Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens cho nấm sợi Aspergillus oryzae

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC Nguyễn Thị Khuyến NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG CHUYỂN GEN BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens CHO NẤM SỢI Aspergillus oryzae Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Trần Văn Tuấn Hà Nội - 2016 MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung nấm sợi Aspergillus oryzae 1.1.1 Đặc điểm sinh học nấm sợi Aspergillus oryzae 1.1.2 Đặc điểm di truyền nấm sợi A oryzae 1.1.3 Vai trò nấm sợi A oryzae 1.1.4 Ph}n biệt Aspergillus oryzae với Aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin 1.2 C|c phương ph|p chuyển gen v{o nấm sợi 12 1.2.1 Phương ph|p chuyển gen sử dụng tế b{o trần (protoplast) 12 1.2.2 Kỹ thuật chuyển gen xung điện (electroporation) 13 1.2.3 Phương ph|p chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens (ATMT) 13 1.2.4 Marker sử dụng chọn lọc c|c chủng chuyển gen 17 1.2.5 Một số gen thị dùng chuyển gen vi nấm 19 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 23 2.1 Nguyên liệu 23 2.1.1 Chủng vi sinh vật 23 2.1.2 Thiết bị v{ hóa chất 25 2.1.3 Môi trường sử dụng nghiên cứu 28 2.2 Phương ph|p nghiên cứu 28 2.2.1 Thu nhận b{o tử nấm 29 2.2.2 T|ch chiết DNA, RNA v{ tổng hợp cDNA 29 2.2.3 Quan s|t hình th|i v{ kiểm tra số đặc điểm sinh lý sinh hóa 30 2.2.4 Ph}n biệt A oryzae v{ A Flavus c|c kỹ thuật sinh học ph}n tử 31 2.2.5 Tạo c|c vector nhị thể dùng cho chuyển gen 32 2.2.6 Chuyển gen v{o nấm sợi A oryzae Error! Bookmark not defined Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined 3.1 X|c nhận chủng A oryzae an to{n để sử dụng cho chuyển gen Error! Bookmark not defined 3.1.1 Ph}n biệt c|c chủng A oryzae an to{n v{ chủng Aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin Error! Bookmark not defined 3.1.2 Lựa chọn chủng A oryzae phục vụ cho chuyển gen Error! Bookmark not defined 3.2 Lựa chọn marker chuyển gen v{o A oryzae Error! Bookmark not defined 3.3 X}y dựng hệ thống chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens Error! Bookmark not defined 3.3.1 Xóa gen pyrG để tạo chủng đột biến trợ dưỡng uridine/uracil Error! Bookmark not defined 3.3.2 Tạo số vector nhị thể dùng cho chuyển gen v{o A oryzae trợ dưỡng uridine/uracil Error! Bookmark not defined 3.4 Đ|nh gi| hiệu hệ thống chuyển gen với gen huỳnh quang GFP v{ DsRed Error! Bookmark not defined 3.4.1 Chuyển gen GFP v{ DsRed v{o nấm sợi A oryzae trợ dưỡng uridine/uracil Error! Bookmark not defined 3.4.2 X|c nhận c|c thể chuyển gen Error! Bookmark not defined 3.5 Ứng dụng hệ thống chuyển gen thiết lập để biểu gen phyA m~ hóa enzyme phytase A fumigatus A oryzae Error! Bookmark not defined KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Error! Bookmark not defined TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 MỞ ĐẦU Aspergillus oryzaelà loài nấm sợi sử dụng rộng rãi sản xuất thực phẩm truyền thống đồ uống nhiều nước châu Á bao gồm Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc, Việt Nam, Thái Lan, Malaysia Philippines Loài nấm Cục Quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) công nhận an toàn (GRAS) Ở Việt Nam, A oryzae sử dụng để sản xuấttương truyền thống số địa phương tỉnh phía Bắc.A oryzae có khả tiết lượng lớn enzyme khác vào môi trường Do đó, loài nấm sử dụng nhà máy tế bào để sản xuất thương mại nhiều loại enzyme protein dạng tự nhiên tái tổ hợp Gần chủng A oryzae RIB40 dùng sản xuất công nghiệp Nhật Bản giải trình tự toàn hệ gen Sự hiểu biết tường tận hệ gen A oryzae mở nhiều hội cải biến di truyền biểu gen loài nấm sợi an toàn Hiện nay, hai phương pháp phổ biến chuyển gen vào nấm sợi chuyển gen qua tế bào trần chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Tuy nhiên việcchuyển gen vào nấm sợiA oryzaecho đến sử dụng phương pháp chuyển gen qua tế bào trần.Phương pháp tương đối phức tạp tốn kém, khó thực điều kiện phòng thí nghiệm Việt Nam Phương pháp chuyển gen sử dụng vi khuẩn A tumefaciens đơn giản với chi phí hợp lý Tuy nhiên chưa có nghiên cứu báo cáo việc chuyển gen thành công nấm sợi A oryzae Bên cạnh đó, A oryzaecókhả kháng lại hầu hết hợp chất kháng sinh thường