Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen bằng vi khuẩn agrobacterium tumefaciens cho nấm sợi aspergillus oryzae

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC Nguyễn Thị Khuyến NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG CHUYỂN GEN BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens CHO NẤM SỢI Aspergillus oryzae LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2016 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC Nguyễn Thị Khuyến NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG CHUYỂN GEN BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens CHO NẤM SỢI Aspergillus oryzae Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Trần Văn Tuấn Hà Nội - 2016 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn thạc sĩ mình, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Trần Văn Tuấn - Bộ môn Vi sinh vật học, Trƣởng Phòng Genomic, Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên– Đại học Quốc gia Hà Nội, ngƣời tận tình bảo, hƣớng dẫn tạo điều kiện tốt cho em suốt trình học tập nghiên cứu Em xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo thành viên Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym Protein giúp đỡ, cung cấp sở vật chất tạo điều thuận lợi cho em hoàn thành tốt nghiên cứu Em vô biết ơn thầy cô Bộ môn Vi sinh vật học Khoa Sinh học – Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên nhiệt tình bảo, truyền đạt kiến thức quý báu giúp đỡ em trình học tập Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn gia đình, bạn bè em, anh chị Phòng Genomic khích lệ, giúp đỡ em suốt trình học tập sống Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 09 tháng 11 năm 2016 Học viên Nguyễn Thị Khuyến DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT AS Acetosyringone ATMT Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation bp Base pair CAM Coconut agar medium CD Czapek-Dox cDNA Complementary deoxyribonucleic acid DNA Deoxyribonucleic acid GFP Green fluorescent protein IM Induction medium (Môi trƣờng cảm ứng) ITS Internal transcribed spacer kb Kilo base pair Mb Megabase kDa Kilodalton LB Luria- Bertani Left Border PCR Polymerase chain reaction PDA Potato dextrose agar PSM Phytase-screening medium RB Right Border RNA Ribonucleic acid SDS Sodium dodecyl sulfate DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các gen liên quan trình sinh tổng hợp aflatoxin………… ….8 Bảng 2.1 Các chủng vi sinh vật dùng nghiên cứu……………… ……… 20 Bảng 2.2 Mồi PCR dùng nghiên cứu…………………………… ……… 22 DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Hình thái khuẩn lạc cấu trúc cuống sinh bào tử nấm sợi Aspergillus oryzae RIB40 Hình 1.2 Mối quan hệ phát sinh loài khác biệt hệ gen A oryzae A Flavus Hình 1.3 Vi khuẩn A tumefaciens gây khối u thực vật 11 Hình 1.4 Mô hình tổng quát hệ thống vector nhị thể cho chuyển gen 12 vào nấm thông qua vi khuẩn A Tumefaciens Hình 1.5 Biểu gen GFP nấm sợi Aspergillus fumigatus 18 Hình 1.6 Biểu gen DsRed nấm sợi Fusarium oxysporum 19 Hình 3.1 Hình thái A oryzae A flavus đĩa môi trƣờng PDA 36 dƣới kính hiển vi quang học Hình 3.2 Kiểm tra phát quang độc tố aflatoxin môi trƣờng 37 CAM chủng A flavus NRRL 3357, A oryzae RIB40 A oryzae VS1 Hình 3.3 Điện di đồ sản phẩm PCR phân tử phân biệt A oryzae với A 39 flavus Hình 3.4 Khả sinh trƣởng tiết enzyme amylase A oryzae 41 VS1 so với chủng RIB40 Hình 3.5 Kiểm tra khả mẫn cảm với kháng sinh số chủng 42 A Oryzae Hình 3.6 Sơ đồ tạo cấu trúc xóa gen pyrG nấm sợi A oryzae 44 Hình 3.7 Các bƣớc xóa gen pyrG A oryzae sử dụng phƣơng pháp 45 ATMT Hình 3.8 Kiểm tra khả sinh trƣởng chủng xóa gen 46 môi trƣờng Czapek-Dox có 5-FOA, uridine, uracil Hình 3.9 Xác nhận chủng xóa gen pyrG PCR 47 Trang Hình 3.10 Xóa gen pyrG chủng chuẩn quốc tế A oryzae RIB40 49 Hình 3.11 Ảnh hƣởng nồng độ uridine (uri) uracil (ura) đến mứcđộ 50 sinh trƣởng chủng A oryzae VS1 A oryzae VS1 xóa pyrG Hình 3.12 Tạo vector pEX1 chứa marker trợ dƣỡng pyrG gen huỳnh 52 quang xanh GFP Hình 3.13 Tạo vector pEX2 chứa marker trợ dƣỡng pyrG gen huỳnh 53 quang đỏ DsRed Hình 3.14 Tạo vector pEX3 biểu enzyme phytase 54 Hình 3.15 Quy trình chuyển gen vào A oryzae trợ dƣỡng uridine/uracil 56 sử dụng phƣơng pháp ATMT Hình 3.16 Chuyển gen thị huỳnh quang GFP DsRed vào 57 chủng A oryzae trợ dƣỡng uridine/uracil Hình 3.17 Biểu gen huỳnh quang GFP chủng A oryzae VS1 trợ 59 dƣỡng uridine/uracil Hình 3.18 Biểu gen huỳnh quang GFP chủng A oryzae AUT1- 60 PlD trợ dƣỡng uridine/uracil Hình 3.19 Chuyển gen vào chủng A oryzae VS1 trợ dƣỡng uridine/uracil 61 Hình 3.20 Biểu gen DsRed chủng AUT1-PlD trợ dƣỡng 63 uridine/uracil Hình 3.21 Biểu gen phyA nấm sợi A oryzae trợ dƣỡng 65 uridine/uracil Hình 3.22 Khả phân giải phytate số chủng chuyển gen 66 môi trƣờng PSM Hình 3.23 Xác nhận chủng chuyển gen phyA PCR 67 MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU .1 Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung nấm sợi Aspergillus oryzae 1.1.1 Đặc điểm sinh học nấm sợi Aspergillus oryzae 1.1.2 Đặc điểm di truyền nấm sợi A oryzae 1.1.3 Vai trò nấm sợi A oryzae 1.1.4 Phân biệt Aspergillus oryzae với Aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin 1.2 Các phƣơng pháp chuyển gen vào nấm sợi 1.2.1 Phƣơng pháp chuyển gen sử dụng tế bào trần (protoplast) 1.2.2 Kỹ thuật chuyển gen xung điện (electroporation) 10 1.2.3 Phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens (ATMT) 10 1.2.4 Marker sử dụng chọn lọc chủng chuyển gen 14 1.2.5 Một số gen thị dùng chuyển gen vi nấm 17 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 20 2.1 Nguyên liệu .20 2.1.1 Chủng vi sinh vật 20 2.1.2 Thiết bị hóa chất 22 2.1.3 Môi trƣờng sử dụng nghiên cứu 25 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 26 2.2.1 Thu nhận bào tử nấm 26 2.2.2 Tách chiết DNA, RNA tổng hợp cDNA 27 2.2.3 Quan sát hình thái kiểm tra số đặc điểm sinh lý sinh hóa 28 2.2.4 Phân biệt A oryzae A Flavus kỹ thuật sinh học phân tử 29 2.2.5 Tạo vector nhị thể dùng cho chuyển gen 30 2.2.6 Chuyển gen vào nấm sợi A oryzae 33 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .36 3.1 Xác nhận chủng A oryzae an toàn để sử dụng cho chuyển gen .36 3.1.1 Phân biệt chủng A oryzae an toàn chủng Aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin 36 3.1.2 Lựa chọn chủng A oryzae phục vụ cho chuyển gen 40 3.2 Lựa chọn marker chuyển gen vào A oryzae 41 3.3 Xây dựng hệ thống chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens 43 3.3.1 Xóa gen pyrG để tạo chủng đột biến trợ dƣỡng uridine/uracil 43 3.3.2 Tạo số vector nhị thể dùng cho chuyển gen vào A oryzae trợ dƣỡng uridine/uracil 50 3.4 Đánh giá hiệu hệ thống chuyển gen với gen huỳnh quang GFP DsRed .54 3.4.1 Chuyển gen GFP DsRed vào nấm sợi A oryzae trợ dƣỡng uridine/uracil 54 3.4.2 Xác nhận thể chuyển gen 57 3.5 Ứng dụng hệ thống chuyển gen thiết lập để biểu gen phyA mã hóa enzyme phytase A fumigatus A oryzae .63 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 68 MỞ ĐẦU Aspergillus oryzae loài nấm sợi đƣợc sử dụng rộng rãi sản xuất thực phẩm truyền thống đồ uống nhiều nƣớc châu Á bao gồm Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc, Việt Nam, Thái Lan, Malaysia Philippines Loài nấm đƣợc Cục Quản lý Thực phẩm Dƣợc phẩm Hoa Kỳ (FDA) công nhận an toàn (GRAS) Ở Việt Nam, A oryzae đƣợc sử dụng để sản xuất tƣơng truyền thống số địa phƣơng tỉnh phía Bắc A oryzae có khả tiết lƣợng lớn enzyme khác vào môi trƣờng Do đó, loài nấm đƣợc sử dụng nhƣ nhà máy tế bào để sản xuất thƣơng mại nhiều loại enzyme protein dạng tự nhiên tái tổ hợp Gần chủng A oryzae RIB40 dùng sản xuất công nghiệp Nhật Bản đƣợc giải trình tự toàn hệ gen Sự hiểu biết tƣờng tận hệ gen A oryzae mở nhiều hội cải biến di truyền biểu gen loài nấm sợi an toàn Hiện nay, hai phƣơng pháp phổ biến chuyển gen vào nấm sợi chuyển gen qua tế bào trần chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Tuy nhiên việc chuyển gen vào nấm sợi A oryzae sử dụng phƣơng pháp chuyển gen qua tế bào trần Phƣơng pháp tƣơng đối phức tạp tốn kém, khó thực điều kiện phòng thí nghiệm Việt Nam Phƣơng pháp chuyển gen sử dụng vi khuẩn A tumefaciens đơn giản với chi phí hợp lý Tuy nhiên chƣa có nghiên cứu báo cáo việc chuyển gen thành công nấm sợi A oryzae Bên cạnh đó, A oryzae có khả kháng lại hầu hết hợp chất kháng sinh thƣờng đƣợc sử dụng cho chuyển gen Do phát triển chủng A oryzae trợ dƣỡng để sử dụng cho chuyển gen giải pháp để cải biến di truyền nhƣ biểu gen A oryzae Với mục đích xây dựng hệ thống chuyển gen hiệu cho nấm sợi A oryzae thông qua vi khuẩn A tumefaciens nhằm phục vụ hƣớng nghiên cứu bền vững biểu enzyme/protein tái tổ hợp loài nấm này, thực đề tài TÀI LIỆU THAM KHẢO Aluko R., McIntosh T., (2005) "Limited enzymatic proteolysis increases the level of incorporation of canola