Tách và xác định một số độc tố nhóm alkaloid trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --- ĐỖ THỊ THU HẰNG TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐỘC TỐ NHÓM ALKALOID TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI P

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

ĐỖ THỊ THU HẰNG

TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐỘC TỐ NHÓM ALKALOID TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

LỎNG KHỐI PHỔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2015

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

ĐỖ THỊ THU HẰNG

TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐỘC TỐ NHÓM ALKALOID TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

LỎNG KHỐI PHỔ

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã Số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người Hướng Dẫn Khoa Học: PGS TS Lê Thị Hồng Hảo

Hà Nội – 2015

MỞ ĐẦU

Việt Nam là nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, rất thuận lợi cho sự phát triển của thực vật và đây được coi là một kho tàng vô giá về nguồn cây thuốc và dược liệu quý Trong đó alkaloid là những thành phần hoạt tính chính của nhiều cây thuốc Alkaloid là amin nguồn gốc tự nhiên do thực vật tạo ra, nhưng các amin do động vật và nấm tạo ra cũng được gọi là các alkaloid Cấu trúc bao gồm carbon, hydro, nitơ, và thường có oxy Các alkaloid là bazơ hữu cơ tương tự như kiềm (bazơ

vô cơ); tên có nghĩa là như kiềm Alkaloid xuất hiện chủ yếu trong các chi khác nhau của thực vật có hạt, chẳng hạn như cây thuốc phiện và cây thuốc lá, mã tiền… Chúng có thể được tìm thấy trong hầu hết các bộ phận của các loại thực vật này, bao gồm cả lá, rễ, hạt, và vỏ cây Mỗi một phần của thực vật thường có chứa một số chất hóa học liên quan đến alkaloid Chức năng của alkaloids trong chuyển hóa thực vật chưa được biết, nhưng hầu hết các alkaloid có ảnh hưởng rõ rệt đến hệ thống thần kinh của người và động vật khác Trong số hàng trăm alkaloid được tìm thấy trong tự nhiên, chỉ có khoảng 30 chất được sử dụng thương mại Một số alkaloid, chẳng hạn như nicotin, được sử dụng trong thuốc trừ sâu, và một số khác được sử dụng làm thuốc thử hóa học Tuy nhiên, các alkaloid được sử dụng chủ yếu trong y học, bởi vì chúng có thể tác động một cách nhanh chóng trên các khu vực cụ thể của

hệ thần kinh Alkaloid là những thành phần hoạt tính chính của nhiều thuốc gây mê, thuốc an thần, các chất kích thích và thuốc an thần Chúng được dùng bằng đường uống và tiêm Ngoại trừ dưới sự giám sát của bác sĩ, sử dụng các alkaloid là nguy hiểm, bởi vì hầu hết hình thành thói quen (ví dụ, gần như tất cả các chất ma tuý là alkaloid) và dùng liều lượng lớn có thể là độc hại

Trong dân gian ta thường sử dụng các cây thảo dược như cà độc dược, mã tiền, củ ấu tàu… dùng để chữa bệnh nhưng trong các loại cây này có chứa một hàm

lượng không nhỏ các chất độc nhóm alkaloid Hiện nay, một số loại thực phẩm chức năng có nguồn gốc thảo dược cũng sử dụng các loại cây này hoặc có thành phần được chiết xuất từ cây thuốc có các hoạt chất như các alkaloid, terpenoid, phenolic… được biết đến như là các hợp chất thứ cấp Sử dụng các loại thực phẩm chức năng này có thể là con dao hai lưỡi, dùng với liều lượng vừa phải có tác dụng chữa một số bệnh song dùng không đúng cách hoặc quá liều có thể dẫn đến ngộ độc hoặc các biến chứng Vì vậy sử dụng những thực phẩm chức năng có chứa các alkaloid độc này phải cẩn trọng và phải được sự quản lý và cho phép của các cơ quan chức năng Tuy nhiên, ở Việt Nam việc xác định đồng thời các alkaloid đô ̣c trong thực phẩm chức năng vẫn chưa được nghiên cứu Do vậy, để góp phần kiểm soát các nguy cơ tiềm ẩn để đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng và giúp cơ quan chức năng quản lý đưa ra các khuyến cáo nhằm giảm nguy cơ ngộ độc do sử dụng

các thực phẩm chức năng có ngồn gốc thảo dược Chúng tôi đã tiến hành đề tài:

“Tách và xác định một số độc tố nhóm alkaloids trong thực phẩm chức năng

bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ ”