sử dụng cho chuyển gen.Do phát triển chủng A oryzae trợ dưỡngđể sử dụng cho chuyển gen giải pháp để cải biến di truyền biểu gen ởA oryzae Với mục đích xây dựng hệ thống chuyển genhiệu cho nấm sợi A oryzae thông quavi khuẩn A tumefaciensnhằm phục vụ hướng nghiên cứu bền vững biểu enzyme/protein tái tổ hợp loài nấm này, thực đề tài“Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens cho nấm sợi Aspergillus oryzae” với nội dung sau: - Xác nhận chủng A oryzae an toàn, sử dụng làm đối tượng chuyển gen - Tạo chủng A oryzae đột biến trợ dưỡng uridine/uracil cách xóa gen pyrG - Tạomột số vector nhị thể (binary vector) sử dụng cho chuyển gen biểu gen nấm sợi A oryzae - Đánh giá hiệu hệ thống chuyển gen sử dụng gen thị huỳnh quangGFP vàDsRed - Bước đầu ứng dụng hệ thống chuyển gen tạođược để biểu gen phyA mã hóa enzyme phytase từ nấm sợi Aspergillus fumigatus Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung nấm sợiAspergillus oryzae 1.1.1 Đặc điểm sinh học nấm sợiAspergillus oryzae Nấm sợiA oryzae thuộc phân nhóm Flavicủachi Aspergillus, họTrichocomaceae A oryzae có cấu tạo đa bào, nuôi cấy môi trường đĩa thạch,hệ sợicó màu trắng xámsau phát triển chuyển sang màu vàng nhạt đến xanh Hệ sợi nấm A oryzae sinh trưởng nhanh phân mảnh, chiều ngang có kích thước 5-7 µm Trên sợi hình thành cấu trúc sinh sản vô tính, gọi cuống sinh bào tử Cuống sinh bào tử A oryzae thường dài 1-2 mm Trên cuống phồng lên tạo thành bọng, từ bọng mọc lên tế bào nhỏ, thuôn dài hình chai, xếp sát nhau, gọi thể bình; thể bình có đính chuỗi bào tử màu vàng lục hay màu vàng hoa cau (còn gọi bào tử đính)[31, 53, 80, 99] Hình thái khuẩn lạc cuống sinh bào tử nấm sợi A oryzae Machida cộng sựmô tả chi tiết Hình 1.1 Hình 1.1.Hình thái khuẩn lạc cấu trúc cuống sinh bào tử nấm sợi Aspergillus oryzae RIB40[53] Nấm sợiA oryzae sinh trưởng tốt nhiệt độ 30ºC-40ºC, chúng sinh trưởng phát triển dễ dàng nhiều loại chất khác mảnh vụn thực vật, lá, gỗ mục nát, loại hạt, thức ăn gia súc A oryzae phân bố rộng rãi toàn giới, đặc biệt phổ biếnở nước nhiệt đới Trong trình sinh trưởng phát triển, A oryzae tiết môi trường lượng lớn enzyme thủy phân cellulase, pectinase, xylanase, amylase, protease, glucoamylase[36, 53] 1.1.2.Đặc điểm di truyền nấm sợi A oryzae Gần đây, chủng A oryzaeRIB40 sử dụngtrong công nghiệp sản xuất thực phẩm lên men truyền thống Nhật Bản giải trình tự toàn hệ gen, theo hệ gencủa A oryzaegồm nhiễm sắc thể với tổng kích thước 37 megabase (Mb), dự đoán có 12.074 gen mã hóa protein, lớn 25%-30% so với loài khác thuộc chi Aspergillus Chẳng hạn,hệ gen A oryzae lớn loài A nidulans(loài chuẩn dùng cho nghiên cứu phòng thí nghiệm) A fumigatus(tác nhân gây bệnh hội người) 29% 34%[53].Hệ gencủa A oryzae lớn hơnchủ yếu thu nạp thêm DNA trình tiến hóa Việc mở rộng kích thước hệ gen dường đặc trưng cho loài có quan hệgần gũi với A oryzaenhư A niger A flavus, loài cókích thước hệ gen tương đương Đặc biệt loài có quan hệ gần gũi với A oryzae A flavuscó độ tương đồng DNA đến 99,5%[2, 53, 85] A oryzae có khả phân giải mạnh nhiều loại chất có tự nhiêndo loài sở hữu gen mã hóa enzyme thủy phân khác Các loàiA oryzae, A fumigatusvà A nidulans chứa 135, 99 90 gen mã hóa cho protease, chiếm khoảng 1% tổng số gen hệ gen Tất gen mã hóa protease tìm thấy A fumigatus và/hoặcA nidulansđều có mặt A oryzae, nhiêncác gen mã hóa sốenzyme aminopeptidase có mặt trongA oryzaelại mặt hệ gen củaA fumigatus A nidulans Ngoài ra,A oryzaecòn sở hữu thêm nhiều gen mã hóa protease tiết có khả hoạt động môi trường có tính axit Sự gia tăng protease hoạt động pH axit củaA oryzaecó thể hình thành trình hóa người [53].Sự hiểu biết tường tận hệ gen Aspergillus oryzae mở nhiều hội nghiên cứu cải biến di truyền ứng dụng loài nấm an toàn sản xuất sản phẩm nhằm phục vụ mục đích người 1.1.3 Vai trò nấm sợiA.oryzae Nấm sợiA oryzaeđược hóa từ 2000 năm trước sử dụng rộng rãitrong sản xuất thực phẩmởNhật Bản, Trung Quốc nước Đông Á lên men đậu nành, làm nước sốt, tương số đồ uống có cồn huangjiu, sake, makgeolli shochu[4, 36, 111] A oryzae sử dụng rộng rãi thực phẩm đặc tính sinh trưởng nhanh,tiết lượng lớn enzyme thủy phânnhư amylase, glucoamylase, carboxypeptidase, protease trình sinh trưởng tạo mùi thơm dễ chịu cho sản phẩm lên men[37].Trong lên men truyền thống, A oryzae thường nuôi ởmôi trường rắn, điều kiện thích hợp cho phát triển hiếu khí sợi nấm Độ ẩm thích hợp trình lên men môi trường rắn giúp tăng khả sản sinh enzyme chất chuyển hóa mà thường không sản xuất điều kiện lên men lỏng[99] Ngoài vai trò sản xuất thực phẩm truyền thống, nấm sợi A oryzae sử dụng số ngành công nghiệp sản xuất enzyme có giá trị kinh tế cao glucoamylase, α-amylase số protease phục vụ sản xuất bánh kẹo, đồ uống Glucoamylase α-amylase thuộc nhóm enzyme amylase, chiếm tới gần 20% tổng sản lượng enzyme sản xuất, đóchủ yếu sản xuất bởinấm sợiA oryzae[16, 81, 98, 113].Nguồn cung cấp enzyme protease cho công nghiệp sản xuất thực phẩm chất tẩy rửa đến từ loài nấm sợi thuộc chi Conidiobolus, Verticillium, Penicillium Aspergillus, phải kể đến loài sinh protease cao A oryzae[1, 106] Bên cạnh lợi ích kinh tế, A oryzae coi vi sinh vật mô hình dùng cho nghiên cứu biểu enzyme protein tái tổ hợp Ngoài nghiên cứu chuyển gen hỗ trợ việctìm chức vai trò gen mới[54] 1.1.4 Phân biệt Aspergillus oryzae vớiAspergillus flavussinh độc tố aflatoxin Hiện nay, tỷ lệ người mắc bệnh ung thư tăng lên ngày tăng cao Một nguyên nhân ăn phải thực phẩm chứa chất gây ung thư, cóđộc tố nấm aflatoxin Độc tố aflatoxin sinh nấmmốcAspergillus flavusvà Aspergillus parasiticustrên loại hạt nông sản quan trọng không bảo quản tốt gạo,lạc, ngô, đậu tương Hình thái củaA flavusgần giống hệtvới loàiA oryzaemà thường sử dụng ngành công nghiệp thực phẩm[17, 26, 80] A flavusvà A oryzaelà hai loài thuộc phân nhóm Flavi chi Aspergillus Tương tự A oryzae, nấm sợi A flavus có khả tồn nhiệt độ từ 12ºC đến 48ºC sinh trưởng tối ưu 28ºC đến 37ºC Hầu hết chu trình sống A flavus tồn dạng hệ sợi sinh sản bào tử đính.Giống với số chủng A oryzae, điều kiện bất lợi, sợi nấm A flavus chuyển thành cấu trúc đặc biệt gọi hạch nấm (sclerotia) Hạch nấm giúp chúng tồn điều kiện khắc nghiệt Khi điều kiện trở nên thuận lợi, hạch nấm sẽphát triển thành dạng sợi vàtừ sinh cuống mang bào tử đính, phát tán môi trường đất không khí [17, 26] Trong tự nhiên, khó để phân biệt hai loài A oryzae A flavus hình thái giống nhau.Hơn nữa,khi giải trình tự hai chủng đại diện cho hai loài, nhận thấy genome chủng A oryzae RIB40 A flavus NRRL 3357 có độ tương đồng 99,5% DNA 98% protein [85] Phân tích tiến hóa số chủng thuộc hai chi này, nhận thấyA flavus A oryzaecó mức độ tương đồng tùy thuộc vào chủng Ví dụ hai chủngA flavusSRRC 1357 SRRC 2112có mối quan hệ gần gũi với A oryzae chủngA flavus khác, có nhiều đặc điểm A oryzae (Hình 1.2) Từ liệu hệ gen, A oryzaeđược cho có nguồn gốc phát sinh từ loài A flavus[18] Hình 1.2.Mối quan hệ phát sinh loài khác biệt hệ gen củaA oryzae A flavus (màu xanh lam A oryzae, màu xanh A flavus)[18] A oryzaekhác với A flavus việc khả sinh độc tốaflatoxin trình sinh trưởngdo trình tiến hóa tích lũy nhiều đột biến điểm đột biến đoạn số gen liên quan đến sinh tổng hợp aflatoxin[8] Con đường sinh tổng hợp aflatoxin bắt nguồn từ axit norsolorinic (NOR), trải qua 23 trình chuyển hóa trung gian, nhờ enzyme mã hóa 25 gen nằm vùng DNA kích thước 70 kb để tạo thành aflatoxin có độc tính cao aflatoxin B1 (AFB1)[47, 97, 112] Các bước chuyển hóa thực enzyme có chức riêng biệt Các gen liên quan đến bước chuyển hóa trình sản xuất aflatoxin tế bào nấm liệt kê Bảng 1.1 18 Gibbons J.G., Salichos L., Slot J.C., Rinker D.C., McGary K.L., King J.G., Klich M.A., Tabb D.L., McDonald W.H., Rokas A., (2012) "The evolutionary imprint of domestication on genome variation and function of the filamentous fungus Aspergillus oryzae",Current Biology, 22(15), pp 1403-1409 19 Gomi K., Iimura Y., Hara S., (1987) "Integrative transformation of Aspergillus oryzae with a plasmid containing the Aspergillus nidulansargB gene",Agricultural and Biological Chemistry, 51(9), pp 2549-2555 20 Goosen T., van Engelenburg F., Debets F., Swart K., Bos K., van den Broek H., (1989) "Tryptophan auxotrophic mutants in Aspergillus niger: inactivation of the trpC gene by cotransformation mutagenesis",Molecular and General Genetics MGG, 219(1-2), pp 282-288 21 Gordon C., Archer D., Jeenes D., Doonan J., Wells B., Trinci A., Robson G., (2000) "A glucoamylase:: GFP