proteins into mayonnaise", Innovative Food Science & Emerging Technologies, 6(2), pp 195-202 Archer D.B., Dyer P.S., (2004) "From genomics to post-genomics in Aspergillus", Current Opinion in Microbiology, 7(5), pp 499-504 Baird G.S., Zacharias D.A., Tsien R.Y., (2000) "Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral", Proceedings of the National Academy of Sciences, 97(22), pp 11984-11989 Bhumiratana A., Flegel T., Glinsukon T., Somporan W., (1980) "Isolation and analysis of molds from soy sauce koji in Thailand", Applied and Environmental Microbiology, 39(2), pp 430-435 Breakspear A., Langford K.J., Momany M., Assinder S.J., (2007) "CopA: GFP localizes to putative Golgi equivalents in Aspergillus nidulans", FEMS Microbiology Letters, 277(1), pp 90-97 Chakraborty B., Electroporation Mediated DNA Transformation of Filamentous Fungi, in Genetic Transformation Systems in Fungi, Volume 2015, Springer p 67-79 Chakraborty B., Kapoor M., (1990) "Transformation of filamentous fungi by electroporation", Nucleic Acids Research, 18(22), pp 6737 Chang P.-K., Ehrlich K.C., (2010) "What does genetic diversity of Aspergillus flavus tell us about Aspergillus oryzae?", International Journal of Food Microbiology, 138(3), pp 189-199 Chankova S., Dimova E., Dimitrova M., Bryant P., (2007) "Induction of DNA double-strand breaks by zeocin in Chlamydomonas reinhardtii and the role of increased DNA double-strand breaks rejoining in the formation of an adaptive response", Radiation and Environmental Biophysics, 46(4), pp 409-416 68 10 Chiba T., Takahashi Y., Sadamasu K., Nakama A., Kai A., (2013) "Discrimination of Aspergillus flavus group fungi using phylogenetic tree analysis and multiplex PCR", Shokuhin eiseigaku zasshi (Journal of the Food Hygienic Society of Japan), 55(3), pp 135-141 11 de Boer P., Bronkhof J., Dukiќ K., Kerkman R., Touw H., van den Berg M., Offringa R., (2013) "Efficient gene targeting in Penicillium chrysogenum using novel Agrobacterium-mediated transformation approaches", Fungal Genetics and Biology, 61(pp 9-14 12 De Groot M.J., Bundock P., Hooykaas P.J., Beijersbergen A., (1998) "Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi", Nature Biotechnology, 16(pp 13 Diez B., Alvarez E., Cantoral J., Barredo J., Martin J., (1987) "Selection and characterization of pyrG mutants of Penicillium chrysogenum lacking orotidine5′-phosphate decarboxylase and complementation by the pyr4 gene of Neurospora crassaa", Current Genetics, 12(4), pp 277-282 14 Du Y., Xie G., Yang C., Fang B., Chen H., (2014) "Construction of brewingwine Aspergillus oryzae pyrG− mutant by pyrG gene deletion and its application in homology transformation", Acta Biochimica et Biophysica Sinica, pp gmu022 15 Elleuche S., Pöggeler S., (2008) "Visualization of peroxisomes via SKL-tagged DsRed protein in Sordaria macrospora", pp 16 Fujita J., Shigeta S., Yamane Y.-I., Fukuda H., Kizaki Y., Wakabayashi S., Ono K., (2003) "Production of two types of phytase from Aspergillus oryzae during industrial koji making", Journal of Bioscience and Bioengineering, 95(5), pp 460-465 17 Geiser D.M., Dorner J.W., Horn B.W., Taylor J.W., (2000) "The phylogenetics of mycotoxin and sclerotium production in Aspergillus flavus and Aspergillus oryzae", Fungal Genetics and Biology, 31(3), pp 169-179 69 18 Gibbons J.G., Salichos L., Slot J.C., Rinker D.C., McGary K.L., King J.G., Klich M.A., Tabb D.L., McDonald W.H., Rokas A., (2012) "The evolutionary imprint of domestication on genome variation and function of the filamentous fungus Aspergillus oryzae", Current Biology, 22(15), pp 1403-1409 19 Gomi K., Iimura Y., Hara S., (1987) "Integrative transformation of Aspergillus oryzae with a plasmid containing the Aspergillus nidulans argB gene", Agricultural and Biological Chemistry, 51(9), pp 2549-2555 20 Goosen T., van Engelenburg F., Debets F., Swart K., Bos K., van den Broek H., (1989) "Tryptophan auxotrophic mutants in Aspergillus niger: inactivation of the trpC gene by cotransformation mutagenesis", Molecular and General Genetics MGG, 219(1-2), pp 282-288 21 Gordon C., Archer D., Jeenes D., Doonan J., Wells B., Trinci A., Robson G., (2000) "A glucoamylase:: GFP gene fusion to study protein secretion by individual hyphae of Aspergillus niger", Journal of Microbiological Methods, 42(1), pp 39-48 22 Grant S.G., Jessee J., Bloom F.R., Hanahan D., (1990) "Differential plasmid rescue from transgenic mouse DNAs into Escherichia coli methylationrestriction mutants", Proceedings of the National Academy of Sciences, 87(12), pp 4645-4649 23 Guo H., Yang Z., Xing L., Li M., (2011) "Transformation system of Aspergillus japonicus mediated by Agrobacterium tumefaciens", Wei Sheng Wu Xue Bao (Acta Microbiologica Sinica), 51(1), pp 115-121 24 Hamilton C.M., (1997) "A binary-BAC system for plant transformation with high-molecular-weight DNA", Gene, 200(1), pp 107-116 25 Hartl L., Seiboth B., (2005) "Sequential gene deletions in Hypocrea jecorina using a single blaster cassette", Current Genetics, 48(3), pp 204-211 26 Hedayati M., Pasqualotto A., Warn P., Bowyer P., Denning D., (2007) "Aspergillus flavus: human pathogen, allergen and mycotoxin producer", Microbiology, 153(6), pp 1677-1692 70 27 Hoekema A., Hirsch P., Hooykaas P., Schilperoort R., (1983) "A binary plant vector strategy based on separation of vir-and T-region of the Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid", Nature, 303(pp 179-180 28 Hooykaas P., Beijersbergen A.G., (1994) "The virulence system of Agrobacterium tumefaciens", Annual Review of Phytopathology, 32(1), pp 157181 29 Howson S., Davis R., (1983) "Production of phytate-hydrolysing enzyme by some fungi", Enzyme and Microbial Technology, 5(5), pp 377-382 30 Iimura Y., Gomi K., Uzu H., Hara S., (1987) "Transformation of Aspergillus oryzae through plasmid-mediated complementation of the methionineauxotrophic mutation", Agricultural and Biological Chemistry, 51(2), pp 323328 31 Imanaka H., Tanaka S., Feng B., Imamura K., Nakanishi K., (2010) "Cultivation characteristics and gene expression profiles of Aspergillus oryzae by membrane-surface liquid culture, shaking-flask culture, and agar-plate culture", Journal of Bioscience and Bioengineering, 109(3), pp 267-273 32 Janus D., Hoff B., Hofmann E., Kück U., (2007) "An efficient fungal RNAsilencing system using the DsRed reporter gene", Applied and Environmental Microbiology, 73(3), pp 962-970 33 Jawed A., L C.J., (1990) "Reporter genes: application to the study of mammalian gene transcription", Analytical Biochemistry, 188(2), pp 245-254 34 Kanamasa S., Yamaoka K., Kawaguchi T., SUMITANI J.-i., ARAI M., (2003) "Transformation of Aspergillus aculeatus using the drug resistance gene of Aspergillus oryzae and the pyrG gene of Aspergillus nidulans", Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 67(12), pp 2661-2663 35 Khalaj V., Azizi M., Enayati S., Khorasanizadeh D., Ardakani E.M., (2012) "NCE102 homologue in Aspergillus fumigatus is required for normal sporulation, not hyphal growth or pathogenesis", FEMS Microbiology Letters, 329(2), pp 138-145 71 36 Kitamoto K., (2015) "Cell biology of the Koji mold Aspergillus oryzae", Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 79(6), pp 863-869 37 Kitamoto K., (2002) "Molecular biology of the Koji molds", Advances in Applied Microbiology, 51(pp 129-154 38 Klich M.A., Mullaney E.J., (1987) "DNA restriction enzyme fragment polymorphism as a tool for rapid differentiation of Aspergillus flavus from Aspergillus oryzae", Experimental Mycology, 11(3), pp 170-175 39 Kochupurakkal B.S., Iglehart J.D., (2013) "Nourseothricin N-acetyl transferase: a positive selection marker for mammalian cells", PLoS One, 8(7), pp e68509 40 Koo J., Kim Y., Kim J., Yeom M., Lee I.C., Nam H.G., (2007) "A GUS/luciferase fusion reporter for plant gene trapping and for assay of promoter activity with luciferin-dependent control of the reporter protein stability", Plant and Cell physiology, 48(8), pp 1121-1131 41 Kumeda Y., Asao T., (2001) "Heteroduplex Panel Analysis, a Novel Method for Genetic Identification of Aspergillus Section Flavi Strains", Applied and Environmental Microbiology, 67(9), pp 4084-4090 42 Kunitake E., Tani S., Sumitani J.-i., Kawaguchi T., (2011) "Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Aspergillus aculeatus for insertional mutagenesis", AMB Express, 1(1), pp 43 Lazo G.R., Stein P.A., Ludwig R.A., (1991) "A DNA transformation– competent Arabidopsis genomic library in Agrobacterium", Nature Biotechnology, 9(10), pp 963-967 44 Leal Jr S.M., Cowden S., Hsia Y.-C., Ghannoum M.A., Momany M., Pearlman E., (2010) "Distinct roles for Dectin-1 and TLR4 in the pathogenesis of Aspergillus fumigatus keratitis", PLoS Pathogens, 6(7), pp e1000976 45 Lee C.