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về nhóm alkaloid

1.1.1 Lịch sử phát hiện

Năm 1804- 1805, các nhà hóa học Pháp và Đức đã phân lập được morphin

và điều chế được dạng muối của nó Đồng thời đã chứng minh được morphin là hoạt chất chính của cây thuốc phiện có tác dụng sinh lý rõ rệt Năm 1980, từ vỏ cây canhkina, đã chiết và kết tinh được một chất đặt tên là “cinchonino” sau đó hai nhà hóa học Pháp đã xác định cinchonino là hỗn hợp của hai alkaloid là quinin và cinchonin Năm 1918, phát hiện ra alkaloid của hạt mã tiền là strychnin và brucin; phát hiện ra cafein trong chè, cà phê Sau đó tiếp tục phát hiện ra nicotin trong thuốc

lá, atropin trong cà độc dược, theobromin trong cacao, codein trong thuốc phiện, cocain trong lá coca Giữa năm 1973, người ta đã xác định được 4959 alkaloid khác nhau trong đó có 3293 chất đã xác định được công thức hóa học Hiện nay đã phát hiện ra được rất nhiều alkaloid và cũng đã được đưa vào ứng dụng trong y học ngày một tăng [15]

1.1.2 Khái quát về nhóm alkaloid

1.1.2.1 Khái niệm

Alkaloid có nguồn gốc từ chữ: alcali tiếng Ả rập là kiềm Alkaloid là:

- Những hợp chất hữu cơ có chứa dị vòng nitơ, có tính bazơ thường gặp ở trong nhiều loài thực vật và đôi khi còn tìm thấy trong một vài loài động vật

- Có phản ứng kiềm cho các muối với acid và các muối này dễ kết tinh

- Có hoạt tính sinh học rất quan trọng

- Có một số phản ứng chung là tạo “tủa“ cần thiết cho sự xác định chúng Chúng là một nhóm hợp chất thiên nhiên quan trọng về nhiều mặt Đặc biệt trong lĩnh vực y học, chúng cung cấp nhiều loại thuốc có giá trị chữa bệnh cao và độc đáo [15] [16]

1.1.2.2 Cấu tạo hóa học

Về mặt hóa học, sự phong phú và đa dạng của alkaloid đã trở thành một

chuyên nghành, chiếm một vị trí quan trọng trong lĩnh vực nghiên cứu và trong tạp chí thông tin về hóa học Đối với việc nghiên cứu alkaloid còn quan trọng hơn bởi

vì chúng có trong hệ thực vật nhiệt đới phong phú là nguồn cung cấp alkaloid chủ yếu Về mặt cấu trúc hóa học, chúng có ít nhất 1 nguyên tử N trong phân tử, chủ yếu nằm trong vòng Sự có mặt của nguyên tử của N trong cấu trúc quyết định tính bazơ của alkaloid và là chỗ dựa rất quan trọng cho các nhà hóa học trong nghiên cứu alkaloid [15]

1.1.2.3 Phân loại

Các alkaloid đã biết có đến trên 250 dạng cấu trúc khác nhau với hơn 5.500

hợp chất alkaloid trong tự nhiên Vì vậy cách phân loại dựa vào cấu trúc nhân cơ bản trước đây (khoảng 20 nhóm cấu trúc) chưa đáp ứng được nên ngày càng có xu hướng chia chúng thành những nhóm nhỏ: nhóm alkaloid Ecgotamia, Harmin, Yohimbin, Strychnin, Echitamin Nhóm alkaloid có nhân isoquinolin được chia thành các nhóm: Benzyliaoquinolin, Apocphin, Protobecberin, Benzophenanthridin…Có ý kiến xếp các hợp chất có N ngoài vòng như Colchicin, Hordenin, là các protoalkaloid [15] [27]

1.1.2.4 Sự phân bố

Cromwell (1995) ước tính alkaloid phân bố trong khoảng 1 phần 7 loài thực

vật có hoa Một ước tính khác (Hegnauer, 1963) cho rằng alkaloid có từ 12%-20% trong tổng số cây có nhựa Còn Willaman và Schubert (1955) thì cho rằng trong hơn

300 họ của nghành hạt kín thì 1/3 họ có chứa alkaloid Nhiều tổng kết cho thấy đại

đa số cây có chứa alkaloid là cây hai lá mầm Chỉ có một số ít cây chứa alkaloid là cây 1 lá mầm và nghành hạt trần Theo thống kê đến nay thì cây thuộc thảo và cây bụi có nhiều alkaloid hơn cây gỗ, và trọng lượng phân tử của alkaloid trong cây gỗ

thường bé hơn trọng lượng phân tử cây thuộc thảo Cây một năm có nhiều alkaloid hơn cây lưu niên (Levin, 1976) Alkaloid không có trong loài sống ở nước ngoại trừ

họ sen (Nympheaceae) (Mc.Nair.1943) Thực ra rất nhiều loài có alkaloid nhưng chỉ

ở mức độ dạng vết hoặc ở tỷ lệ phần vạn, mười vạn Để giới hạn với ý nghĩa thực tiễn, một cây được xem là có alkaloid phải chứa ít nhất là 0.05% alkaloid so với dược liệu khô Mối liên quan giữa alkaloid với các chất khác trong 1 cây cũng đã được nghiên cứu Cây có chứa alkaloid đều vắng mặt tinh dầu và ngược lại (Trelibs,1955) [27]

