêm vào hỗn hợp 400ml axeton rồi đem đun hồi lưu 2h trong bóng tối. Hỗn hợp sau phản ứng được lọc lấy dịch bằng giấy lọc băng xanh, rửa bằng axeton. Dịch lọc có chứa chlorophyll a được cô quay để loại bỏ dung môi. Khi đó phần cặn thu được bao gồm chlorophyll a, caroten, phycoxyanin và bẩn.
2.3.1.1.2 Phản ứng chuyển hóa chlorophyll a thành pheophytin a.
Quy trình
Phần chất rắn thu được sau khi cô quay được đem thực hiện phản ứng để loại bỏ ion Mg2+ trong chlorophyll a như sau: Thêm vào bình cầu chứa chất rắn 100ml dung dịch axeton, 5ml dung dịch H2SO4 1M rồi đêm khuấy hỗn hợp phản ứng 1h trong bóng tối. Trong quá trình khuấy, kiểm tra tiến trình phản ứng bằng sắc kí bản mỏng với hệ dung môi CH2Cl2/Acetone = 10:0,4.
Hỗn hợp sau khuấy được đổ vào 300ml nước, chiết bằng 200ml CH2Cl2. Cô
quay dịch chiết để loại bỏ dung môi. Làm khô phần rắn thu được và tách bằng sắc kí cột (Silicagen, CH2Cl2/Axetone = 10:0,4 ). Sản phẩm được kết tinh bằng CH2Cl2/n-pentan.
2.3.1.2 Phản ứng chuyển hoá chlorophyll a thành metyl pheophobide a (MPP)
Mg N N
N N
MeOOC O COO Phytyl
chlorophyll a
a
a: Axeton, reufux 2h b: CH3OH/H2SO4 5%
NH N
N HN
O MeOOC
COOMe
metyl pheophobide a Vi khuẩn lam b
Hình 2.2: Chuyển hoá chlorophyll a thành metyl pheophobide a
Quy trình 1
Thực hiện quá trình như 2.3.1.1 để thu được hỗn hợp cặn chứa chlorophyll a.
Làm khô cặn và cho vào bình cầu 500ml. Tiếp đó, thêm 100ml CH3OH, 5ml H2SO4 đặc. Đem khuấy hỗn hợp trong bóng tối 20h. Sau đó hỗn hợp sau phản ứng được thêm 200ml CH2Cl2 , 300ml nước, 60ml NaHCO3 10% . Sau đó chiết với CH2Cl2. Dịch chiết được rửa lại bằng H2O (3 x 200ml), sau đó được cô quay để loại bỏ dung môi, làm khô cặn thu được.
Cặn được hoà tan trong 10ml CH2Cl2 để sắc kí cột (Alox, CH2Cl2/Acetone = 10:0,1) tách được metyl pheophobide a. Sản phẩm được kết tinh bằng CH2Cl2/CH3OH.
2.3.2 Nội dung 2
Nghiên cứu quá trình chiết tách chlorophyll a từ vi khuẩn lam và chuyển hóa trực tiếp thành metyl pheophorbide a bằng phương pháp chiết và chuyển vị este một giai đoạn.
NH N N HN
O MeOOC
COOMe
metyl pheophobide a Vi khuẩn lam
1 2
3 4 5
6 7
8
9 10 11
12 14 13
15 17 16 18 19 20
21 22 23 24
Hình 2.3: Chuyển hoá trực tiếp thành metylpheophobide a từ vi khuẩn lam
Quy trình 2
Cho 100g vi khuẩn lam vào bình cầu dung tích 500 ml. Thêm vào đó 300ml CH3OH, 15ml H2SO4 đặc, khuấy hỗn hợp trong bóng tối 3-5h. Sau đó đem lọc hỗn hợp bằng giấy lọc băng xanh, rửa hỗn hợp bằng CH2Cl2. Dịch lọc thu được được thêm 200ml CH2Cl2, 500ml H2O, 180ml NaHCO3. Sau đó đem chiết với CH2Cl2. Dịch chiết được rửa lại bằng H2O (3x 300ml), rồi đem cô quay để loại bỏ dung môi và làm khô chất rắn thu được.
Hoà tan chất rắn bằng 10ml CH2Cl2 để đem sắc kí cột (Alox, CH2Cl2/ /Axetone = 10:0,1) tách được mety pheophobide a. Sản phẩm được kết tinh bằng CH2Cl2/ CH3OH.
2.3.3 Nội dung 3
Nghiên cứu phản ứng chuyển hóa metyl pheophorbide a thành chlorin-e6- trimetylester bằng phản ứng mở vòng cacboxyclic.
NH N
N HN
O MeOOC
COOMe
NH N N HN
COOMe
COOMe COOMe +MeOH
metyl pheophobide a chlorin e6 - trimethylester MeOK/MeOH
1 2
3 4
5 6
7 8 9
10 11
12 14 13
15 16 17 18 19 20
21 22 24 23
Hình 2.4: Chuyển hoá metyl pheophobide a thành chlorin e6- trimetylester
Quy trình
Lấy 151,6 mg Metylpheophobide hoà tan trong 10ml THF. Sau đó thêm 100ml CH3OH, 2ml hỗn hợp dung dịch CH3OK/ CH3OH 30-35%. Khuấy hỗn hợp trong bóng tối trong vòng 3h, trong quá trình khuấy kiểm tra bằng sắc kí bản mỏng (CH2Cl2/EtOAc = 7:1).
Sau đó, thêm 400ml H2O, chiết với 200ml CH2Cl2, rồi rửa lại dịch chiết bằng H2O (4x 200ml). Dịch chiết được cô quay để loại bỏ dung môi và làm khô.
Sản phẩm được tinh chế bằng sắc kí cột (CH2Cl2/EtOAc = 7:1) và kết tinh bằng Axetone/CH3OH.
2.4 Xác định cấu trúc các sản phẩm bằng phổ hồng ngoại, tử ngại và khả kiến,