-Z., Liou G.-Y., Yuan G.-F., (2006) "Comparison of the aflR gene sequences of strains in Aspergillus section Flavi", Microbiology, 152(1), pp 161-170 72 46 Lee L.-Y., Gelvin S.B., (2008) "T-DNA binary vectors and systems", Plant Physiology, 146(2), pp 325-332 47 Levin R.E., (2012) "PCR detection of aflatoxin producing fungi and its limitations", International journal of food microbiology, 156(1), pp 1-6 48 Li C., Chen S., Zuo C., Sun Q., Ye Q., Yi G., Huang B., (2011) "The use of GFP-transformed isolates to study infection of banana with Fusarium oxysporum f sp cubense race 4", European Journal of Plant Pathology, 131(2), pp 327-340 49 Ling S.O.S., Storms R., Zheng Y., Rodzi M.R.M., Mahadi N.M., Illias R.M., Abdul Murad A.M., Abu Bakar F.D., (2013) "Development of a pyrG mutant of Aspergillus oryzae strain S1 as a host for the production of heterologous proteins", The Scientific World Journal, 2013(pp 50 Liu W., Sun Y., Chen W., Liu W., Wan Z., Bu D., Li R., (2012) "The T788G mutation in the cyp51C gene confers voriconazole resistance in Aspergillus flavus causing aspergillosis", Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 56(5), pp 2598-2603 51 Liu Z., Friesen T.L., (2012) "Polyethylene glycol (PEG)-mediated transformation in filamentous fungal pathogens", Plant Fungal Pathogens: Methods and Protocols, pp 365-375 52 Lorang J., Tuori R., Martinez J., Sawyer T., Redman R., Rollins J., Wolpert T., Johnson K., Rodriguez R., Dickman M., (2001) "Green fluorescent protein is lighting up fungal biology", Applied and Environmental Microbiology, 67(5), pp 1987-1994 53 Machida M., Asai K., Sano M., Tanaka T., Kumagai T., Terai G., Kusumoto K.-I., Arima T., Akita O., Kashiwagi Y., (2005) "Genome sequencing and analysis of Aspergillus oryzae", Nature, 438(7071), pp 1157-1161 54 Machida M., Yamada O., Gomi K., (2008) "Genomics of Aspergillus oryzae: learning from the history of Koji mold and exploration of its future", DNA Research, 15(4), pp 173-183 73 55 Maruyama J.-I., Kitamoto K., (2008) "Multiple gene disruptions by marker recycling with highly efficient gene-targeting background (ΔligD) in Aspergillus oryzae", Biotechnology Letters, 30(10), pp 1811-1817 56 Maruyama J.-i., Nakajima H., Kitamoto K., (2001) "Visualization of nuclei in Aspergillus oryzae with EGFP and analysis of the number of nuclei in each conidium by FACS", Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 65(7), pp 1504-1510 57 Mathur J., Koncz C., (1998) "PEG-mediated protoplast transformation with naked DNA", Arabidopsis Protocols, pp 267-276 58 Mattern I.E., Unkles S., Kinghorn J.R., Pouwels P.H., van den Hondel C.A., (1987) "Transformation of Aspergillus oryzae using the A niger pyrG gene", Molecular and General Genetics MGG, 210(3), pp 460-461 59 Mattern I.E., Unkles S., Kinghorn J.R., Pouwels P.H., van den Hondel C.A., (1987) "Transformation of Aspergillus oryzae using the A niger pyrG gene", Molecular and General Genetics, 210(3), pp 460-461 60 Meyer V., (2008) "Genetic engineering of filamentous fungi—progress, obstacles and future trends", Biotechnology Advances, 26(2), pp 177-185 61 Michielse C., Ram A., Hooykaas P., Van den Hondel C., (2004) "Role of bacterial virulence proteins in Agrobacterium-mediated transformation of Aspergillus awamori", Fungal Genetics and Biology, 41(5), pp 571-578 62 Michielse C.B., Hooykaas P.J., van den Hondel C.A., Ram A.F., (2008) "Agrobacterium-mediated transformation of the filamentous fungus Aspergillus awamori", Nature Protocols, 3(10), pp 1671-1678 63 Michielse C.B., Hooykaas P.J., van den Hondel C.A., Ram A.F., (2005) "Agrobacterium-mediated transformation as a tool for functional genomics in fungi", Current Genetics, 48(1), pp 1-17 64 Mikkelsen L., Sarrocco S., Lübeck M., Jensen D.F., (2003) "Expression of the red fluorescent protein DsRed-Express in filamentous ascomycete fungi", FEMS Microbiology Letters, 223(1), pp 135-139 74 65 Mizutani O., Kudo Y., Saito A., Matsuura T., Inoue H., Abe K., Gomi K., (2008) "A defect of LigD (human Lig4 homolog) for nonhomologous end joining significantly improves efficiency of gene-targeting in Aspergillus oryzae", Fungal Genetics and Biology, 45(6), pp 878-889 66 Montiel D., Dickinson M.J., JEENES D.J., ROBERTS I.N., JAMES S., FULLER L.J., MATSUCHIMA K., ARCHER D.B., (2003) "Genetic differentiation of the Aspergillus section Flavi complex using AFLP fingerprints", Mycological Research, 107(12), pp 1427-1434 67 Mora-Lugo R., Zimmermann J., Rizk A.M., Fernandez-Lahore M., (2014) "Development of a transformation system for Aspergillus sojae based on the Agrobacterium tumefaciens-mediated approach", BMC Microbiology, 14(1), pp 68 Mullins E.D., Chen X., Romaine P., Raina R., Geiser D., Kang S., (2001) "Agrobacterium-mediated transformation of Fusarium oxysporum: an efficient tool for insertional mutagenesis and gene transfer", Phytopathology, 91(2), pp 173-180 69 Murphy M., Wilson Y.M., Butler C., (2013) "Genetic Marker Mice and Their Use in Understanding Learning and Memory", World's largest Science, Technology & Medicine, Open Access book publisher, pp 70 Nahalkova J., Fatehi J., (2003) "Red fluorescent protein (DsRed2) as a novel reporter in Fusarium oxysporum f sp lycopersici", FEMS Microbiology Letters, 225(2), pp 305-309 71 Nguyen K.T., Ho Q.N., Pham T.H., Phan T.-N., Tran V.-T., (2016) "The construction and use of versatile binary vectors carrying pyrG auxotrophic marker and fluorescent reporter genes for Agrobacterium-mediated transformation of Aspergillus oryzae", World Journal of Microbiology and Biotechnology, 32(12), pp 204 75 72 Nordgren I.K., Tavassoli A., (2014) "A bidirectional fluorescent two-hybrid system for monitoring protein–protein interactions", Molecular BioSystems, 10(3), pp 485-490 73 Oakley B.R., Rinehart J.E., Mitchell B.L., Oakley C.E., Cannona C., Gray G.L., May G.S., (1987) "Cloning, mapping and molecular analysis of the pyrG (orotidine-5'-phosphate decarboxylase) gene of Aspergillus nidulans", Gene, 61(3), pp 385-399 74 Park S., Lee B.-M., Salas M., Srivatanakul M., Smith R., (2000) "Shorter TDNA or additional virulence genes improve Agrobactrium-mediated transformation", Theoretical and Applied Genetics, 101(7), pp 1015-1020 75 Pasamontes L., Haiker M., Wyss M., Tessier M., Van Loon A., (1997) "Gene cloning, purification, and characterization of a heat-stable phytase from the fungus Aspergillus fumigatus", Applied and Environmental Microbiology, 63(5), pp 1696-1700 76 Pittengbr R., WOLFE E., Hoehn M., MARKS P.N., Daily W., McGuire J., (1953) "Hygromycin I Preliminary studies on the production and biologic activity of a new antibiotic", Antibiotics & Chemotherapy, 3(12), pp 1268-78 77 Pöggeler S., Masloff S., Hoff B., Mayrhofer S., Kück U., (2003) "Versatile EGFP reporter plasmids for cellular localization of recombinant gene products in filamentous fungi", Current Genetics, 43(1), pp 54-61 78 Prendergast F.G., Mann K.G., (1978) "Chemical and physical properties of aequorin and the green fluorescent protein isolated from Aequorea forskalea", Biochemistry, 17(17), pp 3448-3453 79 Punt P.J., van den Hondel C.A., (1992) "Transformation of filamentous fungi based on hygromycin b and phleomycin resistance markers", Methods in Enzymology, 216(pp 447-457 80 Rank C., Klejnstrup M.L., Petersen L.M., Kildgaard S., Frisvad J.C., Held Gotfredsen C., Ostenfeld Larsen T., (2012) "Comparative chemistry of 76 Aspergillus oryzae (RIB40) and A flavus (NRRL 3357)", Metabolites, 2(1), pp 39-56 81 Rao M.B., Tanksale A.M., Ghatge M.S., Deshpande V.V., (1998) "Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases", Microbiology and Molecular Biology Reviews, 62(3), pp 597-635 82 Rodrigues F., van Hemert M., Steensma H.Y., Côrte-Real M., Leão C.l., (2001) "Red Fluorescent Protein (DsRed) as a Reporter in Saccharomyces cerevisiae", Journal of Bacteriology, 183(12), pp 3791-3794 83 Rodrigues P., Venancio A., Kozakiewicz Z., Lima N., (2009) "A polyphasic approach to the identification of aflatoxigenic and non-aflatoxigenic strains of Aspergillus Section Flavi isolated from Portuguese almonds", Int J Food Microbiol, 129(2), pp 187-93 84 Rodriguez E., Mullaney E.J., Lei X.G., (2000) "Expression of the Aspergillus fumigatus phytase gene in Pichia pastoris and characterization of the recombinant enzyme", Biochemical and Biophysical Research Communications, 268(2), pp 373-378 85 Rokas A., Payne G., Fedorova N., Baker S., Machida M., Yu J., Georgianna D.R., Dean R.A., Bhatnagar D., Cleveland T., (2007) "What can comparative genomics tell us about species concepts in the genus Aspergillus?", Studies in Mycology, 59(pp 11-17 86 Ruiz‐Díez B., (2002) "Strategies for the transformation of filamentous fungi", Journal of Applied Microbiology, 92(2), pp 189-195 87 Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T., Molecular cloning Vol 1989: Cold spring harbor laboratory press New York 88 Séron K., Blondel M.