gene fusion to study protein secretion by individual hyphae of Aspergillus niger",Journal of Microbiological Methods, 42(1), pp 39-48 22 Grant S.G., Jessee J., Bloom F.R., Hanahan D., (1990) "Differential plasmid rescue from transgenic mouse DNAs into Escherichia coli methylationrestriction mutants",Proceedings of the National Academy of Sciences, 87(12), pp 4645-4649 23 Guo H., Yang Z., Xing L., Li M., (2011) "Transformation system of Aspergillus japonicus mediated by Agrobacterium tumefaciens",Wei Sheng Wu Xue Bao (Acta Microbiologica Sinica), 51(1), pp 115-121 24 Hamilton C.M., (1997) "A binary-BAC system for plant transformation with high-molecular-weight DNA",Gene, 200(1), pp 107-116 25 Hartl L., Seiboth B., (2005) "Sequential gene deletions in Hypocrea jecorina using a single blaster cassette",Current Genetics, 48(3), pp 204-211 26 Hedayati M., Pasqualotto A., Warn P., Bowyer P., Denning D., (2007) "Aspergillus flavus: human pathogen, allergen and mycotoxin producer",Microbiology, 153(6), pp 1677-1692 27 Hoekema A., Hirsch P., Hooykaas P., Schilperoort R., (1983) "A binary plant vector strategy based on separation of vir-and T-region of the Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid",Nature, 303(pp 179-180 28 Hooykaas P., Beijersbergen A.G., (1994) "The virulence system of Agrobacterium tumefaciens",Annual Review of Phytopathology, 32(1), pp 157-181 29 Howson S., Davis R., (1983) "Production of phytate-hydrolysing enzyme by some fungi",Enzyme and Microbial Technology, 5(5), pp 377-382 30 Iimura Y., Gomi K., Uzu H., Hara S., (1987) "Transformation of Aspergillus oryzae through plasmid-mediated complementation of the methionineauxotrophic mutation",Agricultural and Biological Chemistry, 51(2), pp 323-328 31 Imanaka H., Tanaka S., Feng B., Imamura K., Nakanishi K., (2010) "Cultivation characteristics and gene expression profiles of Aspergillus oryzae by membrane-surface liquid culture, shaking-flask culture, and agar-plate culture",Journal of Bioscience and Bioengineering, 109(3), pp 267-273 32 Janus D., Hoff B., Hofmann E., Kück U., (2007) "An efficient fungal RNAsilencing system using the DsRed reporter gene",Applied and Environmental Microbiology, 73(3), pp 962-970 33 Jawed A., L C.J., (1990) "Reporter genes: application to the study of mammalian gene transcription",Analytical Biochemistry, 188(2), pp 245254 34 Kanamasa S., Yamaoka K., Kawaguchi T., SUMITANI J.-i., ARAI M., (2003) "Transformation of Aspergillus aculeatus using the drug resistance gene of Aspergillus oryzae and the pyrG gene of Aspergillus nidulans",Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 67(12), pp 2661-2663 35 Khalaj V., Azizi M., Enayati S., Khorasanizadeh D., Ardakani E.M., (2012) "NCE102 homologue in Aspergillus fumigatus is required for normal sporulation, not hyphal growth or pathogenesis",FEMS Microbiology Letters, 329(2), pp 138-145 36 Kitamoto K., (2015) "Cell biology of the Koji mold Aspergillus oryzae",Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 79(6), pp 863-869 37 Kitamoto K., (2002) "Molecular biology of the Koji molds",Advances in Applied Microbiology, 51(pp 129-154 38 Klich M.A., Mullaney E.J., (1987) "DNA restriction enzyme fragment polymorphism as a tool for rapid differentiation of Aspergillus flavus from Aspergillus oryzae",Experimental Mycology, 11(3), pp 170-175 39 Kochupurakkal B.S., Iglehart J.D., (2013) "Nourseothricin N-acetyl transferase: a positive selection marker for mammalian cells",PLoS One, 8(7), pp e68509 40 Koo J., Kim Y., Kim J., Yeom M., Lee I.C., Nam H.G., (2007) "A GUS/luciferase fusion reporter for plant gene trapping and for assay of promoter activity with luciferin-dependent control of the reporter protein stability",Plant and Cell physiology, 48(8), pp 1121-1131 41 Kumeda Y., Asao T., (2001) "Heteroduplex Panel Analysis, a Novel Method for Genetic Identification of Aspergillus Section Flavi Strains",Applied and Environmental Microbiology, 67(9), pp 4084-4090 42 Kunitake E., Tani S., Sumitani J.-i., Kawaguchi T., (2011) "Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Aspergillus aculeatus for insertional mutagenesis",AMB Express, 1(1), pp 43 Lazo G.R., Stein P.A., Ludwig R.A., (1991) "A DNA transformation– competent Arabidopsis genomic library in Agrobacterium",Nature Biotechnology, 9(10), pp 963-967 44 Leal Jr S.M., Cowden S., Hsia Y.