Nghiên cứu tăng cường khả năng chịu mặn bằng chuyển ghen Coda trên mô hình cây xoan ta ( Melia Azedarach L.)

i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THỊ HIỀN NGHIÊN CƢ́U TĂNG CƢỜNG KHẢ NĂNG CHỊ U MẶN BẰNG CHUYỂN GEN CODA TRÊN MÔ HÌ NH CÂY XOAN TA (MELIA AZEDARACH L.) Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cƣ́u luận văn là trung thƣ̣c và chƣa đƣợc sử dụng để bảo vệ một học vị nào Tác giả luận văn Nguyễn Thị Hiền Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, xin trân trọng cảm ơn PGS TS Chu Hoàng Hà– Phó Viện trƣởng Viện Công nghệ Sinh học, Trƣởng phòng Công nghệ tế bào thƣ̣c vật– Viện Công nghệ Sinh học– Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôirong t suốt quá trì nh thực hiện hoàn chỉnh luận văn Qua đây, cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới tập thể cán bộ phòng Công nghệ Tế bào thƣ̣c vật – Viện công nghệ sinh học , đã nhiệt tình giúp đỡ, góp ý và động viên thời gian thực tập phòng Tôi cũng xin đƣợc trân trọng cảm ơn Ths Bùi Văn Thắng -Trƣờng Đại học Lâm nghiệp đã có nhiều đóng góp giúp hoàn thành luận văn này Tôi xin cảm ơn sƣ̣ giúp đỡ và tạo điều kiện vô cùng quý báu của Ban Giám hiệu, các thầy các cô khoa Khoa học Sự sống , phòng Sau đại học Trƣờng Đại học khoa học – Đại học Thái Nguyên để có thể hoàn thành tốt khóa học Cuối cùng xin bày t ỏ lòng biết ơn đến nhƣ̃ng ngƣời thân gia đì nh và bạn bè , đồng nghiệp đã tạo điều kiện , quan tâm, giúp đỡ, chia sẻ, động viên và khích lệ suốt quá trình học tập , thƣ̣c hiện nghiên cƣ́u đề tài và thƣ̣c hiện thành công luận văn này Tác giả luận văn Nguyễn Thị Hiền Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iv MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cƣ́u Nội dung nghiên cƣ́u Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu Xoan ta (Melia azedarach L.) 1.1.1 Nguồn gốc và phân bố Xoan ta 1.1.2 Đặc điểm sinh học 1.1.3 Giá trị sử dụng 1.1.4 Tình hình nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học để cải tiến giống Xoan ta 1.2 Cơ chế chống chịu các điều kiện bất lợi môi trƣờng thực vật 1.2.1 Cơ chế chịu mặn thực vật 1.2.2 Vai trò glycine betain đối với tính chống chịu thực vật 12 1.2.3 Cơ chế sinh tổng hợp glycine betaine 13 1.2.4 Nguồn gốc và đặc điểm gen codA .15 1.3 Sử dụng gen codA cải tạo giống trồng 15 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .19 2.1 Vật liệu nghiên cƣ́u 19 2.1.1 Vật liệu 19 2.1.2 Hóa chất .20 2.1.3 Môi trƣờng nuôi câý 21 2.1.4 Thiết bị - Máy móc 22 2.2 Phƣơng pháp nghiên cƣ́u .22 2.2.1 Thiết kế cấu trúc vector chuyển gen pBI121 mang gen codA 22 2.2.2 Tạo chủng vi khuẩnAgrobacterium tumefaciens mang vector chuyển gen 29 2.2.3 Tạo Xoan ta chuyển gen mang gencodA 30 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .34 3.1 Kết nhân dòng gen codA từ vector tách dòng pBluesript II SK - codA .34 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn v 3.2 Kết thiết kế cấu trúc vector và tạo chủng vi khuẩn mang vector chuyển gen 35 3.2.1 Kết thiết kế cấu trúc vector chuyển gen pBI121- codA .35 3.2.2 Kết biến nạp vector tái tổ hợp (pBI121-codA) vào E coli DH5α .36 3.2.3 Kết sàng lọc dòng vi khuẩn E coli DH5α mang vector tái tổ hợp 37 3.2.4 Kết biến nạp vector chuyển gen (pBI121-codA) vào A tumefaciens .39 3.2.5 Kết sàng lọc dòng A tumefaciens mang vector chuyển gen 40 3.3 Kết tạo dòng Xoan ta mang cấu trúc gen codA .42 3.3.1 Kết chuyển gen và tái sinh chồi Xoan ta chuyển gen 42 3.3.2 Kết tạo chuyển gen hoàn chỉnh (ra rễ) 45 3.3.3 Kết quả và kiểm tra chuyển gen ngoài nhà lƣới 46 3.3.4 