-O., Haguenauer-Tsapis R., Volland C., (1999) "Uracilinduced down-regulation of the yeast uracil permease", Journal of Bacteriology, 181(6), pp 1793-1800 89 Shimomura O., Johnson F.H., Saiga Y., (1962) "Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous 77 hydromedusan, Aequorea", Journal of Cellular and Comparative Physiology, 59(3), pp 223-239 90 Singh S., Braus-Stromeyer S.A., Timpner C., Tran V.T., Lohaus G., Reusche M., Knüfer J., Teichmann T., von Tiedemann A., Braus G.H., (2010) "Silencing of Vlaro2 for chorismate synthase revealed that the phytopathogen Verticillium longisporum induces the cross-pathway control in the xylem", Applied Microbiology and Biotechnology, 85(6), pp 1961-1976 91 Steever A.B., Wach A., PHILIPPSEN P., Pringle J.R., (1998) "Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe", Yeast, 14(pp 943-951 92 Sudini H., Srilakshmi P., Vijay Krishna Kumar K., Njoroge S.M., Osiru M., Seetha A., Waliyar F., (2015) "Detection of aflatoxigenic Aspergillus strains by cultural and molecular methods: A critical review", African Journal of Microbiology Research, 9(8), pp 484-491 93 Sugui J.A., Chang Y.C., Kwon-Chung K., (2005) "Agrobacterium tumefaciensmediated transformation of Aspergillus fumigatus: an efficient tool for insertional mutagenesis and targeted gene disruption", Applied and Environmental Microbiology, 71(4), pp 1798-1802 94 Sun X., Zhu J., Bao L., Hu C., Jin C., Harris S.D., Liu H., Li S., (2013) "pyrG is required for maintaining stable cellular uracil level and normal sporulation pattern under excess uracil stress in Aspergillus nidulans", Science China Life Sciences, 56(5), pp 467-475 95 Suzuki D.T., Griffiths A.J., Miller J.H., Lewontin R.C., An introduction to genetic analysis 1986: WH Freeman and Company 96 Suzuki S., Tada S., Fukuoka M., Taketani H., Tsukakoshi Y., Matsushita M., Oda K., Kusumoto K.-I., Kashiwagi Y., Sugiyama M., (2009) "A novel transformation system using a bleomycin resistance marker with chemosensitizers for Aspergillus oryzae", Biochemical and Biophysical Research Communications, 383(1), pp 42-47 78 97 Tao L., Chung S.H., (2014) "Non-Aflatoxigenicity of Commercial Aspergillus oryzae Strains Due to Genetic Defects Compared to Aflatoxigenic Aspergillus flavus", J Microbiol Biotechnol, 24(8), pp 1081-1087 98 Te Biesebeke R., Record E., Van Biezen N., Heerikhuisen M., Franken A., Punt P., Van Den Hondel C., (2005) "Branching mutants of Aspergillus oryzae with improved amylase and protease production on solid substrates", Applied Microbiology and Biotechnology, 69(1), pp 44-50 99 Te Biesebeke R., Ruijter G., Rahardjo Y.S., Hoogschagen M.J., Heerikhuisen M., Levin A., van Driel K.G., Schutyser M.A., Dijksterhuis J., Zhu Y., (2002) "Aspergillus oryzae in solid-state and submerged fermentations", FEMS Yeast Research, 2(2), pp 245-248 100 Teodoro C.E.d.S., Martins M.L.L., (2000) "Culture conditions for the production of thermostable amylase by Bacillus sp", Brazilian Journal of Microbiology, 31(4), pp 298-302 101 Toffaletti D.L., Rude T.H., Johnston S.A., Durack D., Perfect J., (1993) "Gene transfer in Cryptococcus neoformans by use of biolistic delivery of DNA", Journal of Bacteriology, 175(5), pp 1405-1411 102 Tran V.T., Braus‐Stromeyer S.A., Kusch H., Reusche M., Kaever A., Kühn A., Valerius O., Landesfeind M., Aßhauer K., Tech M., (2014) "Verticillium transcription activator of adhesion Vta2 suppresses microsclerotia formation and is required for systemic infection of plant roots", New Phytologist, 202(2), pp 565-581 103 Unkles S.E., Campbell E.I., de Ruiter-Jacobs Y.M., Broekhuijsen M., Macro J.A., Carrez D., Contreras R., van den Hondel C.A., Kinghorn J.R., (1989) "The development of a homologous transformation system for Aspergillus oryzae based on the nitrate assimilation pathway: a convenient and general selection system for filamentous fungal transformation", Molecular and General Genetics MGG, 218(1), pp 99-104 79 104 Van Hartingsveldt W., Mattern I.E., van Zeijl C.M., Pouwels P.H., van den Hondel C.A., (1987) "Development of a homologous