-C., Ghannoum M.A., Momany M., Pearlman E., (2010) "Distinct roles for Dectin-1 and TLR4 in the pathogenesis of Aspergillus fumigatus keratitis",PLoS Pathogens, 6(7), pp e1000976 45 Lee C.-Z., Liou G.-Y., Yuan G.-F., (2006) "Comparison of the aflR gene sequences of strains in Aspergillus section Flavi",Microbiology, 152(1), pp 161-170 46 Lee L.-Y., Gelvin S.B., (2008) "T-DNA binary vectors and systems",Plant Physiology, 146(2), pp 325-332 47 Levin R.E., (2012) "PCR detection of aflatoxin producing fungi and its limitations",International journal of food microbiology, 156(1), pp 1-6 48 Li C., Chen S., Zuo C., Sun Q., Ye Q., Yi G., Huang B., (2011) "The use of GFPtransformed isolates to study infection of banana with Fusarium oxysporum f sp cubense race 4",European Journal of Plant Pathology, 131(2), pp 327340 49 Ling S.O.S., Storms R., Zheng Y., Rodzi M.R.M., Mahadi N.M., Illias R.M., Abdul Murad A.M., Abu Bakar F.D., (2013) "Development of a pyrG mutant of Aspergillus oryzae strain S1 as a host for the production of heterologous proteins",The Scientific World Journal, 2013(pp 50 Liu W., Sun Y., Chen W., Liu W., Wan Z., Bu D., Li R., (2012) "The T788G mutation in the cyp51C gene confers voriconazole resistance in Aspergillus flavus causing aspergillosis",Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 56(5), pp 2598-2603 51 Liu Z., Friesen T.L., (2012) "Polyethylene glycol (PEG)-mediated transformation in filamentous fungal pathogens",Plant Fungal Pathogens: Methods and Protocols, pp 365-375 52 Lorang J., Tuori R., Martinez J., Sawyer T., Redman R., Rollins J., Wolpert T., Johnson K., Rodriguez R., Dickman M., (2001) "Green fluorescent protein is lighting up fungal biology",Applied and Environmental Microbiology, 67(5), pp 1987-1994 53 Machida M., Asai K., Sano M., Tanaka T., Kumagai T., Terai G., Kusumoto K.I., Arima T., Akita O., Kashiwagi Y., (2005) "Genome sequencing and analysis of Aspergillus oryzae",Nature, 438(7071), pp 1157-1161 54 Machida M., Yamada O., Gomi K., (2008) "Genomics of Aspergillus oryzae: learning from the history of Koji mold and exploration of its future",DNA Research, 15(4), pp 173-183 55 Maruyama J.-I., Kitamoto K., (2008) "Multiple gene disruptions by marker recycling with highly efficient gene-targeting background (ΔligD) in Aspergillus oryzae",Biotechnology Letters, 30(10), pp 1811-1817 56 Maruyama J.-i., Nakajima H., Kitamoto K., (2001) "Visualization of nuclei in Aspergillus oryzae with EGFP and analysis of the number of nuclei in each conidium by FACS",Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 65(7), pp 1504-1510 57 Mathur J., Koncz C., (1998) "PEG-mediated protoplast transformation with naked DNA",Arabidopsis Protocols, pp 267-276 58 Mattern I.E., Unkles S., Kinghorn J.R., Pouwels P.H., van den Hondel C.A., (1987) "Transformation of Aspergillus oryzae using the A niger pyrG gene",Molecular and General Genetics MGG, 210(3), pp 460-461 59 Mattern I.E., Unkles S., Kinghorn J.R., Pouwels P.H., van den Hondel C.A., (1987) "Transformation of Aspergillus oryzae using the A niger pyrG gene",Molecular and General Genetics, 210(3), pp 460-461 60 Meyer V., (2008) "Genetic engineering of filamentous fungi—progress, obstacles and future trends",Biotechnology Advances, 26(2), pp 177-185 61 Michielse C., Ram A., Hooykaas P., Van den Hondel C., (2004) "Role of bacterial virulence proteins in Agrobacterium-mediated transformation of Aspergillus awamori",Fungal Genetics and Biology, 41(5), pp 571-578 62 Michielse C.B., Hooykaas P.J., van den Hondel C.A., Ram A.F., (2008) "Agrobacterium-mediated transformation of the filamentous fungus Aspergillus awamori",Nature Protocols, 3(10), pp 1671-1678 63 Michielse C.B., Hooykaas P.J., van den Hondel C.A., Ram A.F., (2005) "Agrobacterium-mediated transformation as a tool for functional genomics in fungi",Current Genetics, 48(1), pp 1-17 64 Mikkelsen L., Sarrocco S., Lübeck M., Jensen D.F., (2003) "Expression of the red fluorescent protein DsRed-Express in filamentous ascomycete