1.1.2.5 Tính chất

Alkaloid là các bazơ yếu, do sự có mặt của nguyên tử N Nhưng độ kiềm

của alkaloid không giống nhau do ảnh hưởng khác nhau của lớp điện tích nguyên tử

N gây ra và ảnh hưởng của các nhóm chức khác Nói chung tính bazơ giảm dần theo thứ tự amoni bậc 4, amoni bậc 1, amoni bậc 2, amoni bậc 3

Hầu hết các alkaloid bazơ thực tế không tan trong nước nhưng tan trong các dung môi hữu cơ như CHCl3, eter và các ancol bậc thấp (methanol, ethanol, butanol) Một số nhóm alkaloid có thêm các nhóm phân cực nên tan được một phần trong nước hoặc trong kiềm Ví dụ: Morphine, Cephalin, do có nhóm OH phenol nên tan trong dung dịch kiềm và các bazơ của chúng thì gần như là không tan trong eter Ngược lại với bazơ, các muối alkaloid nói chung tan được trong nước và cồn nhưng hầu như không tan trong dung môi hữu cơ như: CHCl3, eter, benzene Có một số trường hợp ngoại lệ như Ephedrin, Cochicin, Ecgovonin, các bazơ của chúng tan được trong nước nhưng cũng khá tan trong dung môi hữu cơ và các muối của chúng thì ngược lại Alkaloid có N – Bậc 4 và N – oxide bazơ của alkaloid có N – Bậc 4 và N – oxide khác tan trong nước và trong kiềm ít tan trong dung môi hữu

cơ Các muối của chúng có độ hòa tan khác nhau tùy thuộc vào gốc acid tạo ra chúng Vì vậy có thể chiết chúng bằng dung dịch kiềm và kết tủa dưới dạng muối có

độ hòa tan thấp nhất Đối với các alkaloid N – oxide thì dùng phản ứng khử Oxy

bằng bột kẽm trong môi trường HCl để chúng chuyển thành alkaloid dạng thường sau đó kết tủa bằng kiềm và chiết bằng dung môi hữu cơ [14]

1.1.3 Cấu tạo của một số alkaloid độc

Bảng 1.1 Cấu trúc hoá học của một số alkaloid độc được xác định trong đề tài

STT

phân tử

Khối lượng phân tử (g/mol)

1

Brucin

10,11-Dimethoxystrychnine

C23H26N2O4 394,46 8,28

2

Strychnin

(4aR,5aS,8aR,13aS,15aS,

15bR)-4a,5,5a,7,8,13a,15,15a,15

b,16-decahydro-2H-4,6-

methanoindolo[3,2,1-

ij]oxepino[2,3,4-

de]pyrrolo[2,3-h]quinoline-14-one

C21H22N2O2 334,41 8,26

3

Aconitin

Acetylbenzoylaconine

C34H47NO11 645,74 5,88

4

Atropin

(RS)-(8-Methyl-8-azabicyclo[3.2.1]oct-3-yl)

3-hydroxy-2-phenylpropanoate

C17H23NO3 289,37 4,35

5

Scopolamin

(–)-(S)-3-hydroxy-2-phenylpropionic

acid(1R,2R,4S,7S,9S)-9-

methyl-3-oxa-9-azatricyclo[3.3.1.02,4]no

n-7-yl ester

C17H21NO4 303,35 7,75

6

Koumin

7,20(2H,19H)-Cyclovobasan,

1,2,18,19-

tetradehydro-3,17-epoxy-, (3Rtetradehydro-3,17-epoxy-,7alphatetradehydro-3,17-epoxy-,20alpha)-

C20H22N2O 306,41 _

7

Colchicin

N-[(7S)-1,2,3,10-

Tetramethoxy-9-oxo-

5,6,7,9-tetrahydrobenzo[a]heptal

en-7-yl]acetamide

C22H25N O6 399,44 12,35

8

Nicotin

(−)-1-Methyl-2-(3-

pyridyl)pyrrolidine,(S)-3-(1-Methyl-2-pyrrolidinyl)

pyridine

C10H14N2 162,23 8,5

1.1.4 Tác dụng và độc tính của một số alkaloid

Các chất trong nghiên cứu này thuộc nhóm alkaloid chúng có tác dụng lên hệ thần kinh, tim mạch và hô hấp [3] [12] Khi dùng với hàm lượng nhỏ chúng có tác dụng chữa bệnh nhưng khi dùng với hàm lượng lớn gây ngộ độc có thể dẫn đến tử vong vì đây đều là các alkaloid độc Bảng 1.2 giới thiệu giá trị LD50 (liều lượng chất độc gây chết cho một nửa số cá thể trong nghiên cứu) [24]