transformation system for Aspergillus niger based on the pyrG gene", Molecular and General Genetics, 206(1), pp 71-75 105 Wang D., He D., Li G., Gao S., Lv H., Shan Q., Wang L., (2014) "An efficient tool for random insertional mutagenesis: Agrobacterium tumefaciensmediated transformation of the filamentous fungus Aspergillus terreus", Journal of Microbiological Methods, 98(pp 114-118 106 Ward O., (2011) "Industrial Biotechnology and Commodity Products Proteases", In Comprehensive Biotechnology, 3(pp 571-582 107 Weidner G., d'Enfert C., Koch A., Mol P.C., Brakhage A.A., (1998) "Development of a homologous transformation system for the human pathogenic fungus Aspergillus fumigatus based on the pyrG gene encoding orotidine 5′′-monophosphate decarboxylase", Current Genetics, 33(5), pp 378385 108 Winans S.C., (1992) "Two-way chemical signaling in Agrobacterium-plant interactions", Microbiological Reviews, 56(1), pp 12-31 109 Wyss M., Pasamontes L., Friedlein A., Rémy R., Tessier M., Kronenberger A., Middendorf A., Lehmann M., Schnoebelen L., Röthlisberger U., (1999) "Biophysical characterization of fungal phytases (myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolases): molecular size, glycosylation pattern, and engineering of proteolytic resistance", Applied and Environmental Microbiology, 65(2), pp 359-366 110 Wyss M., Pasamontes L., Rémy R., Kohler J., Kusznir E., Gadient M., Müller F., van Loon A.P., (1998) "Comparison of the Thermostability Properties of Three Acid Phosphatases from Molds: Aspergillus fumigatus Phytase, A niger Phytase, and A niger pH 2.5 Acid Phosphatase", Applied and Environmental Microbiology, 64(11), pp 4446-4451 80 111 Xu Y., (1990) "Advances in the soy sauce industry in China", Journal of Fermentation and Bioengineering, 70(6), pp 434-439 112 Yu J., Chang P.-K., Ehrlich K.C., Cary J.W., Bhatnagar D., Cleveland T.E., Payne G.A., Linz J.E., Woloshuk C.P., Bennett J.W., (2004) "Clustered pathway genes in aflatoxin biosynthesis", Applied and Environmental Microbiology, 70(3), pp 1253-1262 113 Zambare V., (2010) "Solid state fermentation of Aspergillus oryzae for glucoamylase production on agro residues", International Journal of Life Sciences, 4(pp 16-25 114 Zelaya-Molina L.X., Ortega M.A., Dorrance A.E., (2011) "Easy and efficient protocol for oomycete DNA extraction suitable for population genetic analysis", Biotechnology Letters, 33(4), pp 715-720 115 Zhong Y., Yu H., Wang X., Lu Y., Wang T., (2011) "Towards a novel efficient T-DNA-based mutagenesis and screening system using green fluorescent protein as a vital reporter in the industrially important fungus Trichoderma reesei", Molecular Biology Reports, 38(6), pp 4145-4151 116 Zhu L., Maruyama J.-i., Kitamoto K., (2013) "Further enhanced production of heterologous proteins by double-gene disruption (ΔAosedD ΔAovps10) in a hyper-producing mutant of Aspergillus oryzae", Applied Microbiology and Biotechnology, 97(14), pp 6347-6357 81 PHỤ LỤC Các công trình công bố có liên quan đến luận văn Nguyễn Thị Khuyến, Võ Thị Hạnh, Phạm Thị Hiển, Mai Thị Đàm Linh, Trần Đức Long, Trần Thị Thùy Anh, Trịnh Tất Cƣờng, Trần Văn Tuấn, 2015, "Cải tiến phƣơng pháp tách chiết ADN từ nấm sợi phục vụ chẩn đoán phân tử phân biệt Aspergillus oryzae với Aspergillus flavus" Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, 31(4S), pp 167-176 Nguyen Thi Khuyen, Ho Ngoc Quynh, Pham Ha Thu, Phan Tuan Nghia, Tran Van Tuan, (2016) "The construction and use of versatile binary vectors carrying pyrG auxotrophic marker and fluorescent reporter genes for Agrobacteriummediated transformation of Aspergillus oryzae", World Journal of Microbiology and Biotechnology, 32(12), pp 204 i ... HỌC Nguyễn Thị Khuyến NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG CHUYỂN GEN BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens CHO NẤM SỢI Aspergillus oryzae Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107... dụng cho chuyển gen Do phát triển chủng A oryzae trợ dƣỡng để sử dụng cho chuyển gen giải pháp để cải biến di truyền nhƣ biểu gen A oryzae Với mục đích xây dựng hệ thống chuyển gen hiệu cho nấm sợi. .. A oryzae thông qua vi khuẩn A tumefaciens nhằm phục vụ hƣớng nghiên cứu bền vững biểu enzyme/protein tái tổ hợp loài nấm này, thực đề tài Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen vi khuẩn Agrobacterium