fungi",FEMS Microbiology Letters, 223(1), pp 135-139 65 Mizutani O., Kudo Y., Saito A., Matsuura T., Inoue H., Abe K., Gomi K., (2008) "A defect of LigD (human Lig4 homolog) for nonhomologous end joining significantly improves efficiency of gene-targeting oryzae",Fungal Genetics and Biology, 45(6), pp 878-889 in Aspergillus 66 Montiel D., Dickinson M.J., JEENES D.J., ROBERTS I.N., JAMES S., FULLER L.J., MATSUCHIMA K., ARCHER D.B., (2003) "Genetic differentiation of the Aspergillus section Flavi complex using AFLP fingerprints",Mycological Research, 107(12), pp 1427-1434 67 Mora-Lugo R., Zimmermann J., Rizk A.M., Fernandez-Lahore M., (2014) "Development of a transformation system for Aspergillus sojae based on the Agrobacterium tumefaciens-mediated approach",BMC Microbiology, 14(1), pp 68 Mullins E.D., Chen X., Romaine P., Raina R., Geiser D., Kang S., (2001) "Agrobacterium-mediated transformation of Fusarium oxysporum: an efficient tool for insertional mutagenesis and gene transfer",Phytopathology, 91(2), pp 173-180 69 Murphy M., Wilson Y.M., Butler C., (2013) "Genetic Marker Mice and Their Use in Understanding Learning and Memory",World's largest Science, Technology & Medicine, Open Access book publisher, pp 70 Nahalkova J., Fatehi J., (2003) "Red fluorescent protein (DsRed2) as a novel reporter in Fusarium oxysporum f sp lycopersici",FEMS Microbiology Letters, 225(2), pp 305-309 71 Nguyen K.T., Ho Q.N., Pham T.H., Phan T.-N., Tran V.-T., (2016) "The construction and use of versatile binary vectors carrying pyrG auxotrophic marker and fluorescent reporter genes for Agrobacterium-mediated transformation of Aspergillus oryzae",World Journal of Microbiology and Biotechnology, 32(12), pp 204 72 Nordgren I.K., Tavassoli A., (2014) "A bidirectional fluorescent two-hybrid system for monitoring protein–protein interactions",Molecular BioSystems, 10(3), pp 485-490 73 Oakley B.R., Rinehart J.E., Mitchell B.L., Oakley C.E., Cannona C., Gray G.L., May G.S., (1987) "Cloning, mapping and molecular analysis of the pyrG (orotidine-5'-phosphate decarboxylase) gene of Aspergillus nidulans",Gene, 61(3), pp 385-399 74 Park S., Lee B.-M., Salas M., Srivatanakul M., Smith R., (2000) "Shorter TDNA or additional virulence genes improve Agrobactrium-mediated transformation",Theoretical and Applied Genetics, 101(7), pp 1015-1020 75 Pasamontes L., Haiker M., Wyss M., Tessier M., Van Loon A., (1997) "Gene cloning, purification, and characterization of a heat-stable phytase from the fungus Aspergillus fumigatus",Applied and Environmental Microbiology, 63(5), pp 1696-1700 76 Pittengbr R., WOLFE E., Hoehn M., MARKS P.N., Daily W., McGuire J., (1953) "Hygromycin I Preliminary studies on the production and biologic activity of a new antibiotic",Antibiotics & Chemotherapy, 3(12), pp 1268-78 77 Pöggeler S., Masloff S., Hoff B., Mayrhofer S., Kück U., (2003) "Versatile EGFP reporter plasmids for cellular localization of recombinant gene products in filamentous fungi",Current Genetics, 43(1), pp 54-61 78 Prendergast F.G., Mann K.G., (1978) "Chemical and physical properties of aequorin and the green fluorescent protein isolated from Aequorea forskalea",Biochemistry, 17(17), pp 3448-3453 79 Punt P.J., van den Hondel C.A., (1992) "Transformation of filamentous fungi based on hygromycin b and phleomycin resistance markers",Methods in Enzymology, 216(pp 447-457 80 Rank C., Klejnstrup M.L., Petersen L.M., Kildgaard S., Frisvad J.C., Held Gotfredsen C., Ostenfeld Larsen T., (2012) "Comparative chemistry ofAspergillus oryzae (RIB40) and A flavus (NRRL 3357)",Metabolites, 2(1), pp 39-56 81 Rao M.B., Tanksale A.M., Ghatge M.S., Deshpande V.V., (1998) "Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases",Microbiology and Molecular Biology Reviews, 62(3), pp 597-635 82 Rodrigues F., van Hemert M., Steensma H.Y., Côrte-Real M., Le~o C.l., (2001) "Red Fluorescent Protein (DsRed) as a Reporter in Saccharomyces cerevisiae",Journal of Bacteriology, 183(12), pp 3791-3794 83 Rodrigues P., Venancio A., Kozakiewicz Z., Lima N., (2009) "A polyphasic approach to the identification of aflatoxigenic and non-aflatoxigenic strains of Aspergillus Section Flavi isolated from Portuguese