Tách và xác định một số độc tố nhóm Alkaliod trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - ĐỖ THỊ THU HẰNG TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐỘC TỐ NHÓM ALKALOID TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - ĐỖ THỊ THU HẰNG TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐỘC TỐ NHÓM ALKALOID TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã Số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người Hướng Dẫn Khoa Học: PGS TS Lê Thị Hồng Hảo Hà Nội – 2015 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn lời cho em gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS TS Lê Thị Hồng Hảo, Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia – Bộ Y tế tận tình hƣớng dẫn, đóng góp ý kiến quý báu tạo điều kiện giúp đỡ em suốt trình thực đề tài Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới thầy cô giáo giảng dạy khoa Hoá học, đặc biệt thầy cô môn Hoá Phân Tích, cho em kiến thức quý giá, tạo điều kiện cho em suốt trình học tập nghiên cứu Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia tạo điều kiện thuận lợi để đƣợc học tập hoàn thành đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn tới đồng nghiệp labo Hóa – Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia giúp đỡ nhiều trình làm thực nghiệm Cuối xin gửi lời cảm ơn tới gia đình bạn bè động viên, chia sẻ khó khăn Hà Nội, năm 2015 Học viên Đỗ Thị Thu Hằng MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN BẢNG KÍ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU .1 CHƢƠNG TỔNG QUAN Error! Bookmark not defined 1.1 Tổng quan nhóm alkaloid Error! Bookmark not defined 1.1.1 Lịch sử phát Error! Bookmark not defined 1.1.2 Khái quát nhóm alkaloid Error! Bookmark not defined 1.1.3 Cấu tạo số alkaloid độc Error! Bookmark not defined 1.1.4 Tác dụng độc tính số alkaloid Error! Bookmark not defined 1.2 Các phƣơng pháp xác định Error! Bookmark not defined 1.2.1 Phƣơng pháp điện di mao quản Error! Bookmark not defined 1.2.2 Phƣơng pháp sắc ký lỏng với detector UV Error! Bookmark not defined 1.2.3 Phƣơng pháp sắc ký lỏng với detector khối phổError! Bookmark not defined 1.3 Sắc ký lỏng khối phổ Error! Bookmark not defined 1.3.1 Nguyên tắc chung sắc ký lỏng Error! Bookmark not defined 1.3.2 Detector khối phổ (Mass spectrometry – MS)Error! Bookmark not defined 1.3.2.4 Bộ phận phát Error! Bookmark not defined 1.3.3 Phân tích định tính định lƣợng LC-MS/MSError! Bookmark not defined 1.4 Lấy mẫu Error! Bookmark not defined 1.5 Đánh giá phƣơng pháp phân tích Error! Bookmark not defined CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUError! Bookmark not defined 2.1 Đối tƣợng mục tiêu nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.3 Thiết bị, dụng cụ hóa chất dùng nghiên cứuError! Bookmark not defined 2.3.1 Thiết bị Error! Bookmark not defined 2.3.2 Dụng cụ Error! Bookmark not defined 2.3.3 Chất chuẩn Error! Bookmark not defined 2.3.4 Các loại hóa chất, dung môi khác Error! Bookmark not defined CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined 3.1 Tối ƣu điều kiện tách xác định alkaloid thiết bị LC/MS/MSError! Bookmark no 3.1.1 Tối ƣu điều kiện detector khối phổ (MS/MS)Error! Bookmark not defined 3.1.2 Tối ƣu điều kiện chạy sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC)Error! Bookmark not defi 3.2 Tối ƣu trình xử lý mẫu Error! Bookmark not defined 3.2.1 Khảo sát dung môi chiết Error! Bookmark not defined 3.2.2 Khảo sát dung dịch kiềm hóa Error! Bookmark not defined 3.2.3 Khảo sát thể tích dung dịch kiềm hóa Error! Bookmark not defined 3.3 Đánh giá phƣơng pháp phân tích Error! Bookmark not defined 3.3.1 Tính đặc hiệu/chọn lọc Error! Bookmark not defined 3.3.2 Khảo sát khoảng tuyến tính lập đƣờng chuẩnError! Bookmark not defined 3.3.3 Giới hạn phát (LOD), giới hạn định lƣợng (LOQ) phƣơng pháp Error! Bookma 3.3.4 Đánh giá độ lặp lại độ thu hồi Error! Bookmark not defined 3.4 Phân tích mẫu thực Error! Bookmark not defined KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Error! Bookmark not defined KẾT LUẬN Error! Bookmark not defined KIẾN NGHỊ Error! Bookmark not defined TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Error! Bookmark not defined DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Cấu trúc hoá học số alkaloid độc đƣợc xác định đề tài Error! Bookmark not defined Bảng 1.2 Các giá trị LD50 chất phân tích Error! Bookmark not defined Bảng3.1: Các mảnh ion định lƣợng định tính alkaloidError! Bookmark not defined Bảng 3.2: Các thông số tối ƣu MS/MS chế đô ̣ ion dƣơngError! Bookmark not defined Bảng 3.3: Các hệ dung môi pha động khảo sát Error! Bookmark not defined Bảng 3.4: Diện tích alkaloid sử dụng hệ dung môi khác Error! Bookmark not defined Bảng3.5: Các chƣơng trình gradient khảo sát Error! Bookmark not defined Bảng3.6: Ảnh hƣởng nồng độ amoniacetat tới diện tích píc alkaloid Error! Bookmark not defined Bảng 3.7 : Ảnh hƣởng dung môi chiết đến hiệu suất chiết alkaloid Error! Bookmark not defined Bảng 3.8 : Ảnh hƣởng dung dịch kiềm hóa đến hiệu suất chiết alkaloid Error! Bookmark not defined Bảng 3.9: Ảnh hƣởng thể tích dung dịch kiềm hóa đến hiệu suất chiết alkaloid Error! Bookmark not defined Bảng 3.10: Đƣờng chuẩn alkaloid Error! Bookmark not defined Bảng 3.11: Giới hạn phát giới hạn định lƣợng alkaloid Error! Bookmark not defined Bảng 3.12: Độ lặp lại hiệu suất thu hồi Alkaloid mẫu thực phẩm chức nồng độ 50-500 µg/kg (0,05-0,5 mg/kg)Error! Bookmark not defined Bảng 3.13: Độ lặp lại hiệu suất thu hồi Alkaloid mẫu thực phẩm chức nồng độ 0,1-1 mg/kg Error! Bookmark not defined Bảng 3.14: Độ lặp lại hiệu suất thu hồi Alkaloid mẫu thực phẩm chức nồng độ 0,2-2 mg/kg Error! Bookmark not defined Bảng 3.15: Bảng kết phân tích mẫu thực Error! Bookmark not defined DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Chế độ ion hóa phun điện tử ESI Error! Bookmark not defined Hình 1.2: Cấu tạo phân tích khối tứ cực chập ba Error! Bookmark not defined Hình 3.1: Sắc đồ tỷ lệ ion koumin atropin Error! Bookmark not defined Hình 3.2: Sắc đồ ion tổng sử dụng hệ dung môi pha động 1Error! Bookmark not Bookmark not Bookmark not Bookmark not Bookmark not Bookmark not Bookmark not defined Hình 3.3: Sắc đồ ion tổng sử dụng hệ dung môi pha động 2Error! defined Hình 3.4: Sắc đồ ion tổng sử dụng hệ dung môi pha động 3Error! defined Hình 3.5: Sắc đồ ion tổng