Bảng 1.2 Các giá trị LD50 của các chất phân tích

uống (mg/kg)

LD 50 trên chuột đường tiêm (mg/kg)

1.1.4.1 Brucin và strychnin

Brucin và strychnin đều là alkaloid đắng, brucin có liên quan chặt chẽ với

strychnin Hai chất này xuất hiện ở một số loài thực vật, được biết đến nhiều nhất là alkaloid chính trong vỏ, lá, hạt cây mã tiền được tìm thấy ở Đông Nam Á Hạt chứa khoảng 1,5% strychnin, còn hoa khô chứa khoảng 1,023 %, ngay cả vỏ cây cũng chứa các hợp chất độc, bao gồm cả brucin [5] Strychnin là một alkaloid không màu, ít tan trong dầu lửa và trong nước, không tan trong ethyl eter Strychnin trích

từ hạt cây mã tiền hay nhân, rất độc, chất strychnin được ghi vào bảng A của các dược điển

Trong y học dân gian, mã tiền dùng như thuốc bổ lành bệnh và kích thích sự thèm ăn và là một loại thuốc vi lượng đồng căn, được dùng cho những vấn đề tiêu hóa thông thường, nhạy cảm với nhiệt độ lạnh, cáu kỉnh khó chịu và sử dụng như thuốc bổ cho hệ thống tuần hoàn trường hợp bị chứng suy tim

Strychnin dạng tinh thể sử dụng làm thuốc trừ sâu, đặc biệt là để giết chết động vật có xương sống nhỏ như các loài chim và động vật gặm nhấm Strychnin gây co giật cơ bắp và cuối cùng chết vì ngạt

ÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt

1 Trần Quốc Bình, Đỗ Thị Oanh (2011), "Góp phần nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu và bán thành phẩm cà độc dược sử dụng trong chế phẩm Camat", tạp chí Dược học,421,tr.45-49

2 Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung (2007),

Hóa học phân tích, phần 2: Các phương pháp phân tích công cụ, Nhà xuất bản

Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội

3 Khoa dược (2008), "Giáo trình dược liệu", tập II, NXB ĐH Y Dược TP.HCM

4 Phạm Thanh Kỳ (1998), "Bài giảng dược liệu", tập II, NXB Đại học Dược Hà Nội

5 Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học

6 Phạm Luận (1998), Cơ sở lý thuyết phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao, ĐH

Quốc Gia Hà Nội

7 Lương Thị Phấn (2014), Nghiên cứu định lượng đồng thời strychnin và brucin trong huyết tương bằng phương pháp HPLC, khóa luận tốt nghiệp, Trường

Đại học Dược Hà nội

8 Nguyễn Văn Ri (2009), Giáo trình Các phương pháp tách, khoa Hóa học

trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội

9 Nguyễn Đình Thành (2011), Cơ sở các phương pháp phổ ứng dụng trong hóa học, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội

10 Tạ Thị Thảo (2010), Giáo trình Thống kê trong Hóa học phân tích, khoa Hóa

học trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội

11 Trần Thị Văn Thi, Trần Thanh Minh (2011), "Nghiên cứu phân lập và nhận dạng cấu trúc alkaloid trong dịch chiết từ lá vông nem Thừa Thiên Huế", tạp chí Khoa học Đại học Huế, 65, tr.225-230

12 Mai Tất Tố, Nguyễn Thị Trâm (2007), Dược lý học tập 1, NXB Y học

13 Mai Tất Tố, Nguyễn Thị Trâm (2007), Dược lý học tập 2, NXB Y học

14 Trường Đại học Dược Hà Nội (2001), Dược liệu, Nhà xuất bản Y học

15 TS Đỗ Thị Tuyên Viện CNSH Việt Nam , Bài giảng công nghệ tách chiết các hợp chất thứ sinh

16 Viện dược liệu (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập I,

NXB khoa học kỹ thuật

17 Viện dược liệu (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập II,

NXB khoa học kỹ thuật

18 Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia (2010), "Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học & vi sinh vật", NXB Khoa học và Kỹ thuật

Tiếng Anh

19 AOAC International (2007), How to meet ISO 17025 requirements for method verification, USA

20 Borbla Boros, Agnes Farkas, Silvia Jakabova, Ivett Bacskay (2000), “LC-MS Quantitative Deterrmination of Atropine and Scopolamine in the Floral Nectar

of Datura Species”, Journal of Chromatographia, 58, 1–37

21 Dirk Steinmann, Markus Ganzera (2011), “Recent advances on HPLC/MS in

medicinal plant analysis”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 55, 744-757