almonds",Int J Food Microbiol, 129(2), pp 187-93 84 Rodriguez E., Mullaney E.J., Lei X.G., (2000) "Expression of the Aspergillus fumigatus phytase gene in Pichia pastoris and characterization of the recombinant enzyme",Biochemical and Biophysical Research Communications, 268(2), pp 373-378 85 Rokas A., Payne G., Fedorova N., Baker S., Machida M., Yu J., Georgianna D.R., Dean R.A., Bhatnagar D., Cleveland T., (2007) "What can comparative genomics tell us about species concepts in the genus Aspergillus?",Studies in Mycology, 59(pp 11-17 86 Ruiz‐Díez B., (2002) "Strategies for the transformation of filamentous fungi",Journal of Applied Microbiology, 92(2), pp 189-195 87 Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T., Molecular cloning Vol 1989: Cold spring harbor laboratory press New York 88 Séron K., Blondel M.-O., Haguenauer-Tsapis R., Volland C., (1999) "Uracilinduced down-regulation of the yeast uracil permease",Journal of Bacteriology, 181(6), pp 1793-1800 89 Shimomura O., Johnson F.H., Saiga Y., (1962) "Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea",Journal of Cellular and Comparative Physiology, 59(3), pp 223-239 90 Singh S., Braus-Stromeyer S.A., Timpner C., Tran V.T., Lohaus G., Reusche M., Knüfer J., Teichmann T., von Tiedemann A., Braus G.H., (2010) "Silencing of Vlaro2 for chorismate synthase revealed that the phytopathogen Verticillium longisporum induces the cross-pathway control in the xylem",Applied Microbiology and Biotechnology, 85(6), pp 19611976 91 Steever A.B., Wach A., PHILIPPSEN P., Pringle J.R., (1998) "Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe",Yeast, 14(pp 943-951 92 Sudini H., Srilakshmi P., Vijay Krishna Kumar K., Njoroge S.M., Osiru M., Seetha A., Waliyar F., (2015) "Detection of aflatoxigenic Aspergillus strains by cultural and molecular methods: A critical review",African Journal of Microbiology Research, 9(8), pp 484-491 93 Sugui J.A., Chang Y.C., Kwon-Chung K., (2005) "Agrobacterium tumefaciensmediated transformation of Aspergillus fumigatus: an efficient tool for insertional mutagenesis and targeted gene disruption",Applied and Environmental Microbiology, 71(4), pp 1798-1802 94 Sun X., Zhu J., Bao L., Hu C., Jin C., Harris S.D., Liu H., Li S., (2013) "pyrG is required for maintaining stable cellular uracil level and normal sporulation pattern under excess uracil stress in Aspergillus nidulans",Science China Life Sciences, 56(5), pp 467-475 95 Suzuki D.T., Griffiths A.J., Miller J.H., Lewontin R.C., An introduction to genetic analysis 1986: WH Freeman and Company 96 Suzuki S., Tada S., Fukuoka M., Taketani H., Tsukakoshi Y., Matsushita M., Oda K., Kusumoto K.-I., Kashiwagi Y., Sugiyama M., (2009) "A novel transformation system using a bleomycin resistance marker with chemosensitizers for Aspergillus oryzae",Biochemical and Biophysical Research Communications, 383(1), pp 42-47 97 Tao L., Chung S.H., (2014) "Non-Aflatoxigenicity of Commercial Aspergillus oryzae Strains Due to Genetic Defects Compared to Aflatoxigenic Aspergillus flavus",J Microbiol Biotechnol, 24(8), pp 1081-1087 98 Te Biesebeke R., Record E., Van Biezen N., Heerikhuisen M., Franken A., Punt P., Van Den Hondel C., (2005) "Branching mutants of Aspergillus oryzae with improved amylase and protease production on solid substrates",Applied Microbiology and Biotechnology, 69(1), pp 44-50 99 Te Biesebeke R., Ruijter G., Rahardjo Y.S., Hoogschagen M.J., Heerikhuisen M., Levin A., van Driel K.G., Schutyser M.A., Dijksterhuis J., Zhu Y., (2002) "Aspergillus oryzae in solid-state and submerged fermentations",FEMS Yeast Research, 2(2), pp 245-248 100 Teodoro C.E.d.S., Martins M.L.L., (2000) "Culture conditions for the production of thermostable amylase by Bacillus sp",Brazilian Journal of Microbiology, 31(4), pp 298-302 101 Toffaletti D.L., Rude T.H., Johnston S.A., Durack D., Perfect J., (1993) "Gene transfer in Cryptococcus neoformans by use of biolistic delivery of DNA",Journal of Bacteriology, 175(5), pp 1405-1411 102 Tran V.T., Braus‐Stromeyer S.A., Kusch H., Reusche M., Kaever A., Kühn A., Valerius O., Landesfeind M., Aßhauer K., Tech M., (2014) "Verticillium transcription activator of adhesion Vta2 