Kết quả đánh giá sơ bộ cácdòng Xoan ta chuyển gen môi trƣờng muối.47 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 PHỤ LỤC 57 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vi DANH MỤC CÁC CHƢ̃ VIẾT TẮT AS Acetosyrigone bp Cặp base (base pair) BAP 6-benzyl adenin purine C:I Chloroform : Isoamyl alcolhol CodA Gen mã hóa Choline oxydase DNA Deoxyribonucleic acid dNTPs Deoxynucleotide triphosphate Gus β-Glucuronidase gene = Gen mã hoá β- Glucuronidase E coli Escherichia coli EDTA Ethylene Diamin Tetra Acetate IBA Indole - butyric acid kb kilo base (1 kb = 1000 base) LB Luria – Bertani MS Murashige and Skoog OD Mật độ quang học (Optical density) PCR Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi polymerase SDS Sodium doecyl sulphate T-DNA Transfer – DNA = DNA chuyển TAE Tris base – Acetic acid – EDTA Ti-Plasmid Tumor inducing plasmid = Plasmid gây khối u thực vật TE Tris-EDTA WT Cây không chuyển gen Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Trình tự các mồi nhân gen codA .20 Bảng 2.2 Thành phần dung dịch tách plasmid .20 Bảng 2.3 Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn 21 Bảng 2.4 Môi trƣờng nuôi vàchọn lọc Xoan ta chuyển gen 21 Bảng 2.5 Thành phần các loại môi trƣờng gây nhiễm mặn nhân tạo .22 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng PCR nhân gen codA .23 Bảng 2.7 Thành phần phản ứng xƣ̉ lý enzyme giới hạn .24 Bảng 2.8 Thành phần phản ứng ghép nối gen codA với vector pBI121 26 28 Bảng 2.9 Thành phần phản ứng PCR kiểm tra plasmid Bảng 2.10.Thành phần phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn 29 Bảng 2.11 Thành phần dung dị ch tách chiết DNA .32 Bảng 2.12 Thành phần phản ứng PCR kiểm tra DNA tổng số 33 Bảng 3.1 Kết tái sinh chồi Xoan ta chuyển gen sau hai lần chọn lọc .42 Bảng 3.3 Khả chị u mặn của các dòng Xoan ta chuyển gencodA 48 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn viii DANH MỤC CÁC HÌ NH Hình 1.1 Rừng, Xoan ta trƣởng thành Hình 1.2 Dạng hoa và xoan Hình 1.3 Chu trình sinh tổng hợp GB thực vật 14 Hình 1.4 Chu trình sinh tổng hợp GB vi khuẩn E.coli 14 Hình 3.1 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen codA từ vector tách dòng 35 Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm tinh gen codA từ sản phẩm PCR 35 Hình 3.3 Hình ảnh điện di gen codA vector pBI121-gus cắt cặp enzyme giới hạn XbaI SacI 36 Hình 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm gel gen codA và vector pBI12 mở vòng 36 Hình 3.5 Hình ảnh khuẩn lạc vi khuẩn E coli DH5α đƣợc biến nạp plasmid tái tổ hợp mọc môi trƣờng LB bổ sung 50 mg/l kanamycin 37 Hình 3.6 Hình ảnh plasmid tái tổ hợp tách từ vi khuẩn E coli 38 Hình 3.7 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen codA từ plasmid tái tổ hợp 39 Hình 3.8 Hình ảnh điện di plasmid tái tổ hợp pBI121-codA cắt XbaI I 39 Hình 3.9 Khuẩn lạc Agrobacterium tumefacies EHA101 biến nạp vector pBI121-codA mọc môi trƣờng LB bổ sung 50 mg/l kanaSacmycin, 50 mg/l rifamycin 40 Hình 3.10 Hình ảnh điện di plasmid tái tổ hợp (pBI121- codA) tách chiết từ A tumefaciens 41 Hình 3.11 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân codA từ plasmid tái tổ hợp tách từ A tumefaciens 41 Hình 3.12 Mẫu Xoan ta lây nhiễm dị ch huyền phuA ̀ tumefacien 43 Hình 3.13 Mẫu Xoan ta môi trƣờng đồngnuôi cấy CCM 43 Hình 3.14 Mảnh lá chuyển gen môi trƣờng SM sau1 tuần nuôi cấy 43 Hình 3.15 Đoạn thân chuyển gen môi trƣờng SM sau tuần nuôi 43 Hình 3.16 Chồi tái sinh từ đoạn thân chuyển gen môi trƣờng SM lần sau tuần nuôi cấy 43 Hình 3.17 Chồi tái sinh