sử dụng hệ dung môi pha động 4Error! defined Hình 3.7: Sắc đồ ion tổng sử dụng chƣơng trình gradient 2Error! defined Hình 3.8: Sắc đồ ion tổng sử dụng chƣơng trình gradient 3Error! defined Hình 3.9: Sắc đồ ion tổng sử dụng chƣơng trình gradient 4Error! defined Hình 3.10: Sắc đồ ion tổng sử dụng chƣơng trình gradient 5Error! Bookmark not defined Hình 3.11: Sắc đồ ion tổng tốc độ dòng 0,6 mL/phút Error! Bookmark not defined Hình 3.13: Sắc đồ ion tổng tốc độ dòng 0,4 mL/phút Error! Bookmark not defined Hình 3.14: Biểu đồ phụ thuộc diện tích píc alkaloid vào nồng độ amoniacetat pha động Error! Bookmark not defined Hình 3.15: Sơ đồ quy trình chiế t mẫu dƣ̣ kiế n Error! Bookmark not defined Hình 3.16 : Biểu đồ ảnh hƣởng dung môi chiết đến hiệu suất chiết alkaloid Error! Bookmark not defined Hình 3.17 : Biểu đồ ảnh hƣởng dung dịch kiềm hóa đến hiệu suất chiết alkaloid Error! Bookmark not defined Hình 3.18 : Quy trình chiết mẫu tối ƣu Error! Bookmark not defined Hình 3.19 : Sắc đồ chuẩn alkaloid, mẫu trắng mẫu trắng thêm chuẩn Error! Bookmark not defined Hình 3.20: Mối tƣơng quan diện tích pic nồng độ Atropin khoảng 0,5100 ng/mL Error! Bookmark not defined Hình 3.21: Mối tƣơng quan diện tích pic nồng độ aconitin khoảng 51000 ng/mL Error! Bookmark not defined Hình 3.22: Đƣờng chuẩn Scopolamin (R2 = 0,9999) Error! Bookmark not defined Hình 3.23: Sắc đồ nicotin giới hạn phát LOD 1,0 µg/kg (S/N = 3,6) Error! Bookmark not defined Hình 3.24: Sắc đồ Brucin giới hạn định lƣợng LOQ 10 µg/kg (S/N = 11,5) Error! Bookmark not defined Hình 3.26: Sắc đồ atropin mẫu thực phẩm chức thêm chuẩn mức nồng độ 0,1 mg/kg Error! Bookmark not defined Hình 3.27: Sắc đồ scopolamin mẫu thực phẩm chức thêm chuẩn mức nồng độ 0,2 mg/kg Error! Bookmark not defined Hình 3.28: Sắc đồ mẫu phát brucin Error! Bookmark not defined Hình 3.29: Sắc đồ mẫu phát strychnin Error! Bookmark not defined BẢNG KÍ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt ACN Acetonitrile acetonitril Atmospheric pressure chemical Chế độ ion hóa áp suất khí ionization CE Collision energy Năng lƣợng va chạm ESI Eelectrospray ionization Chế độ ion hóa phun điện tử EU European Union Châu Âu HPLC High performance liquid Sắc ký lỏng hiệu cao APCI chromatography International Union of Pure and Liên minh quốc tế hóa học Applied Chemistry ứng dụng LD50 Lethal Dose Liều gây chết trung bình LOD Limit of deterction Giới hạn phát LOQ Limit of quantity Giới hạn định lƣợng MeOH Methanol Methanol ODS Octadecylsilan Octadecylsilan RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tƣơng đối SD Standard deviation Độ lệch chuẩn SPE Solid phase extraction Chiết pha rắn UPLC- Ultral performance liquid Sắc ký lỏng siêu hiệu kết MS/MS chromatography tandem mass nối khối phổ IUPAC spectrometry UV Ultraviolet Tử ngoại MỞ ĐẦU Việt Nam nƣớc nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, thuận lợi cho phát triển thực vật đƣợc coi kho tàng vô giá nguồn thuốc dƣợc liệu quý Trong alkaloid thành phần hoạt tính nhiều thuốc Alkaloid amin nguồn gốc tự nhiên thực vật tạo ra, nhƣng amin động vật nấm tạo đƣợc gọi alkaloid Cấu trúc bao gồm carbon, hydro, nitơ, thƣờng có oxy Các alkaloid bazơ hữu tƣơng tự nhƣ kiềm (bazơ vô cơ); tên có nghĩa nhƣ kiềm Alkaloid xuất chủ yếu chi khác thực vật có hạt, chẳng hạn nhƣ thuốc phiện thuốc lá, mã tiền… Chúng đƣợc tìm thấy hầu hết phận loại thực vật này, bao gồm lá, rễ, hạt, vỏ Mỗi phần thực vật thƣờng có chứa số chất hóa học liên quan đến alkaloid Chức alkaloids chuyển hóa thực vật chƣa đƣợc biết, nhƣng hầu hết alkaloid có ảnh hƣởng rõ rệt đến hệ thống thần kinh ngƣời động vật khác Trong số hàng trăm alkaloid đƣợc tìm thấy tự nhiên, có khoảng 30 chất đƣợc sử dụng thƣơng mại Một số alkaloid, chẳng hạn nhƣ nicotin, đƣợc sử dụng thuốc trừ sâu, số khác đƣợc sử dụng làm thuốc thử hóa học Tuy nhiên, alkaloid đƣợc sử dụng chủ yếu y học, chúng tác động cách nhanh chóng khu vực cụ thể hệ thần kinh Alkaloid thành phần hoạt tính nhiều thuốc gây mê, thuốc an thần, chất kích thích thuốc an thần Chúng đƣợc dùng đƣờng uống tiêm Ngoại trừ dƣới giám sát bác sĩ, sử dụng alkaloid nguy hiểm, hầu hết hình thành thói quen (ví dụ, gần nhƣ tất chất ma tuý alkaloid) dùng liều lƣợng lớn độc hại Trong dân gian ta thƣờng sử dụng thảo dƣợc nhƣ cà độc dƣợc, mã tiền, củ ấu tàu… dùng để chữa bệnh nhƣng loại có chứa hàm lƣợng không nhỏ chất độc nhóm alkaloid Hiện nay, số loại thực phẩm chức TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Trần Quốc Bình, Đỗ Thị Oanh (2011), "Góp phần nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu bán thành phẩm cà độc dƣợc sử dụng chế phẩm Camat", tạp chí Dƣợc học,421,tr.45-49 Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung (2007), Hóa học phân tích, phần 2: Các phương pháp phân tích công cụ, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Khoa dƣợc (2008), "Giáo trình dƣợc liệu", tập II, NXB ĐH Y Dƣợc TP.HCM Phạm Thanh Kỳ (1998), "Bài giảng dƣợc liệu", tập II, NXB Đại học Dƣợc Hà Nội Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học Phạm Luận (1998), Cơ sở lý thuyết phân tích sắc ký lỏng hiệu cao, ĐH Quốc Gia Hà Nội Lƣơng Thị Phấn (2014), Nghiên cứu định lượng đồng thời strychnin brucin huyết tương phương pháp HPLC, khóa luận tốt nghiệp, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà nội Nguyễn Văn Ri (2009), Giáo trình Các phương pháp tách, khoa Hóa học trƣờng Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội Nguyễn Đình Thành (2011), Cơ sở phương pháp phổ ứng dụng hóa học, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội 10 Tạ Thị Thảo (2010), Giáo trình Thống kê Hóa học phân tích, khoa Hóa học trƣờng Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội 11 Trần Thị Văn Thi, Trần Thanh Minh (2011), "Nghiên cứu phân lập nhận dạng cấu trúc alkaloid dịch chiết từ vông nem Thừa Thiên Huế", tạp chí Khoa học Đại học Huế, 65, tr.225-230 12 Mai Tất Tố, Nguyễn Thị Trâm (2007), Dược lý học tập 1, NXB Y học 13 Mai Tất Tố, Nguyễn Thị Trâm (2007), Dược lý học tập 2, NXB Y học 14 Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội (2001), Dược liệu, Nhà xuất Y học 15 TS Đỗ Thị Tuyên Viện CNSH Việt Nam , Bài giảng công nghệ tách chiết hợp chấ t thứ sinh 16 Viện dƣợc liệu (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập I, NXB khoa học kỹ thuật 17 Viện dƣợc liệu (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập II, NXB khoa học kỹ thuật 18 Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia (2010), "Thẩm định phƣơng pháp phân tích hóa học & vi sinh vật", NXB Khoa học Kỹ thuật Tiếng Anh 19 AOAC International (2007), How to meet ISO 17025 requirements for method verification, USA 20 Borbla Boros, Agnes Farkas, Silvia Jakabova, Ivett Bacskay (2000), “LC-MS Quantitative Deterrmination of Atropine and Scopolamine in the Floral Nectar of Datura Species”, Journal of Chromatographia, 58, 1–37 21 Dirk Steinmann, Markus Ganzera (2011), “Recent advances on HPLC/MS in medicinal plant analysis”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 55, 744-757 22 Hua-Tao Feng, Sam F.Y Li (2002), “Deterrmination of five toxic alkaloids in two common herbal medicines with capillary electrophoresis”, Journal of Chromatography A, 1-2, 243–247 23 Huiqin Wu, Xiaoting Xiong, Xiaolan Huang, Zhixin Zhu (2013), “ Simultaneous deterrmination of 17 toxic alcaloids in human fluids by liquid chromatography coupled whith electrospray ionization tandem mass spectrometry”, Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, 36:9, 1149-1162 24 Goodman, L (2006), “Goodman & Gilman's the pharmacological basis of therapeutics” (11 ed.), New York: McGraw-Hill 25 José Diana Di Mavungu, Svetlana V Malysheva, Melanie Sanders, Daria Larionova (2012), “Development and validation of a new LC–MS/MS method for the simultaneous deterrmination of six major ergot alcaloids and their corresponding epimers Application to some food and feed commodities”, Food Chemistry, 135, 292–303 26 Miao Li, Xiao-Fang Holi, Jie Zhang, Si-Cen Wang, Qiang Fu, Lang-Chong He (2011), “Applications of HPLC/MS in the analysis of traditional Chinese medicines”, Journal of Pharmacertical Analysis, 1:2, 81- 91 27 Lounasmaa M.; Tamminem T.(1993), The Alkaloids, Academic Press: New York, 114 28 Peihong Qiu, Xiaohong Chen, Xiang Chen (2008), “Simultaneous deterrmination of five toxic alkaloids in body fluids by high-performance liquid chromatography coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry”, Journal of Chromatography B, 875(2), 471–477 29 R.E Ardrey (2003), “Liquid chromatography-mass spectrometry: an introduction”, New York, J Wiley 30 Somenath Mitra (2003), “Sample Preparation Techniques in Analytical Chemistry’’, John Wiley & Sons 31 Tadeusz Aniszewski (2012), Alcaloids - Secrets of Life, Alkaloid Chemistry, Biological Significance and applications and ecological Role, Elsevier Science 32 Xie Y, Jiang ZH, Zhou H, Xu HX, Liu L (2005), “ Simultaneous deterrmination of six Aconitum alkaloids in proprietary Chinese medicines by high-performance liquid chromatography’’, Journal Chromatography A, 1093(1-2), 195-203 33 Kang XQ1, Fan ZC, Zhang ZQ (2010), “Simultaneous deterrmination of three Aconitum alkaloids in six herbal medicines by high-performance liquid chromatography”, Journal Chromatography Science, 48(10),860-865 34 Yu L, Xu Y, Feng H, Li SF (2005), “Separation and deterrmination of toxic pyrrolizidine alkaloids in traditional Chinese herbal medicines by micellar electrokinetic chromatography with organic modifier’’, Electrophoresis, 26(17), 397-404