suppresses microsclerotia formation and is required for systemic infection of plant roots",New Phytologist, 202(2), pp 565-581 103 Unkles S.E., Campbell E.I., de Ruiter-Jacobs Y.M., Broekhuijsen M., Macro J.A., Carrez D., Contreras R., van den Hondel C.A., Kinghorn J.R., (1989) "The development of a homologous transformation system for Aspergillus oryzae based on the nitrate assimilation pathway: a convenient and general selection system for filamentous fungal transformation",Molecular and General Genetics MGG, 218(1), pp 99-104 104 Van Hartingsveldt W., Mattern I.E., van Zeijl C.M., Pouwels P.H., van den Hondel C.A., (1987) "Development of a homologous transformation system for Aspergillus niger based on the pyrG gene",Molecular and General Genetics, 206(1), pp 71-75 105 Wang D., He D., Li G., Gao S., Lv H., Shan Q., Wang L., (2014) "An efficient tool for random insertional mutagenesis: Agrobacterium tumefaciensmediated transformation of the filamentous fungus Aspergillus terreus",Journal of Microbiological Methods, 98(pp 114-118 106 Ward O., (2011) "Industrial Biotechnology and Commodity Products Proteases",In Comprehensive Biotechnology, 3(pp 571-582 107 Weidner G., d'Enfert C., Koch A., Mol P.C., Brakhage A.A., (1998) "Development of a homologous transformation system for the human pathogenic fungus Aspergillus fumigatus based on the pyrG gene encoding orotidine 5′′-monophosphate decarboxylase",Current Genetics, 33(5), pp 378-385 108 Winans S.C., (1992) "Two-way chemical signaling in Agrobacteriumplant interactions",Microbiological Reviews, 56(1), pp 12-31 109 Wyss M., Pasamontes L., Friedlein A., Rémy R., Tessier M., Kronenberger A., Middendorf A., Lehmann M., Schnoebelen L., Röthlisberger U., (1999) "Biophysical characterization of fungal phytases (myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolases): molecular size, glycosylation pattern, and engineering of proteolytic resistance",Applied and Environmental Microbiology, 65(2), pp 359-366 110 Wyss M., Pasamontes L., Rémy R., Kohler J., Kusznir E., Gadient M., Müller F., van Loon A.P., (1998) "Comparison of the Thermostability Properties of Three Acid Phosphatases from Molds: Aspergillus fumigatus Phytase, A niger Phytase, and A niger pH 2.5 Acid Phosphatase",Applied and Environmental Microbiology, 64(11), pp 4446-4451 111 Xu Y., (1990) "Advances in the soy sauce industry in China",Journal of Fermentation and Bioengineering, 70(6), pp 434-439 112 Yu J., Chang P.-K., Ehrlich K.C., Cary J.W., Bhatnagar D., Cleveland T.E., Payne G.A., Linz J.E., Woloshuk C.P., Bennett J.W., (2004) "Clustered pathway genes in aflatoxin biosynthesis",Applied and Environmental Microbiology, 70(3), pp 1253-1262 113 Zambare V., (2010) "Solid state fermentation of Aspergillus oryzae for glucoamylase production on agro residues",International Journal of Life Sciences, 4(pp 16-25 114 Zelaya-Molina L.X., Ortega M.A., Dorrance A.E., (2011) "Easy and efficient protocol for oomycete DNA extraction suitable for population genetic analysis",Biotechnology Letters, 33(4), pp 715-720 115 Zhong Y., Yu H., Wang X., Lu Y., Wang T., (2011) "Towards a novel efficient T-DNA-based mutagenesis and screening system using green fluorescent protein as a vital reporter in the industrially important fungus Trichoderma reesei",Molecular Biology Reports, 38(6), pp 4145-4151 116 Zhu L., Maruyama J.-i., Kitamoto K., (2013) "Further enhanced production of heterologous proteins by double-gene disruption (ΔAosedD ΔAovps10) in a hyper-producing mutant of Aspergillus oryzae",Applied Microbiology and Biotechnology, 97(14), pp 6347-6357 51 ... cho chuyển gen. Do phát triển chủng A oryzae trợ dưỡngđể sử dụng cho chuyển gen giải pháp để cải biến di truyền biểu gen ởA oryzae Với mục đích xây dựng hệ thống chuyển genhiệu cho nấm sợi A oryzae. .. thông quavi khuẩn A tumefaciensnhằm phục vụ hướng nghiên cứu bền vững biểu enzyme/protein tái tổ hợp loài nấm này, thực đề tài Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. .. vector) sử dụng cho chuyển gen biểu gen nấm sợi A oryzae - Đánh giá hiệu hệ thống chuyển gen sử dụng gen thị huỳnh quangGFP vàDsRed - Bước đầu ứng dụng hệ thống chuyển gen tạođược để biểu gen phyA mã