từ đoạn thân chuyển gen môi trƣờng SM lần sau tuần nuôi cấy 43 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ix Hình 3.18 Chồi tái sinh từ mảnh lá chuyển gen môi trƣờng SM lần sau tuần nuôi cấy 44 Hình 3.19 Chồi tái sinh từ đoạn thân chuyển gen môi trƣờng SM lần sau tuần nuôi cấy 44 Hình 3.20 Chồi Xoan ta chuyển gen tái sinh môi trƣờng SM lần sau tuần nuôi cấy 44 Hình 3.21 Mảnh lá không chuyển gen(ĐC) môi trƣờng SM sau tuần nuôi cấy 44 Hình 3.22 Đoạn thân không chuyển gen (ĐC) môi trƣờng SM sau tuần nuôi cấy44 Hình 3.23 Hình ảnh chồi Xoan ta chuyển gen rễ môi trƣờng PSM 45 Hình 3.24 Hình ảnh chồi Xoan ta không chuyển gen (ĐC) môi trƣờng PSM 46 Hình 3.25 Hình ảnh xoan ta chuyển gen trồng nhà lƣới 46 Hình 3.26 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen codA từ DNA genome tách chiết từ Xoan ta chuyển gen và không chuyển gen 47 Hình 3.27 Đồ thị sinh trƣởng các dòng Xoan ta chuyển gen và đối chứng môi trƣờng tái sinh có các nồng độ NaCl khác 49 Hình 3.28 Sinh trƣởng dòng Xoan ta XT20 chuyển gen codA và dòng WT không chuyển gen môi trƣờng tái sinh có nồng độ NaCl khác 50 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Trên giới, nghiên cứu nâng cao tính chống chịu đối với các điều kiện bất lợi từ môi trƣờng (hạn hán, nhiễm mặn, nhiệt độ cao, nhiệt độ thấp…) đã và đƣợc tiến hành nhiều đối tƣợng trồng khác Trong lâm nghiệp, loài đƣợc sử dụng nhƣ là một loại mô hình cho nghiên cứu giới là dƣơng (Populus sp.) Tuy nhiên, hạn chế nhất loài này đó là khó sinh trƣởng điều kiện khí hậu Việt Nam Vì vậy, việc tìm kiếm một loài dễ thích ứng phổ biến để làm mô hình cho nghiên cứu theo hƣớng quan tâm đối tƣợng lâm nghiệp trở nên cần thiết Cây Xoan ta đƣợc đánh giá một trồng quan trọng chiến lƣợc phát triển lâm nghiệp nƣớc ta Hơn nữa, kết nghiên cứu bƣớc đầu việc xây dựng phƣơng pháp chuyển gen đối tƣợng xoan ta rất có triển vọng [3], [4], [8], [9], [23], [36], [37], cho phép nhà khoa học có thể tiến hành nghiên cứu cải thiện giống, đặc biệt nâng cao tính chống chịu loài có thể sử dụng nhƣ một mô hình cho loài lâm nghiệp đặc hữu Việt Nam Những tác động bất lợi từ môi trƣờng nhƣ: hạn hán, ngập mặn, ngập úng, nhiệt độ cực đoan đã tác động mạnh mẽ đến sinh trƣởng phát triển loài trồng Cũng nhƣ các loài sinh vật khác, gặp các điều kiện bất lợi từ môi trƣờng, thực vật có khả sinh các chế thích nghi khác để có thể tồn tại, sinh trƣởng phát triển bình thƣờng Cơ chế thƣờng gặp nhất gặp điều kiện bất lợi nƣớc đó là tăng cƣờng khả trì sức căng mô, tế bào thông qua việc tăng cƣờng tổng hợp chất nhƣ các loại đƣờng tan, loại acid amin,… để tăng áp suất thẩm thấu Glycine betaine proline hai số chất trao đổi đƣợc quan tâm tích lũy hàm lƣợng cao hợp chất gặp các điều kiện bất lợi từ môi trƣờng, đặc biệt yếu tố liên quan đến áp suất thẩm thấu nội bào Ở một số loài thực vật bậc cao, glycine betaine đƣợc tổng hợp thông qua một chuỗi gồm hai phản ứng từ choline đƣợc chuyển hóa thành betaine aldehyde nhờ Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read ... tiêu nghiên cƣ́u Nội dung nghiên cƣ́u Chƣơng TỔNG QUAN TA I LIỆU 1.1 Giới thiệu Xoan ta (Melia azedarach L.) 1.1.1 Nguồn gốc và phân bố Xoan ta. .. chuyển gen ( C) môi trƣờng SM sau tuần nuôi cấy44 Hình 3.23 Hình ảnh chồi Xoan ta chuyển gen rễ môi trƣờng PSM 45 Hình 3.24 Hình ảnh chồi Xoan ta không chuyển gen ( C) môi trƣờng PSM... dòng Xoan ta chuyển gen và đối chứng môi trƣờng ta i sinh có các nồng độ NaCl khác 49 Hình 3.28 Sinh trƣởng dòng Xoan ta XT20 chuyển gen codA và dòng WT không chuyển gen môi trƣờng