CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM
2.3 Nội dung nghiên cứu
2.3.1 Nội dung 1
Nghiên cứu quá trình chiết tách liên tục chlorophyll a từ vi khuẩn lam và thực hiện phản ứng chuyển hóa chlorophyll a thành pheophytin a và metylpheophobide a.
2.3.1.1 Tách chiết và chuyển hoá chlorophyll a thành Pheophytin a (PP)
Hình 2.1: Chuyển hoá chlorophyll a thành pheophytin a
2.3.1.1.1 Xây dựng qui trình chiết tách chlorophyll a từ vi khuẩn lam bằng phương pháp liên tục sử dụng dung môi axeton
Cho 100g vi khuẩn lam vào bình cầu 1lit, sau đó thêm vào hỗn hợp 400ml axeton rồi đem đun hồi lưu 2h trong bóng tối. Hỗn hợp sau phản ứng được lọc lấy dịch bằng giấy lọc băng xanh, rửa bằng axeton. Tiếp tục lấy dịch lọc đem đun hồi lưu thêm 1h. Dịch sau khi đun hồi lưu có chứa chlorophyll a được cô quay để loại bỏ dung môi. Khi đó phần cặn thu được bao gồm
chlorophyll a, caroten, phycoxyanin và bẩn.
2.3.1.1.2 Thực hiện phản ứng chuyển hóa chlorophyll a thành pheophytin a.
Quy trình:
Phần chất rắn thu được sau khi cô quay được đem thực hiện phản ứng để loại bỏ ion Mg2+ trong chlorophyll a như sau: Thêm vào bình cầu chứa chất rắn 25ml dung dịch axit H2SO4 rồi đêm khuấy hỗn hợp phản ứng 6h trong bóng tối. Trong quá trình khuấy, kiểm tra tiến trình phản ứng bằng sắc kí bản mỏng với hệ dung môi CH2Cl2/n-Hexan/Acetone = 10:10:0,4 để tìm ra thời gian tối ưu.
Hỗn hợp sau khuấy được rửa bằng 200ml CH2Cl2 , 700ml H2O rồi đem chiết bằng CH2Cl2. Cô quay dịch chiết để loại bỏ dung môi. Sấy khô phần rắn thu được và tách chất bằng sắc kí cột (40g Silicagen, CH2Cl2/n- Hexan/Axetone = 10:10:0,4 ). Sản phẩm được kết tinh bằng CH2Cl2/n-pentan.
2.3.1.2 Thực hiện phản ứng chuyển hoá chlorophyll a thành metylpheophobide a (MPP)
Hình 2.2: Chuyển hoá chlorophyll a thành metylpheophobide a
Quy trình 1
a. Sấy khô hỗn hợp cho vào bình cầu 500ml. Tiếp đó, thêm 100ml CH3OH, 5ml H2SO4 đặc. Đem khuấy hỗn hợp trong bóng tối 20h. Sau đó hỗn hợp dịch sau phản ứng được thêm 200ml CH2Cl2 , 300ml nước, 60ml NaHCO3 10% . Sau đó chiết với CH2Cl2. Dịch chiết được rửa lại bằng H2O ( 3 x 200ml), sau đó được cô quay để loại bỏ dung môi, sấy khô chất rắn thu được.
Chất rắn khô được hoà tan trong 10ml CH2Cl2 (càng ít càng tốt) để sắc kí cột (80g Alox, CH2Cl2/n-hexan/Acetone = 10:10:1) tách được metylpheophobide. Sản phẩm được kết tinh bằng CH2Cl2: CH3OH = 1,5:10